专利名称：一种藻类叶绿体dna的提取方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体设计一种大型藻类叶绿体DNA高效高纯度的提取方法。
背景技术：
叶绿体是植物进行光合作用极为重要的细胞器，它具有独立复制的遗传物质。叶绿体DNA(cpDNA)被广泛应用于细胞质遗传、植物雄性不育、植物的系统发育、遗传多样性和亲缘关系等方面的研究。由于叶绿体及其DNA的重要功能，所以它们一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。由于难以获得足量的完整叶绿体进而得到高纯度的叶绿体DNA (cpDNA)，此项研究进展缓慢。目前，很多方法通过破碎植物体如匀浆法、超声破碎法、冻融法以及化学方法等，以获得完整叶绿体粗提液，再通过差速离心分离，密度梯度离心分离、纯化，进而提取得到叶绿体DNA。这些方法在一定程度上适用于提取高等植物 叶绿体细胞器，但海藻组织通常富含的多糖、酚类化合物，很难分离得到量大纯度高的叶绿体，并且酚类化合物极易被氧化，可在核酸分离纯化时，与核酸相互作用生成物(如醌类)能与核酸稳定的结合，从而影响核酸的分离纯化。多糖会形成难溶的胶状物，与核酸共沉淀下来，并且多糖可以抑制很多酶的活性。另有报道利用蔗糖密度梯度离心分离藻类叶绿体细胞器再用CsCl密度梯度离心分离纯化叶绿体DNA。由于藻类细胞壁比较厚不易破碎，叶绿体细胞器得率低，并且组织富含多糖多酚，分离得到叶绿体细胞器纯度不高。报道中还涉及叶绿体DNA溶液透析以去除CsCl的步骤，此步骤极易导致叶绿体DNA得率降低，并且延长提取时间。利用目前已报道的藻类叶绿体提取方法，叶绿体DNA的提取率一般在10-15 μ g/g (新鲜藻体)，提取率低下。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简便快速的藻类叶绿体DNA的提取方法，提取的藻类叶绿体DNA具有质量好、提取率高等优点。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种藻类叶绿体DNA的提取方法，其特征包括以下步骤I)选取新鲜或冷冻藻体如裙带菜或者孔石莼，洗净浙水后，称取20_60g藻体，加150-300ml缓冲液A，用组织匀浆机在0_4°C下，匀浆成藻液；2)将匀浆后的藻液用尼龙布过滤，将滤液离心处理后，弃上清液，取沉淀物；3)在沉淀物中加入10_30ml缓冲液B，在60_70°C下水浴裂解l_2h，得到裂解液；4)将裂解液用酚-氯仿-异戊醇(体积比24 26 23 25 I，体积比优选25 : 24 : I)和氯仿-异戊醇(体积比23 25 I，体积比优选24 I)处理去除变性蛋白质，再加入 CsCl 和 Hoechst 33258，以 360，000-400，OOOXg 离心力离心 6_8h，其中 CsCl与 Hoechst 33258 的加入量的终浓度为 I. 35-1. 65g/ml 和 10-30 μ g/ml ；5)迅速取出含叶绿体DNA的条带，用O. 8-1. 2M NaCl饱和异丙醇去除Hoechst33258 ；6)在去除Hoechst 33258的叶绿体DNA溶液中加入浓度2. 5-3. 5M的醋酸钠、双蒸水和异丙醇，体积比为I. 5 2. 5 I. 5 2. 5 3. 5 4. 5 4. 5 5. 5，混合均匀后混合液在_20°C下，放置20-40min ；7)将混合液以12，000-16, OOOXg离心力离心15_30min，得到的沉淀经过65-75%乙醇洗涤去杂后，即得纯的藻类叶绿体DNA，提取得到的DNA 0D260/280为I. 75-1. 85，得率为150-200 μ g/g (新鲜藻体)；其中，所述缓冲液A的组分及配比如下
Tris5.06-7.06 g/L
EDTA6.31-8.31 g/L
PEG400090-110 g/L
二硫苏糖醇1.34 1.74 g/L
醋酸钾47.07 51.07 g/L
山梨醇271.47 311.47 g/L
牛血清蛋白0.9 1.1 g/L调节pH至7-8，补充水至IL ;所述缓冲液B的组分及配比如下
Tris11.12-13.12 g/L
EDTA4.85 6.85 g/L
氯化钠80.75 94.75 g/L
十六烷基三甲基溴化铵18 22 g/L
聚乙烯吡咯烷酮3 5 g/L调节pH至7-8，补充水至1L。作为改进，所述步骤2)中的离心处理是在3，000-6，OOOXg离心力下离心5-10mino作为改进，所述步骤5)是采用注射器在紫外灯照射下，迅速取出含叶绿体DNA的条带。作为优选，所述缓冲液A的组分及配比为Tris6.06 g/L
EDTA7.31 g/L PEG4000 100 g/L 二硫苏糖醇 1.54 g/L 醋酸钾 49.07 g/L 山梨醇 291.47 g/L
牛血清蛋白I g/L调节pH至7· 5，补充水至1L。再优选，所述缓冲液B的组分及配比为
Tris12.12 g/L
EDTA5.85 g/L
氯化钠87.75 g/L十六烷基三甲基溴化铵 20 g/L
聚乙烯吡咯烷酮4 g/L调节pH至7. 5，补充水至1L。再优选，所述尼龙布为40-100目。最后，所述步骤6)中的叶绿体DNA溶液与醋酸钠、双蒸水和异丙醇的体积比优选为 2 : 2 : 4 : 5。与现有技术相比，本发明的优点在于利用高速匀浆机在低温条件下破碎藻体组织，使得细胞器的得率很高；同时通过加入醋酸钾沉淀多糖多酚，以达到藻体细胞器和多糖多酚分离的效果。在提取过程中省去差速离心分离叶绿体的步骤，节省了操作时间，提高叶绿体DNA的得率；通过稀释含CsCl的叶绿体DNA溶液，直接沉淀DNA，省去透析去除CsCl的步骤，并且减少透析过程中DNA的损耗，提高叶绿体DNA的得率。本发明的提取方法简便快速、提取率高，提取的藻类叶绿体DNA得率在150-200 μ g/g (新鲜藻体)，具有纯度高、产率高的优点，完全能够满足基因组测序、特异性酶切、RAPD、PCR和目标基因序列的克隆等常规分子生物学操作的需要。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例II)原料准备选取新鲜裙带菜藻体，洗净浙水后，称取20g藻体，加150ml缓冲液A，用组织匀浆机在0-4°C下，均匀搅碎成藻液；
2)匀浆的藻液用60目尼龙布过滤，滤液以4，000Xg离心力离心lOmin，取得沉淀物；3)收集的离心沉淀物加15ml缓冲液B在65°C，水浴Ih ；
4)裂解液利用酚-氯仿-异戊醇(体积比25 : 24 : I)和氯仿-异戊醇(体积比24 I)处理去除变性蛋白质，加入CsCl (终浓度I. 45g/ml)和Hoechst 33258 (终浓度10 μ g/ml)，380, 000 X g,离心 8h ；5)利用注射器在紫外灯照射下，迅速取出含叶绿体DNA的条带，利用含IM NaCl饱和异丙醇，去除Hoechst 33258 ；6)叶绿体DNA溶液中加入3M醋酸钠、双蒸水和异丙醇，体积比为2 : 2 : 4 : 5，混合液在_20°C下，放置30min ；7)混合液在离心力15，000 Xg离心15min，得到的沉淀经过70%乙醇洗涤去杂后，即得裙带菜叶绿体DNA，提取得到的DNA 0D260/280为I. 85，得率为180 μ g/g (新鲜藻体)。其中，所述缓冲液A的组分及配比为
Tris6.06 g/L
EDTA7.31 g/L
PEG4000100 g/L
二硫苏糖醇1.54 g/L
醋酸钾49.07 g/L
山梨醇291.47 g/L
牛血清蛋白I g/L调节pH至 . 5，补充水至IL ；所述缓冲液B的组分及配比为
Tris12.12 g/L
EDTA5.85 g/L
氯化钠87.75 g/L
十六烷基三甲基溴化铵20 g/L
聚乙烯吡咯烷酮4 g/L调节pH至7. 5，补充水至1L。实施例2I)原料准备选取新鲜孔石莼藻体，洗净浙水后，称取25g藻体，加150ml缓冲液A，用组织匀浆机在0-4°C下，均匀搅碎成藻液；2)匀浆的藻液用60目尼龙布过滤，滤液以4，000Xg离心力离心lOmin，取得沉淀物；3)收集的离心沉淀物加20ml缓冲液B在65°C，水浴I. 5h ；4)裂解液利用酚-氯仿-异戊醇(体积比25 : 24 : I)和氯仿-异戊醇(体积比24 I)处理去除变性蛋白质，加入CsCl (终浓度I. 35g/ml)和Hoechst 33258 (终浓度10 μ g/ml)，380, OOO X g,离心 8h ；
5)利用注射器在紫外灯照射下，迅速取出含叶绿体DNA的条带，利用含IM NaCl饱和异丙醇，去除Hoechst 33258 ；6)叶绿体DNA溶液中加入3M醋酸钠、双蒸水和异丙醇，体积比为2 : 2 : 4 : 5，混合液在_20°C下，放置30min ；7)混合液在离心力14，000 Xg离心20min，得到的沉淀经过70%乙醇洗涤去杂后，即得孔石莼叶绿体DNA，提取得到的DNA 0D260/280为I. 84，得率为186 μ g/g (新鲜藻体)。
其中缓冲液A、B的配比同实施例I。本发明提取的叶绿体DNA得率在150-200 μ g/g (新鲜藻体)。通过PCR法扩增核DNA保守基因序列(18S rDNA)和叶绿体DNA保守基因序列(rbcL)检测叶绿体DNA的纯度，结果显示提取的叶绿体DNA不含核DNA成分，说明提取的叶绿体DNA纯度很高。
权利要求
1.一种藻类叶绿体DNA的提取方法，其特征包括以下步骤 1)选取新鲜或冷冻藻体，洗净浙水后，称取20-60g藻体，加150-300ml缓冲液A，用组织匀浆机在0-4°C下，匀浆成藻液； 2)将匀浆后的藻液用尼龙布过滤，将滤液离心处理后，弃上清液，取沉淀物； 3)在沉淀物中加入10-30ml缓冲液B，在60-70°C下水浴裂解l_2h，得到裂解液； 4)将裂解液用体积比24 26 23 25 I的酚-氯仿-异戊醇和体积比23 25 I的氯仿-异戊醇处理去除变性蛋白质，再加入CsCl和Hoechst 33258，以360，000-400，OOOXg离心力离心8_12h，其中CsCl与Hoechst 33258的加入量为终浓度I.35-1. 65g/ml 和 10-30 μ g/ml ； 5)迅速取出含叶绿体DNA的条带，用O.8-1. 2M NaCl饱和异丙醇去除Hoechst33258 ； 6)在去除Hoechst33258的叶绿体DNA溶液中加入浓度2. 5-3. 5M的醋酸钠、双蒸水和异丙醇，体积比为I. 5 2. 5 I. 5 2. 5 3. 5 4. 5 4. 5 5. 5，混合均匀后混合液在-20°C下，放置 20-40min; 7)将混合液以12，000-16，OOOXg离心力离心15-30min，得到的沉淀经过65-75%乙醇洗涤去杂后，即得纯的藻类叶绿体DNA ； 其中，所述的缓冲液A的组分及配比如下 Tris5.06 7.06g/L EDTA6.31 8.31 g/L PEG400090 110g/L 二硫苏糖醇1.34 1.74 g/L醋酸钾47.07 51.07g/L山梨醇271.47 311.47 g/L 牛血清蛋白0.9~l.lg/L 调节pH至7-8，补充水至IL ； 所述的缓冲液B的组分及配比如下Tris11.12-13.12g/LEDTA4.85 ~6.85g/L氯化钠80.75 ~94.75g/L 十六烷基三甲基溴化铵 18 22 g/L 聚乙烯吡咯烷酮3 5 g/L 调节pH至7-8，补充水至1L。
2.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于所述步骤2)中的离心处理是在3, 000-6, OOOXg 离心力下离心 5-lOmin。
3.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于所述步骤5)是采用注射器在紫外灯照射下，迅速取出含叶绿体DNA的条带。
4.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于所述缓冲液A的组分及配比为Tris6.06 g/L EDTA7.31 g/L PEG4000100 g/L 二硫苏糖醇1.54 g/L 醋酸钾49.07 g/L 山梨醇291.47 g/L牛血清蛋白I g/L 调节pH至7. 5，补充水至1L。
5.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于所述缓冲液B的组分及配比为 Tris12.12 g/L EDTA5.85 g/L 氯化钠87.75 g/L 十六烷基三甲基溴化铵 20 g/L 聚乙烯吡咯烷酮4 g/L 调节pH至7. 5，补充水至1L。
6.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于所述尼龙布为40-100目。
7.根据权利要求I所述的提取方法，其特征在于所述步骤6)中的叶绿体DNA溶液与醋酸钠、双蒸水和异丙醇的体积比为2 : 2 : 4 : 5。
全文摘要
本发明涉及一种藻类叶绿体DNA的提取方法，新鲜或冷冻藻体为原料，用组织匀浆机匀浆，加入缓冲液A以3,000-6,000×g离心力离心处理，取沉淀物，加入缓冲液B，在60-70℃下水浴裂解1-2h，裂解液去除变性蛋白质，加入CsCl和Hoechst 33258，以360,000-400,000×g离心力离心8-12h，取出含叶绿体DNA条带去除Hoechst 33258，加入2.5～3.5M醋酸钠、双蒸水和异丙醇，在-20℃下放置20～40min，离心力12,000-16,000×g离心15-30min，得到的沉淀纯化后，即得到藻类叶绿体DNA。与现有技术相比，本发明简化了提取步骤，操作简单易行，提高了藻类叶绿体DNA的提取率和纯度，提取的藻类叶绿体DNA得率在150-200μg/g(新鲜藻体)，且完全能够满足基因组测序、特异性酶切、RAPD、PCR和目标基因序列的克隆等常规分子生物学操作的需要。
文档编号C12N15/10GK102732503SQ20111008537
公开日2012年10月17日 申请日期2011年3月30日 优先权日2011年3月30日
发明者付万冬, 姚建亭, 杨会成, 段德麟, 王秀良, 郑斌, 钟明杰 申请人:浙江省海洋开发研究院