专利名称：与光合作用相关的dna分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与光合作用相关的DNA分子及其应用，尤其涉及一种DNA分子及 其应用。
背景技术：
植物的光合作用是指植物利用叶绿素，在可见光的照射下，将二氧化碳和水转化 为有机物，并释放出氧气的生化过程。光合作用分为光反应和暗反应两个阶段。光反应在 类囊体膜上进行，利用日光使水裂解，释放出氧气，并生成高能磷酸化合物(ATP)和还原型 辅酶II (NADPH)。暗反应在基质中进行，利用光反应形成的ATP将CO2还原为糖。最初人们 根据光合作用中碳同化途经中CO2固定的最初光合产物的不同，把高等植物分成C3植物、 C4植物和景天酸(CAM)代谢途径植物。随着对植物光合途径的深入研究，人们发现一些植 物既不属于C3植物，也不属于C4植物，故成为C3-C4中间型植物。这类植物大多具有不完 整的Kranz结构，光呼吸要低于C3植物，在叶片中存在着较高的C4途径酶活性。菊科的黄 顶菊属植株Flaveria和番杏科植物粟米草Mollug0中均发现了 C3-C4中间型植物的存在。C4植物的高光效能力与C4植物具有独特的叶片解剖结构、C4途径酶的功能和定 位有着密切的关系。在叶片解剖结构方面，C4植物具有典型的“花环结构”(Kranz)，维管 束的外侧具有一层近似环形整齐排列的叶肉细胞。C4植物叶片的维管束鞘薄壁细胞较大， 其中含有许多较大的叶绿体，叶绿体没有基粒或基粒发育不良。而C3植物的维管束鞘薄壁 细胞较小，不含或含有很少叶绿体。C4植物鞘细胞和叶肉细胞间有发达的胞间连丝，利于细 胞间频繁的物质交流。C4植物中光合酶的功能和定位与C3植物不同。C4植物进化于C3 植物，因此在C3植物中也存在着C4途径的各种关键酶，但在C3植物中表达水平较低而且 组织特异性不同。C4途径是在两种不同的细胞中完成的，在叶肉细胞中PEPC固定CO2,生 成草酰乙酸，再还原为苹果酸，并转运到维管束鞘细胞中进行脱羧，释放出的CO2经Calvin 循环进行再固定。在CO2浓缩和固定过程中涉及多种光合酶和转运器的参与，其中C4植物 中主要光合作用酶如下:PEPC蛋白(J013001G17)、PPDK蛋白(J013134L02)、NADP-ME蛋白 (J033092D06)、NADP-MDH 蛋白(001-205-B06)、PPT 蛋白(J033061B10)。C4植物是从C3植物进化来的一种高光效种类，与C3植物相比，它们具有在高光 强、高温及低CO2浓度下保持高光效的能力。因此，若在C3植物中建立类似C4光合途径， 将有可能实现改善C3植物的光合效率的目的。随着对植物C3和C4途径的深入研究以及 植物基因工程的发展，利用转基因技术在C3植物中高效表达C4光合基因已经取得了一定 的进展。许多重要的粮食作物如水稻、小麦和马铃薯及经济作物烟草等都属于C3植物，由 于光呼吸等原因，导致其光合速率一般都低于C4植物。随着世界人口的不断增多和可耕地 面积的逐渐减少，合理的利用已有C4植物资源，加大开发干旱和半干旱地区资源，并通过 对改善C3作物水稻使之具有C4植物的高光效特征，进而提高作物产量已成为了当务之急。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA分子。本发明提供的DNA分子由如下DNA片段依次连接构成DNA片段1、DNA片段2、DNA 片段3、DNA片段4和DNA片段5 ；所述DNA片段1由驱动PEPC蛋白表达的启动子、PEPC蛋白的编码基因及终止子 依次连接构成；所述DNA片段2由驱动PPDK蛋白表达的启动子、PPDK蛋白的编码基因及终止子 依次连接构成；所述DNA片段3由驱动NADP-ME蛋白表达的启动子、NADP-ME蛋白的编码基因及 终止子依次连接构成；所述DNA片段4由驱动PPT蛋白表达的启动子、PPT蛋白的编码基因及终止子依 次连接构成；所述DNA片段5由由驱动NADP-MDH蛋白表达的启动子、NADP-MDH蛋白的编码基 因及终止子依次连接构成。所述DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5中的各启动子 相同或者不同；所述DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5中的各终 止子相同或者不同。所述DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5中的各启动子 相同，所述各启动子均为CaMV35S ；所述DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5中的各终止子 相同，所述各终止子均为T-nos。所述DNA分子为序列表中的序列1所示的核苷酸。含有所述的DNA分子的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本发 明保护的范围。所述重组载体为pCDMAR-PKMHT-Npt 11，其为将所述的DNA分子整合到载体 pCDMAR-key-Nptll上得到的载体。所述载体pCDMAR-key-Nptll通过如下方法制备1)以质粒 pYLTACT^N 为模板，引物5，-GGAATTCCaggatccaagcttgtcg-3‘ ；5‘ -GC TCTAGAaaacactgatagtttaaac-3’进行PCR扩增，得到PCR产物即为含有IoxP位点和归位内 切酶I-Sce I的关键序列；2)用EcoR I和Xba I双酶切上述步骤1)的PCR产物，与同样酶酶切得到的去选 择标记质粒pCDMAR-hyg连接，得到接受载体pCDMAR-key-hyg ；3)再用Xho I酶切质粒pCAMBIA2300，与同样酶酶切上述步骤2)质粒 pCDMAR-key-hyg得到的载体片段连接，得到适用于双子叶植物的多基因接受载体 pCDMAR-key-NptIL·本发明的另一个目的是提供一种培育光合效率提高的转基因植物方法。本发明提供的方法为将所述的DNA分子导入目的植物，得到转基因植物；所述转 基因植物光合效率高于所述目的植物。所述的DNA分子通过所述的重组表达载体导入目的植物。
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所述转基因植物光合效率高于所述目的植物体现在所述转基因植物的净光合速 率高于所述目的植物。所述目的植物为C3植物。所述C3植物优选为C3光合类型双子叶植物，具体为烟草。本发明的实验证明，将多个C4途径关键酶基导入C3植物得到的转基因植物，其比 野生型植物(C3植物)的光合效率高。对今后利用多基因转化技术提高作物光合效率的实 践工作具有一定的借鉴意义。
图1为接受载体pCDMAR-key-Nptll质粒图谱图2为供给载体pYLVS-35noS的质粒图谱图3为供给载体pYLSV-35noSf的质粒图谱图 4 为水稻 PEPC、PPDK、NADP-ME, NADP-MDH 和 PPT 基因的克隆图5为双T-DNA、多基因表达载体整合过程示意6为双T-DNA、多基因植物表达载体pCDMAR-PKMHT-Nptll的质粒图谱和酶切鉴
定图7为植物表达载体pCDMAR-PKMHT-Nptll的PCR鉴定图8为双T-DNA多基因植物表达载体在农杆菌中的稳定性鉴定图9为烟草Xanthi在不同培养阶段的生长情况图10为PCR检测TO代转基因烟草的共转化情况图 11 为转质粒 pCDMAR-PKMHT-Nptll Tl 代烟草植株的 Southern blot 分析图12为转质粒pCDMAR-PKMHT-Nptll Tl代转基因烟草中C4光合基因的表达分析图13为转多基因烟草Tl代植株净光合速率图14为转多基因烟草Tl代植株叶绿素荧光参数Fv/Fm的比较
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、双T-DNA、多基因植物表达载体pCDMAR-PKMHT-Nptll的获得1、双T-DNA多基因组装载体系统的建立1)接受载体 pCDMAR-key-Nptll 的构建设计PCR 引物5，-GGAATTCCaggatccaagcttgtcg-3，；5，-GCTCTAGAaaacactg atagtttaaac-3，，以质粒 pYLTAC747N(Lin, L.，Liu, Y. G.，Xu, X.，and Li, B. (2003). Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigene assembly and transformation vector system. Proc. Natl. Acad. Sci. 100,5962-5967, ^ΑηΤ/ΛΦ Hf4 学院遗传与发育生物学研究所获得。)为模板，进行PCR扩增，得到PCR产物即为含有IoxP 位点和归位内切酶I-Sce I的关键序列。用EcoR I和Xba I双酶切上述的PCR产物，并回收200bp的关键序列，与同 样酶酶切得到的去选择标记质粒pCDMAR-hyg (谭登峰等，2008。可去除选择标记的
5DREB基因双T-DNA载体共转化玉米。四川农业大学学报，26 (1) 15-19，公众可从中国 科学院遗传与发育生物学研究所获得。)片段连接，得到适用于单子叶植物的接受载 体pCDMAR-key-hyg。再用Xho I酶切质粒pCAMBIA2300 (谢迎秋等，2000。棉花曲叶 病毒互补链基因启动子功能区的缺失分析。中国科学C辑，30(5) :528-534，公众可从 中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)，回收878bp的片段(新霉素磷酸转移酶 基因)，与同样酶酶切得到的质粒pCDMAR-key-hyg载体片段连接，得到适用于双子叶 植物的多基因接受载体pCDMAR-key-Nptll。该载体的结构示意图如图1所示，其中， A 为接受载体 pCDMAR-key-Nptll 的质粒图谱:MAR, Matrixattachmentregion ；LB, Left border ；RB, Right border ；NptII, neomycin phosphotransferase II ；B 为接受载体 pCDMAR-key-Nptll 限制性酶切图谱1，λ DNA/Hind III Marker ；2,EcoRI ；3,Hind III ；4， BamH I+NcoI ；5, Not I ；6, Ikb ladder。2)供给载体 pYLVS-35nos 和 pYLSV_35nosf 的构建用带有Sac I/Hind III 酶切位点的引物 5，-CGAGCTCGTCCCCAGATTAGCCTTTTC_3，和 5，-CCCAAGCTTTCCCCCGTGTTCTCTCCMATG_3，以质粒PBI121(chen et al. Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plantsMolecular Breeding，2003，11 :287_293，公众可从中国科学院遗 传与发育生物学研究所获得。)为模板，扩增CaMV35S序列酶切后回收846bp的CaMV35S 片段，与经过同样酶切得到的质粒 pYLSV(Lin，L.，Liu, Y. G.，Xu, X.，and Li，B. (2003). Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigene assembly and transformation vector system. Proc. Natl. Acad. Sci，100,5962-5967,
学院遗传与发育生物学研究所获得。)载体片段连接，得到质粒PYLSV-35S。Sac I/Cla I酶切质粒pMD-stnos (用带有酶切位点Sac I和Cla的引物 GAGCTCCccgatctagtaacatag 和 ATCGATGATCGTTCAAACATTTGG 以质粒 PBI121 为模板扩增 T-nos 序列，连至Ij pMD18-T simple (Takara，D103A)载体上)回收 284bp 的 Tnos 片段，插 入质粒PYLSV-35S的Sac I/Cla I的位点，获得中间质粒pYLSV_35nos。通过Hind III/ Cla I 双酶切质粒 pYLSV-35nos，回收 CaMV35S_Tnos 片段，插入到质粒 pYLVS (Lin, L.，Liu, Y. G. , Xu, X. , and Li, B. (2003). Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigene assembly and transformation vector system.Proc. Natl. Acad. Sci,100, 5962-5967.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)的Hind III和Cla I位 点，获得了含有CaMV35S启动子和Tnos终止子的质粒pYLVS-35noS。该质粒的结构示意图 见图2所示，其中(A)供给载体pYLVS-35nos的质粒图谱Tnos，terminator of nopaline synthase ；P_35s，promoter of CaMV35S ； (B)供给载体pYLVS_35nos 的限制性酶切图谱1， Ikb ladder/l+2+3+4+5+6+8+10kb ；2, Hind ΙΙΙ+Κρη I ；3,Pst I；4,Pst I+Sal I ；5,I-Sce I+KpnI ；6，PI-Sce I+Hind III。通过Hind III/Cla I 酶切质粒 pYLSV_35nos，分别回收 CaMV35S_Tnos 片段 (Klenow平端化)。pYLSV骨架通过Hind III酶切，Klenow平端化，CIAP去磷酸化。然后两 者经T4 DNA连接酶环化后获得质粒pYLSV-35nosf (—个CaMV35S)。pYLSV_35nosf的结构示 意图如图3所示，(A)供给载体pYLSV-35nosf的质粒图谱Tnos, terminator of nopal ine syynthase ；P_35s，promoter of CaMV35S ； (B)供给载体 pYLSV_35nosf 的限制性酶切图谱1, DL2000, Marker/100+250+500+750+1000+2000+3000+5000bp ；2, Sca I ；3，Bgl II ；4，Bgl II+Sal I；5,Kpn I ；6, Pst I+BamH I。2、水稻C4光合基因的克隆1)植物总RNA的提取总RNA的提取按LiCl法进行，并稍加改进。取1. Og水稻两优2186 (Oryza sativa LY2186, Song, et al. Comparative Transcriptional Profiling and Preliminary Study on Heterosis Mechanism of Super-Hybrid Rice. Mol Plant. 2010,1-14, ^ΑηΤ/ΛΦ H 科学院遗传与发育生物学研究所获得。)叶片于液氮中研磨成粉末状，转移到含2ml提取 Buffer,2ml水饱和酚的7ml离心管中，剧烈振荡混勻Imin后，置冰上2-3min ；加入2ml氯 仿/异戊醇(49 1)混勻，4，OOOrpm 4°C离心IOmin ；取上清，加入2ml 8M LiCl，冰上放置 3h ； 10, OOOrpm 4°C离心lOmin，沉淀经70%乙醇洗涤两次后溶于Iml DEPC处理的水中，加 入1倍体积的水饱和酚抽提一次，然后加入1/10体积的5M NaCl去除多糖；取上清，加入1 倍体积的氯仿/异戊醇(49 1)抽提一次，在上清中加入1/10体积的3M NaAc (pH4. 5)，2 倍体积的无水乙醇，_20°C沉淀Ih ；10, OOOrpm离心lOmin，沉淀用70%乙醇洗涤一次，干燥 后溶于适当体积DEPC处理的水中，得到总RNA，-70°C保存备用。2) RT-PCR克隆水稻C4光合基因(1)第一链的合成先在每管中加入如下组分上述得到的总RNA样品(3-5 μ g)、4 μ 1 oligo dT15(10yM)、RNase Inhibitor 4 μ 1 (40U/ μ 1)，加 DEPC 处理的水至 48 μ 1，用手轻弹后稍 离心，置65°C变性15min后立即置冰上冷却2min。向每个冷却的样品管中加入下列组分，16 μ 1 5Χ第一链反应缓冲液、8 μ 1 二硫 苏糖醇(0. 1Μ)，4μ 1 dNTPs (IOmM) 在42°C条件下反应2min后，加入4 μ 1 M-MLV反转录 酶，然后在42°C反应lh，于72°C加热15min。将反转录产物cDNA第一链置于_20°C中备用。(2)目的基因的扩增以反转录出的cDNA第一链作为模板进行目的基因的克隆。20 μ 1反应体系中包 括2XPCR GC buffer I 10 μ 1，基因特异引物 1 μ 1 (终浓度 0· 5_lpM)、dNTPs 1·6μ1(终 浓度200 μ Μ) ,LA-Taq酶0. 3 μ 1 (5U/ μ 1)及cDNA第一链1 μ 1作模板，用无菌双蒸水补足。PCR反应条件如下94°C预变性6min。
94°C 变性 1 min，-
56°C退火 40 s,28 cycles
72°C延伸1-3 min(依基因而异)；——72 °C 继续延伸 5minPCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN公司的DNA凝胶回收试剂盒 进行回收后，连接到测序载体PMD18-T(购自Takara公司，目录号为D101A)上进行序列测定。基因特异引物序列如下磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)扩增引物Ppcl 5' -TTG CCC TCC AAT CTA TCT CCG-3'
Ppc2 :5， -TAG CAT CGG CGA ACG TA-3，扩增的目的片段为3，149bp。将该PCR产物与pMD18_T连接得到的质粒送去测 序，结果为该PCR产物的基因具有序列表中序列1自5’末端第889-4037位核苷酸，命名为 PEPC，该基因的编码区为序列1自5’末端第1054-3933位核苷酸，该基因编码的蛋白命名 为PEPC，其genbank号为J013001G17。该质粒为将序列1自5，末端第889-4037位核苷酸 与pMD18-T连接得到的质粒，命名为pMD18-PEPC。丙酮酸磷酸双激酶基因(PPDK)扩增引物Ppdkl :5，-CGAATCTCTCTCCGATCCCAG, _3，Ppdk2 :5’ -ACC TTT ATT CGA TTC TTC GTC GTC-3’扩增的目的片段为3，147bp，将该PCR产物与pMD18_T连接得到的质粒送去测序， 结果为该PCR产物的基因具有序列表中序列1自5’末端第5291-8437位核苷酸，命名为 PPDK，该基因的编码区为序列1自5’末端第5358-8204位核苷酸，该基因编码的蛋白命名 为PPDK，其genbank号为J013134L02。该质粒为将序列1自5，末端第5253-8437位核苷 酸与pMD18-T连接得到的质粒，命名为pMD18-PPDK。NADP苹果酸酶基因(NADP-ME)扩增引物Mel 5' -TAT ACC GGC CTC CTC CCT CCC ATT A_3'Me2 5' -GGC GAC AAT GGC AAC ACA ACA TA-3'扩增的目的片段为2，122bp，将该PCR产物与pMD18_T连接得到的质粒送去测序， 结果为该PCR产物的基因具有序列表中序列1自5’末端第9651-11772位核苷酸，命名为 NADP-ME，该基因的编码区为序列1自5’末端第9775-11691位核苷酸，该基因编码的蛋白 命名为NADP-ME，其genbank号为J033092D06。该质粒为将序列1自5，末端第9651-11772 位核苷酸插入到PMD18-T中得到的质粒，命名为pMD18-ME。磷酸烯醇式丙酮酸转运蛋白基因(PPT)扩增引物Pptl :5，-CAG CAA CTA CGG CTT CAA-3，Ppt2 :5，-TCC AAT CAG GCT CCA TAC A-3，扩增的目的片段为959bp，将该PCR产物与pMD18_T连接得到的质粒送去测序，结 果为该PCR产物的基因具有序列表中序列1自5’末端第13031-13989位核苷酸，命名为 PPT，该基因的编码区为序列1自5’末端第13067-13862位核苷酸，该基因编码的蛋白命名 为PPT，其genbank号为J033061B10 (请提供)。该质粒为将序列1自5，末端第13031-13989 位核苷酸插入到PMD18-T中得到的质粒，命名为pMD18-PPT。苹果酸脱氢酶基因(NADP-MDH)扩增引物Mdhl :5，-CAA GCT CAG CCT GCC TAT CCA C-3，Mdh2 5' -CCG TCG AAA ACC CCT GTG AAA TAA-3'扩增的目的片段为1，387bp，将该PCR产物与pMD18_T连接得到的质粒送去测序， 结果为该PCR产物的基因具有序列表中序列1自5’末端第15133-16519位核苷酸，命名 为NADP-MDH，该基因的编码区为序列1自5’末端第15165-16466位核苷酸，该基因编码 的蛋白命名为NADP-MDH，其genbank号为001-205-B06。该质粒为将序列1自5，末端第 15133-16519位核苷酸插入到pMD18_T中得到的质粒，命名为pMD18_MDH。以上5个基因扩增的产物进行电泳，结果见图4所示，其中，A-E分别为PEPC，
8PPKD，NADP-ME，NADP-MDH 和 PPT。3、用于双子叶植物转化的C4光合基因中间载体的构建1)质粒 pYLVS-PEPC 的构建用Hind ΙΙΙ/Sma I双酶切质粒pMD-PEPC，再进行Klenow平端化，回收3，181bp 片段，与经过Sma I酶切得到的pYLVS-35noS载体片段连接，得到转化子。提取转化子的 质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中序列1自5’末端第889-4037位核苷酸插入 pYLVS-35nos载体的Sma I酶切位点间得到的质粒，命名为pYLVS-PEPC，其含有PEPC表达 框(CaMV35S-PEPC-Tnos)。2)质粒 pYLSVf-PPDK 的构建用Nru I/Xba I双酶切质粒pMD-PPDK，再进行Klenow平端化，回收3，152bp片段， 与经过Sma I酶切得到的pYLSV-35nos载体片段连接，得到转化子pYLSV-PPDK。Kpn I/Xba I双酶切质粒pYLSV-PPDK，回收3，152bp PPDK基因插入到质粒pYLSV_35nosf的Kpn I/Xbal 位点，获得携有PPDK表达框(CaMV35S-PPDK-Tnos)的质粒pYLSVf-PPDK。其含有PPDK表达 框(CaMV35S-PPDK-Tnos)。3)质粒 pYLVS-ME 的构建用Sal I/Xba I双酶切质粒pMD18_ME，再进行Klenow平端化，回收2，136bp片 段，与经过Sma I酶切并去磷酸化处理的供体质粒pYLVS-35noS载体片段连接，得到转化子 pYLVS-ME。4)质粒 pYLSVf-MP 的构建用Sal I/Xba I双酶切质粒pMD18_MDH，回收1387bp片段，与经过Sal I/Xba I酶 切得到的pYLSVf-35noS载体片段连接，得到转化子pYLSVf-MDH。以水稻两优 2186 (Oryza sativa LY2186)叶片 cDNA 为模板，带 有 BamH 和 KpnI 酶切位点的弓丨物对 5，-CGGATCCCAGCAACTACGGCTTCAA-3，和 5’ -GGGGTACCTCCAATCAGGCTCCATAC-3’扩增PPT，回收酶切后连接到到用相同的酶消化的 pYLSV-35noSf质粒上，得到重组质粒，然后以该重组质粒为模板用带有PstI酶切位点的 弓丨物 5，-AACTGCAGGTCCCCAGATTAGCCT-3，和 5，-AACTGCAGAATTCCCCGATCTAGTAA-3，扩增 带有35S、PPT及T-nos的一段序列，将该扩增片段经Pst I酶切后回收片段与用Pst I 消化的pYLSVf-MDH载体片段连接，得到具有NADP-MDH和PPT两个基因表达框的转化子 pYLSVf-MPο4、转化双子叶植物的C4光合多基因植物表达载体的组装双子叶植物多基因组装载体系统由一个接受载体pCDMAR-key-Nptll和两个供 给载体pYLVS-35noS和pYLSV-35noSf组成，在进行多基因整合之前，已经事先将水稻 PEPC, PPDK, NADP-ME, NADP-MDH和PPT五个基因分别构建到这两个供给载体上，形成了中 间载体pYLVS-PEPC、pYLSVf-PPDK、pYLVS-ME和pYLSVf-MP。将这些质粒依次同接受载体 pCDMAR-key-Nptll进行整合，构建成含有五个基因的双T-DNA多基因植物表达载体，具体 整合过程如如图5所示，具体如下第一次整合的目的是将水稻PEPC基因引入接受载体pCDMAR-key-Nptll，这需要 通过中间载体pYLVS-PEPC与接受载体pCDMAR-key-Nptll进行体内整合来实现，组装过程 示意图见图5。首先将pYLVS-PEPC和接受载体pCDMAR-key-Nptll按1 5的摩尔比例共转化到表达Cre酶的大肠杆菌NS3529(蒋涨等，2006。通用型奶牛多位点基因打靶载体系 统的构建。暨南大学学报(自然科学版)，27(3) :470-475，公众可从中国科学院遗传与发育 生物学研究所获得。)感受态中，涂布在含有卡那霉素和氯霉素双抗板上进行筛选。此时双 抗板上的克隆包含3种质粒中间载体pYLVS-PEPC、接受载体pCDMAR-key-Nptll和共整合 质粒。然后随机挑取5-10个克隆提取质粒后混合，按不同浓度梯度稀释后转化到DHlOB (上 海雷浩信息科技有限公司，LHF0161)(不含有Cre酶)感受态中，通过筛选分离到共整合质 粒pCDMAR-P-b，大量扩繁。pCDMAR-P-b纯化后用I-Sce I切除pYLVS骨架，在T4 DNA连接酶的作用下利 用人工合成的接头LS(gCggCCgCttat)使其环化。通过上述操作后，去除了最初接受载体 上的I-Sce I位点，便于以后步骤重复使用。将环化质粒转化到DHlOB后，在含有氯霉 素的培养基上对克隆进行敏感性鉴定，对不抗的克隆经Not I酶切筛选后，得到新质粒 pCDMAR-P-NptIL·质粒pCDMAR-P-Nptll不含I-Sce I位点，但通过共整合引入了一个新的 PI-Sce I位点，这个新形成的质粒，作为下一次整合的接受载体。第二次整合是通过中间载体pYLSVf-PPDK将PPDK基因引入接受载体 pCDMAR-P-Nptll。首先将pYLSVf-PPDK和接受载体pCDMAR-P-Nptll按照1 5的摩尔比例 共转化到含有Cre重组酶基因的大肠杆菌NS3529感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和氯霉 素双抗平板上，双抗上生长的克隆包含三种类型的质粒中间载体pYLSVf-PPDK、接受载体 pCDMAR-P-Nptll和共整合的质粒。通过混收双抗的菌落，提取混合质粒，通过稀释不同梯度 来转化到不含有Cre重组酶基因的大肠杆菌DHlOB中，使稳定的共整合质粒pCDMAR-PK_b 得以分离，并大量繁殖。pCDMAR-PK-b质粒进行纯化后用PI-Sce I切除pYLSV的骨架，然后通过T4 DNA连 接酶把酶切过的整合质粒片段同人工合成的接头Lv(gcggccgcgcac)连接成环状质粒，经 过这一步骤后去除了 PI-Sce I位点，便于以后操作中重复使用。将环化质粒转化到DH10B， 先用含卡那霉素的培养基选择抗卡那霉素的克隆，再用含氯霉素的培养基对克隆进行敏感 性鉴定，得到不抗氯霉素的克隆即为新质粒pCDMAR-PK-Nptll。质粒pCDMAR-PK_NptII不含 有PI-Sce I位点，但引入了一个新的归位内切酶I-Sce I识别位点。这个新质粒将作为下 一步整合的接受载体。第三次整合是通过中间载体pYLVS-ME将水稻NADP-ME基因引入接受载体 pCDMAR-PK-NptIL·首先将pYLVS-ME和pCDMAR_PK_NptII按照1 5的摩尔比例共转化到 表达Cre重组酶的大肠杆菌NS3529感受态中，然后在含有卡那霉素和氯霉素双抗平板上进 行培养。通过混收双抗的菌落，提取混合质粒，通过稀释不同梯度来转化不含有Cre重组酶 基因的大肠杆菌DHlOB中，分离到稳定共整合质粒pCDMAR-PKM-b，并大量扩繁。pCDMAR-PKM-b质粒经纯化后用归位内切酶I_Sce I切除pYLVS的骨架，然后利用 T4 DNA连接酶把酶切过的整合载体同接头LS(gCggCCgCttat)连接成环状质粒，这一步骤 的目的是去除了 I-Sce I位点，便于以后重复使用该位点。将环状质粒转化到DH10B，在含 有卡那霉素的培养基上进行培养，再对克隆进行氯霉素敏感性鉴定，对不抗氯霉素的克隆 经过Not I酶切鉴定得到新质粒pCDMAR-PKM-Nptll。该质粒不含有I-Sce I位点，同时引 入了一个新的归位内切酶PI-Sce I识别位点。这个新质粒将作为下一步整合的接受载体。第四次整合是通过中间载体pYLSVf-MP将基因NADP-MDH和PPT引入到接受载体
10pCDMAR-PKM-NptIL· 首先将 pYLSVf-MP 和 pCDMAR-PKM-Nptll 按照 1 10 的摩尔比例一起 转化到表达Cre重组酶的大肠杆菌NS3529感受态中，在含有卡那霉素和氯霉素筛的培养基 上进行筛选。然后随机挑取10个克隆进行混合培养。通过提取混合质粒后，稀释成不同浓 度梯度后转化到不含Cre重组酶的大肠杆菌DHlOB感受态中，通过大量的筛选分离到共整 合的质粒pCDMAR-PKMHT-b，经过Not I酶切鉴定得到新质粒pCDMAR-PKMHT_b，进行大量繁 殖。纯化pCDMAR-PKMHT-b用PI-Sce I酶切去除pYLSV骨架，然后用T4 DNA连接酶 将酶切质粒和接头Lv(gcggccgcgcac)连接成环状质粒。经过这一步骤后去除了 PI-Sce I位点，并且失去了氯霉素抗性。将环化质粒再次转化到大肠杆菌DHlOB感受态中，涂布 在含有卡那霉素的培养基，并对长出的克隆进行氯霉素敏感性测验，保留氯霉素敏感的克 隆以便做进一步的筛选。通过大量筛选获得新质粒pCDMAR-PKMHT-Nptll。经过测序，载 体pCDMAR-PKMHT-Nptll为将序列表中序列1自5’末端第1-16802位核苷酸整合到载体 pCDMAR-key-Nptll上得到的载体。序列1也可人工合成。序列1自5，末端第1-846位为驱动PEPC蛋白表达的CaMV35S启动子；自5，末端 第4089-4338位为T_nos终止子；序列1自5，末端第4430-5275位为驱动PPDK蛋白表达的CaMV35S启动子；自5， 末端第8484-8733位为T_nos终止子；序列1自5’末端第8781-9626位为驱动NADP-ME蛋白表达的CaMV35S启动子；自 5，末端第11824-12073位为T-nos终止子；序列1自5’末端第12165-13010位为驱动PPT蛋白表达的CaMV35S启动子；自5’ 末端第14019-14268位为T_nos终止子；序列1自5’末端第14276-15121位为驱动NADP-MDH蛋白表达的CaMV35S启动子； 自5，末端第16553-16802位为T-nos终止子。整合后的pCDMAR-PKMHT-Nptll的结构示意图如图6A所示，用一些限制酶进行酶 切，结果如图 6B所示，其中 1，ADNA/Hindlll Marker ；2,1-Sce I ；3,Xba I+Kpn I ；4, SacI ； 5，Ikb ladder ；6, Not I;7，Spe I ；8,Kpn I ；9,DL2000 Marker/100+250+500+750+1000+20 00+3000+5000bp，从图中看出，载体 pCDMAR_PKMHT_Npt11 构建正确。将pCDMAR-PKMHT-Nptll进行PCR鉴定，引物如表所示
1权利要求
1.一种DNA分子，由如下DNA片段依次连接构成DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、 DNA片段4和DNA片段5 ；所述DNA片段1由驱动PEPC蛋白表达的启动子、PEPC蛋白的编码基因及终止子依次 连接构成；所述DNA片段2由驱动PPDK蛋白表达的启动子、PPDK蛋白的编码基因及终止子依次 连接构成；所述DNA片段3由驱动NADP-ME蛋白表达的启动子、NADP-ME蛋白的编码基因及终止 子依次连接构成；所述DNA片段4由驱动PPT蛋白表达的启动子、PPT蛋白的编码基因及终止子依次连 接构成；所述DNA片段5由由驱动NADP-MDH蛋白表达的启动子、NADP-MDH蛋白的编码基因及 终止子依次连接构成。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5中的各启动子相同 或者不同；所述DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5中的各终止子 相同或者不同。
3.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于所述DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5中的各启动子相同， 所述各启动子均为CaMV35S ；所述DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5中的各终止子相同， 所述各终止子均为T-nos。
4.根据权利要求1-3中任一所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子为序列表中的序列1所示的核苷酸。
5.含有权利要求1-4中任一所述的DNA分子的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
6.一种培育光合效率提高的转基因植物方法，为将权利要求1-4中任一所述的DNA分 子导入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物光合效率高于所述目的植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于权利要求1-4中任一所述的DNA分子通 过权利要求5所述的重组表达载体导入目的植物。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述转基因植物光合效率高于所述目的植物体现在所述转基因植物的净光合速率高 于所述目的植物。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为C3植物。
10.根据权利要求6-9中任一所述方法，其特征在于所述C3植物为烟草。
全文摘要
本发明公开了一种与光合作用相关的DNA分子及其应用。本发明提供的DNA分子由如下DNA片段依次连接构成DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段5；所述DNA片段1由驱动PEPC蛋白表达的启动子、PEPC蛋白的编码基因及终止子依次连接构成；所述DNA片段2由驱动PPDK蛋白表达的启动子、PPDK蛋白的编码基因及终止子依次连接构成；所述DNA片段2由驱动PPDK蛋白表达的启动子、PPDK蛋白的编码基因及终止子依次连接构成。本发明的实验证明，将多个C4途径关键酶基导入C3植物得到的转基因植物，其比野生型植物(C3植物)的光合效率高。对今后利用多基因转化技术提高作物光合效率的实践工作具有一定的借鉴意义。
文档编号C12N1/15GK102002496SQ20101054446
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月15日 优先权日2010年11月15日
发明者朱祯, 陈斌 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所