专利名称：源自低等光合真核生物的质体转运肽及其方法
技术领域：
本发明涉及植物的基因修饰，特别是所关注多肽至植物质体的转运。
背景技术：
本发明所述质体包含其自身的基因组。然而，许多质体基因在进化过程中被转移至核基因组中。因此，形成了核编码的质体蛋白转运回该质体的机制。在这种方式下，这些核编码的质体基因的蛋白产物在细胞核内表达后被转移回该质体中。这些蛋白通过运用定位于转运蛋白N-末端的转运肽序列而得以转运。这些肽能够介导蛋白至质体上，其后往往由特定的蛋白酶水解去除。细胞生物学的根本问题是，由细胞质核糖体合成的蛋白质向其相应细胞内定位的精确和高效的靶向作用。对于转基因高等植物而言，这是特别真实的，其转基因产物需要在合适的细胞器或隔室内产生。本发明提供了一种质体靶向肽，它能够有效地将外源性多肽转运至转基因高等植物的叶绿体中。发明概述本发明提供了叶绿体靶向肽的组成和方法。组成包括转运肽以及编码转运肽(即质体靶向肽或转运肽)及其变体的核苷酸序列。组成还包括由核苷酸序列所组成的DNA构建体，该核苷酸序列可编码转运肽，后者能够有效地连接至编码所关注多肽的核苷酸序列上。这些DNA构建体证实了在外源多肽向质体表达和定位方面的用途。组成还包括表达盒、载体、转化植株、转化植物细胞，以及稳定转化的植物种子，其中所关注多肽经本发明的质体靶向肽被定位至叶绿体上。发明详细说明低等光合真核生物包括绿藻门(绿藻类，如衣藻和杜氏藻)、红藻门(红藻)、灰色藻门(如蓝载藻)、裸藻门(如眼虫)、褐藻门、不等鞭毛类、定鞭藻类、隐藻门和甲藻门的主要谱系。低等光合真核生物中不包括蓝藻门。然而，细菌域的蓝藻门(蓝细菌，如聚球藻和集胞藻)具有光合作用的机制。因此，本文纳入了这些光合细菌作为基本的光合机制来源。低等光合真核生物的特点是含有光合作用的细胞器，该细胞器是从蓝细菌衍生发展而来的。环绕光合作用细胞器的膜的数目在低等光合真核生物的成员中各有不同。光合作用的细胞器可以是一级质体或二级(或三级)质体。一级质体或单一质体，可在绿藻门、红藻门和灰色藻门中发现，且经鉴定具有双层结合膜。这些包含一级质体的生物被认为是蓝细菌原始内共生伙伴关系的唯一后裔 (Harper和Keeling,分子生物学与进化20 (10) 1730-1735 (2003)。含有有机体的一级质体已被归纳为单一的超群，被称为原始色素体生物(Maruyama等，BMC进化生物学8 : 151(2008))。
二级(和三级)或复合质体是由三或四层膜围绕的，它们被认为是由二级内共生所派生的，其中由生物体吞噬了藻类而生成。二级和三级质体的系统进化分析表明，这些质体是由几起不同的内共生事件而衍生的，这几起事件发生在进化期间(Bhattacharya和 Medlin，植物生理学116 :9_15(1998))。裸藻和甲藻是有二级或复合质体的生物体的实例。 参见Bhattacharya和Medlin的综述，植物生理学116 :9_15(1998)。裸藻和褐藻有绿藻的二级质体，而不等鞭毛类、定鞭藻类、隐藻和甲藻则全部拥有红藻的二级内共生体(Harper 和 Keeling,分子生物学与进化 20 (10) :1730_1735 (2003))。本发明的质体靶向肽或转运肽能够有效地介导连接多肽向质体的靶向、定位或转运。质体是在植物和藻类中存在的细胞器。质体负责进行光合作用、储存诸如淀粉类产物， 并负责完成诸如脂肪酸、萜类等许多种分子的合成及细胞构成模块所需的其他分子的合成。质体依据其在细胞内的作用而具有分化或再分化成几种形式的能力。未分化的前质体有可能发育成以下任何质体，包括叶绿体、色质体、白色体、淀粉形成体、耳石、油质体和蛋白质体。“叶绿体转运肽”或“质体运输肽”或“质体转运肽”或“转运肽”是必要的，也是足以促进蛋白质输入其原生宿主细胞的。这种质体可以是一级、二级或三级质体。质体可能就是叶绿体。转运肽定位于输入质体的蛋白质的N末端。转运肽能够有效促进使多肽连接至质体内的共翻译或翻译后转运。这些转运肽一般含有40至100个氨基酸。研究表明，转运肽包含共同的特点。这些特点包括它们几乎没有带负电荷的氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸、 天门酰胺或谷氨酰胺；其N-末端区域为没有带电荷的氨基酸，也没有诸如甘氨酸或脯氨酸之类的氨基酸；它们的中央区域包含非常高比例的碱性或羟基氨基酸，如丝氨酸或苏氨酸； 并且其C-末端区域富含精氨酸，且具有形成兼性折叠二级结构的能力。输入后，可通过质体内的特异性蛋白酶将转运肽有效地从连接多肽上剪切去除。根据一本有权威性的著作(Cline和Henry，细胞和发育生物学年鉴12 1-26 (1996 年))，高等植物的叶绿体转运肽共同享有以下几个特点(1)它们表面上具有线粒体转运肽的类似特征，即它们富含羟化残基且缺少酸性残基；(2)它们具有30-120残基的长度； (3)其N-末端10-15氨基酸缺乏甘氨酸、脯氨酸和带电荷的残基；(4)可变的中央区域富含丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸和精氨酸；(5)其C-末端区域包含进行蛋白水解加工的松散保守序列(Ile/Val-X-Ala/CyS*Ala) ； (6)没有延伸序列保守性或保守的二级结构基元，以及(7) 它们从理论上说主要采用无规则卷曲构象。存在着几种计算方法，其使用了上述功能以预测高等植物的叶绿体前导序列。计算工具包括 PSORT (Nakai 和 Kanehisa，蛋白质 11 (2) :95_110 (1991 年)；Horton 等，第四届亚太生物信息学大会APBC06(台北，台湾)的会议录39-48页(2006年)；http:// www. psort. org)、ChloroP (Emanuelsson 等，分子生物学杂志 300 1005-1016 (1999 年)； http//www. cbs. dtu. dk/services/ChloroP/)或 TargetP(Nielsen 等，蛋白质工程 10 1-6 (1997 年)；Emanuelsson 等，分子生物学杂志 300 :1005-1016 (2000 年);http://www. cbs. dtu. dk/services/TargetP/)。与高等植物相反，比较诸如莱氏衣藻这样的生物体的转运肽形成了以下特性(1) 它们具有短的、不带电荷的N-末端区域；(2)它们的中央区域富含精氨酸、丙氨酸、缬氨酸和丝氨酸，因而具有形成兼性α-螺旋的较高倾向，以及(3)它们具有可能形成兼性β-片层结构的 C-末端区域(Franzen 等，FEBS 通讯 260 (2) 165-168 (1990 年))。在本发明的一个实施例中，这种转运肽是从低等光合真核生物中得到的，其能够有效地连接至外源蛋白上并在转基因高等植物中进行表达，它能够将该外源蛋白定位至叶绿体上。低等光合真核生物是从类群中选择得到的，该类群包括绿藻门(绿藻类，如衣藻和杜氏藻)、红藻门(红藻类)、灰色藻门(如蓝载藻)、裸藻门(如眼虫)、褐藻门、不等鞭毛类、定鞭藻类、隐藻门和甲藻门。在另一个实施例中，转运肽是从衣藻中得到的。在另一个实施例中，转运肽是从莱氏衣藻中得到的。在另一个实施例中，转运肽是从杜氏藻中得到的。 在另一个实施例中，转运肽是从杜氏盐藻中得到的。本发明的另一个实施例是一种将外源蛋白定位至转基因高等植物的叶绿体上的方法，其中由几个步骤组成，即有效地将转运肽从低等光合真核生物连接至外源蛋白上，从而产生含有外源蛋白的转基因植物，其中外源蛋白可在转基因植物的叶绿体中检测得到。 转基因植物可能是一种高等转基因植物。低等光合真核生物是从类群中选择得到的，该类群包括绿藻门(绿藻类，如衣藻和杜氏藻)、红藻门(红藻类)、灰色藻门(如蓝载藻)、裸藻门(如眼虫)、褐藻门、不等鞭毛类、定鞭藻类、隐藻门和甲藻门。在另一个实施例中，转运肽是从衣藻中得到的。在另一个实施例中，转运肽是从莱氏衣藻中得到的。在另一个实施例中，转运肽是从杜氏藻中得到的。在另一个实施例中，转运肽是从杜氏盐藻中得到的。在本发明的一个实施例中，这种转运肽是从低等光合原核生物中得到的，其能够有效地连接至外源蛋白上并在转基因高等植物中进行表达，它能够将该外源蛋白定位至叶绿体上。低等光合原核生物是从蓝藻(前身为“蓝绿藻”之称的蓝绿细菌)所组成的类群中选择得到的。在另一个实施例中，转运肽是从聚球藻中得到的。在另一个实施例中，转运肽是从聚球藻属PCC 7002中得到的。在另一个实施例中，转运肽是从集胞藻中得到的。在另一个实施例中，转运肽是从集胞藻属PCC 6803中得到的。本发明的另一个实施例是一种将外源蛋白定位至转基因高等植物的叶绿体上的方法，其中由几个步骤组成，即有效地将转运肽从低等光合原核生物连接至外源蛋白上，从而产生含有外源蛋白的转基因植物，其中外源蛋白可在转基因植物的叶绿体中检测得到。 转基因植物可能是一种高等转基因植物。低等光合原核生物是从蓝藻(前身为“蓝绿藻”之称的蓝绿细菌)所组成的类群中选择得到的。在另一个实施例中，转运肽是从聚球藻中得到的。在另一个实施例中，转运肽是从聚球藻属PCC 7002中得到的。在另一个实施例中，转运肽是从集胞藻中得到的。在另一个实施例中，转运肽是从集胞藻属PCC 6803中得到的。这些组成包括编码转运肽及其变体的核苷酸序列。在一个实施例中，转运肽包括 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20所述的氨基酸序列或片段及其变体，以及SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17和19所述的核苷酸序列或片段及其变体。组成还包括由核苷酸序列所组成的DNA构建体，该核苷酸序列可编码转运肽，后者能够有效地连接至编码外源多肽的核苷酸序列上。这些DNA构建体证实了在外源多肽向质体表达和定位方面的用途。组成还包括表达盒、载体、转化植株、转化植物细胞，以及稳定转化的植物种子，其中外源多肽经本发明的转运肽被定位至叶绿体上。在本发明的另一个实施例中，这种转运肽是从低等光合真核生物中得到的，其能够有效地连接至外源蛋白上并在转基因高等植物中进行表达，它能够将该外源蛋白定位至叶绿体上。转运肽来自编码蛋白质的核苷酸序列，其能够被定位至有光合作用的细胞器上。转运肽已证实位于在宿主细胞的细胞核内编码、但翻译后定位于宿主细胞光合细胞器的基因上，并可从以下类群选择得到，包括铁氧还蛋白-NADP+-氧化还原酶、核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶、5烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶、乙酰乳酸合成酶、叶绿体核糖体蛋白 CS17、CS蛋白、铁氧还蛋白、质体蓝素、二磷酸核酮糖羧化酶激活酶、色氨酸合成酶、酰基载体蛋白、质体监控蛋白-60、细胞色素C552、22-kDa热休克蛋白、33-kDa氧进化增强子蛋白 1、ATP合酶γ亚基(ATP酶Υ)、ΑΤΡ合酶ω亚基、叶绿素-a/b_结合蛋白11_1、氧进化增强子蛋白2、氧进化增强子蛋白3、光系统I P21、光系统I P28、光系统I P30、光系统I P35、 光系统I P37、甘油-3-磷酸乙酰转移酶、叶绿素a/b结合蛋白、CAB2蛋白、羟甲基胆色烷合酶，丙酮酸磷酸盐二激酶、CAB3蛋白、质体铁蛋白、铁蛋白、早期光诱导蛋白，谷氨酸-1-半醛转氨酶、原叶绿素酸酯还原酶、淀粉粒结合淀粉合成酶、光系统Π捕光叶绿素a/b结合蛋白、主要花粉变应原Lol ρ 5a、质体ClpB ATP依赖性蛋白酶、超氧化物歧化酶、铁氧还蛋白 NADP氧化还原酶、28-kDa核糖核蛋白、31_kDa核糖核蛋白、33_kDa核糖核蛋白、乙酰乳酸合成酶、ATP合酶CFO亚基1、2、3或4 ；细胞色素f、细胞色素c、ADP葡萄糖焦磷酸化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺合成酶2、碳酸酐酶、GapA蛋白、热休克蛋白hsp 21、磷酸转运蛋白、 质体CIpA ATP依赖性蛋白酶、质体核糖体蛋白CL24、质体核糖体蛋白CL9、质体核糖体蛋白 PsCL18、质体核糖体蛋白PsCL25、DAHP合成酶、淀粉磷酸化酶、根酰基载体蛋白11、甜菜醛脱氢酶、GapB蛋白、谷氨酰胺合成酶2、磷酸核酮糖激酶、亚硝酸盐还原酶、核糖体蛋白L12、 核糖体蛋白L13、核糖体蛋白L21、核糖体蛋白L35、核糖体蛋白L40、丙糖磷酸-3-磷酸甘油酸磷酸转运蛋白、铁氧还蛋白依赖性谷氨酸合酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、NADP依赖性苹果酸酶和NADP苹果酸脱氢酶。表1列出了额外的含有质体靶向序列的核编码基因。在本发明的一个实施例中，转运肽是从莱氏衣藻中得到的，特别是从莱氏衣藻光系统I P28中得到的，并构成了 SEQ ID NO :2中所述的氨基酸序列。在本发明的一个实施例中，转运肽是从莱氏衣藻中得到的，特别是从莱氏衣藻光系统I P30中得到的，并构成了 SEQ ID N0:4中所述的氨基酸序列。在本发明的一个实施例中，转运肽是从莱氏衣藻中得到的，特别是从莱氏衣藻光系统I P35中得到的，并构成了 SEQ ID NO :6中所述的氨基酸序列。在本发明的一个实施例中，转运肽是从莱氏衣藻(中得到的，特别是从莱氏衣藻光系统I P37中得到的， 并构成了 SEQ ID NO :8中所述的氨基酸序列。在本发明的一个实施例中，转运肽是从莱氏衣藻中得到的，特别是从莱氏衣藻ssRubisco中得到的，并构成了 SEQ ID NO 10中所述的氨基酸序列。在本发明的一个实施例中，转运肽是从莱氏衣藻中得到的，特别是从莱氏衣藻 Y-ATP酶中得到的，并构成了 SEQ ID NO :12中所述的氨基酸序列。在另一个实施例中，转运肽是从蓝细菌中得到的，特别是从聚球藻属PCC 7002细胞色素c550中得到的，并包含 SEQ ID NO: 14中所述的氨基酸序列。在另一个实施例中，转运肽是从蓝细菌中得到的，特别是从聚球藻属PCC 6803细胞色素c553中得到的，并包含SEQ ID NO 16中所述的氨基酸序列。在另一个实施例中，转运肽是从蓝细菌中得到的，特别是从聚球藻属PCC 6803 psaF 中得到的，并包含SEQ ID NO: 18中所述的氨基酸序列。在本发明的另一个实施例中，转运肽是从杜氏衣藻中得到的，特别是从杜氏盐藻EPSPS中得到的，并构成了 SEQ ID NO :20中所述的氨基酸序列。 表1 编码定位至质体的蛋白的核编码基因。参考文献以其整体通过引用而成为本文中的部分。
权利要求
1.一种植物，其基因组中已稳定地整合入了一种DNA构建体，所述组成编码质体靶向肽的核苷酸序列的构建体，其中所述核苷酸序列能够有效连接至编码所关注多肽的核苷酸序列上，其中所述编码质体靶向肽的核苷酸序列是从以下类群中筛选得到的，包括a)一种 SEQ ID NOS :1、3、5、7、9、11、13、15、17 和 19 所述的核苷酸序列；b)一种至少与SEQ ID NOS :1、3、5、7、9、11、13、15、17和19有90%同源序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够编码具有运输有效连接的多肽至质体上的能力的肽；c)一种编码SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20所述的氨基酸序列的核苷酸序列；以及d)一种编码至少与SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20有90%同源序列的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列能够运输有效连接的多肽至质体上。
2.权利要求1的植物，其中所述植物是单子叶植物。
3.权利要求2的植物，其中所述单子叶植物为玉米、水稻或甘蔗植物。
4.权利要求1的植物，其中所述植物是双子叶植物。
5.权利要求4的植物，其中所述双子叶植物是大豆植物。
6.一种在植物中表达所关注多肽的方法，所述方法包括向所述植物中导入DNA构建体，包括编码质体靶向肽的核苷酸序列，其中所述质体靶向肽的核苷酸序列能够有效连接至编码上述所关注多肽的核苷酸序列上，所述编码质体靶向肽的核苷酸序列是从以下类群中筛选得到的，包括a)一种 SEQ ID NOS :1、3、5、7、9、11、13、15、17 和 19 所述的核苷酸序列;b)一种至少与SEQ ID NOS :1、3、5、7、9、11、13、15、17和19有90%同源序列的核苷酸序列，其中上述核苷酸序列能够编码具有运输有效连接的多肽至质体上的能力的肽；c)一种编码SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20所述的氨基酸序列的核苷酸序列；以及d)一种编码至少与SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20有90%同源序列的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列能够运输有效连接的多肽至质体上。
7.权利要求6的方法，其中所述植物是单子叶植物。
8.权利要求6的方法，其中所述植物是双子叶植物。
9.权利要求6的方法，其中所述感兴趣的多肽是生物加工酶。
10.权利要求6的方法，其中所述编码所述感兴趣多肽的核苷酸序列为一种抗除草剂基因。
11.大幅纯化的能够将多肽运输至细胞质体内的肽，其中所述肽包括SEQID N0S:1、3、 5、7、9、11、13、15、17和19的类群中所述的氨基酸序列及其变体，其中所述变体保留着对多肽的运输能力。
12.权利要求11的肽，其中所述肽能够有效连接至所关注的多肽上。
13.—种编码权利要求11-12任意之一的肽的核苷酸序列。
14.一种与权利要求13的核苷酸序列有90%同源性的核苷酸序列。
15.一种包括权利要求13或14的核苷酸序列的DNA构建体。
16.一种植物细胞，其基因组中已稳定地整合入了一种DNA构建体，所述组成编码质体靶向肽的核苷酸序列的构建体，其中所述核苷酸序列能够有效连接至编码所关注多肽的核苷酸序列上，其中所述编码质体靶向肽的核苷酸序列是从以下类群中筛选得到的，包括a)一种 SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18 和 20 所述的核苷酸序列；b)一种至少与SEQ ID NOS :1、3、5、7、9、11、13、15、17和19有90%同源序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够编码具有运输有效连接的多肽至质体上的能力的肽；c)一种编码SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20所述的氨基酸序列的核苷酸序列；以及d)一种编码至少与SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20有90%同源序列的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列能够运输有效连接的多肽至质体上。
17.权利要求16的植物细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。
18.权利要求16的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
19.一种包含权利要求18的植物细胞的植物。
20.权利要求19的植物的稳定转化的种子。
全文摘要
本发明提供了质体靶向肽的组成和方法。组成包括质体转运肽以及编码这些转运肽及其变体的核苷酸序列。组成还包括由核苷酸序列所组成的DNA构建体，该核苷酸序列可编码质体转运肽，后者能够有效连接至编码所关注多肽的核苷酸序列上。这些DNA构建体证实了在所关注多肽向质体表达和定位方面的用途。组成还包括表达盒、载体、转化植株、转化植物细胞，以及稳定转化的植物种子，其中所关注多肽经本发明的质体靶向肽被定位至质体上。
文档编号C12Q1/68GK102471778SQ201080032079
公开日2012年5月23日 申请日期2010年7月9日 优先权日2009年7月21日
发明者A.T.里士满, K.邓肯, M.努西奥 申请人:先正达参股股份有限公司