捕光色素叶绿素a/b结合蛋白LHCB6在植物育种中的应用的制作方法

专利名称：捕光色素叶绿素a/b结合蛋白LHCB6在植物育种中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种捕光色素叶绿素a/b结合蛋白LHCB6在植物育种中的应用。
背景技术：
捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHCB)是光合系统II (PSII)复合体的载脂蛋白。LHCB 蛋白通常与叶绿素、叶黄素组成复合体成为光合系统的捕光天线复合体。这些捕光天线复合体吸收光能并且向PSII光反应中心传递激发能以驱动光合电子传递系统。PSII复合体的外部天线蛋白LHCBs是捕光复合体重要的组成部分，它是自然界中含量最丰富的膜蛋白。LHCBs蛋白由较小的天线复合体LHCB4(CP^)，LHCB5(CP26)和LHCB6 (CP24)以及较大的天线复合体同源和异源的三聚体LHCB1，LHCB2和LHCB3。这些叶绿体/类囊体蛋白由核基因编码，其表达主要受到环境和发育等因素调节，包括主要受到光(Silverthorne and Tobin, 1984 ；Sun and Tobin, 1990 ；Peer et al, 1996 ；Millar and Kay,1996 ；Weatherwax et al,1996 ；Yang et al,1998 ；Ημ Mbeck and Krupinska,2003 ；Nott et al,2006 ；Staneloni et al,2008 ；De Montaigu et al,2010 ； Pruneda-Paz and Kay,2010 ；Thines and Harmon,2010)；活性氧(Nott et al，2006; Staneloni et al，2008)，叶绿体逆向信号(Nott et al，2006)，昼夜节律(Paulsen and Bogorad,1988 ；Strayer et al,2000 ；Alabadi et al,2001 ；Thain et al,2002 ；Andronis et al,2008 ；Pruneda-Paz et al,2009 ；De Montaigu et al, 2010 ；Pruneda-Paz and Kay, 2010 ；Thines and Harmon, 2010)和生物激素脱落酸(ABA)的调控(Bartholomew et al, 1991 ；Chang and Walling, 1991 ；Weatherwax et al, 1996 ；Staneloni et al，2008)。植物对LHCB蛋白表达的调节被认为是植物调节叶绿体功能以应对逆境的重要机制之一(Nott et al,2006 ；De Montaigu et al, 2010 ；Pruneda-Paz and Kay,2010 ；Thines and Harmon, 2010)。ABA是调节植物生长与发育的重要生物激素，尤其在植物响应逆境方面起到重要作用(Finkelstein et al,2002 ；Adie et al，2007)。以前人们认为 ABA 负调控 LHCB 基因的表达，并且与光协同作用调节LHCB的表达以响应强光逆境(Bartholomew et al,1991 ； Chang and Walling, 1991 ；Weatherwax et al, 1996 ；Staneloni et al，2008)。强光调低 LHCB的表达可能是通过植物体内ABA浓度的改变而实现的(Weatherwax et al，1996)。然而ABA对于LHCB基因表达的生理意义并没有被完全理解。ABA信号转导过程得到了广泛的研究，人们鉴定得到了许多参与其中的组成成分， 这其中包括位于细胞膜和细胞内的ABA受体。质膜蛋白GCR2和GTG1/GTG2被认为是在细胞表面起作用的ABA受体。一类START蛋白PYR/PYL/RCAR被认为是作用于细胞内的ABA受体，直接作用于PP2C信号通路的上游以调节下游基因的表达。已经报道过拟南芥中镁卟啉 IX(Mg-ProtoIX)螯合酶的H亚基(CHLH/ABAR)作为ABA受体可以结合ABA，作用于ABA信号转导过程。最近，又报道了 ABAR可以结合一组WRKY转录因子抑制一些ABA响应基因的表达，如ABI5。事实上，ABA被认为是植物将昼夜节律和受ABA调控从而响应干旱环境之间的一个关键环节。ABAR/CHLH在植物细胞中还起到许多作用在叶绿素合成过程中催化镁离子与卟啉IX的结合，作为基因组解偶联蛋白(GUN5)介导质体-核逆向信号转导过程。ABAR/CHLH不仅是ABA受体，也在叶绿体逆向信号中具有GUN表型参与调节LHCB 基因的表达。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种控制植物性状的方法。本发明提供控制植物性状的方法，是提高出发植物中LHCB6蛋白编码基因的表达，得到具有下述1)或幻特征的目的植物1)耐逆性高于所述出发植物；2)生长延缓于所述出发植物。所述目的植物生长延缓于所述出发植物为如下A或B :A、所述目的植物种子的萌发迟于所述出发植物；B、所述目的植物根的生长迟于所述出发植物；所述目的植物种子的萌发迟于所述出发植物体现为所述目的植物种子的萌发率低于所述出发植物；所述目的植物种子的根的生长迟于所述出发植物体现为所述目的植物根长小于所述出发植物；所述提高出发植物中LHCB6编码基因的表达是在激素胁迫下进行；所述激素具体为ABA;所述LHCB6蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。所述耐逆性为耐干旱性；所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物为拟南芥。所述提高出发植物中LHCB6编码基因的表达是通过向出发植物中导入所述LHCB6 编码基因实现的。所述ABA胁迫为在植物幼苗期或者植物成龄期进行；所述在植物幼苗期ABA胁迫的浓度为0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA胁迫的浓度具体为 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成龄期ΑΒΑ胁迫的浓度低于200μΜ但不为ΟμΜ，具体为20 μ Μ、 50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ Μ、200 μ Μ、300 μ Μ。所述耐干旱性通过气孔开度和/或失水率体现；所述根生长通过主根长度体现。所述提高LHCB6编码基因的表达是通过外源ABA激活ABAR-WRKY40信号通路实现。所述激活ABAR-WRKY40信号通路为外源的ABA激活植物的ABA受体，使ABA受体与结合有转录因子WRKY40的LHCB6启动子竞争结合转录因子WRKY40，释放LHCB6的启动子，使LHCB6编码基因表达；所述ABA受体的氨基酸序列为序列表中的序列2 ；
所述ABA受体的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；所述转录因子WRKY40的氨基酸序列为序列表中的序列4 ；所述转录因子WRKY40的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；所述LHCB6启动子的核苷酸序列为序列表中的序列6。本发明的另一个目的是提供一种控制植物性状的方法。本发明提供的方法，是降低目的植物中LHCB6蛋白编码基因的表达，得到具有下述1)或幻特征的植物1)耐逆性低于所述目的植物；2)生长加快于所述目的植物。所述植物的生长加快于所述出发植物为如下A或B :A)所述植物的种子的萌发早于所述目的植物；B)所述植物的根的生长早于所述目的植物；所述植物的种子的萌发早于所述目的植物体现为所述植物的种子的萌发率大于所述目的植物；所述植物的根的生长早于所述目的植物体现为所述植物的根长大于所述目的植物；所述降低目的植物中LHCB6蛋白编码基因的表达是在激素胁迫下进行；所述激素具体为ABA ；所述LHCB6蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1 ；所述耐逆性为耐干旱性；所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物为拟南芥；所述ABA胁迫为在植物幼苗期或者植物成龄期进行；所述在植物幼苗期ABA胁迫的浓度为0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA胁迫的浓度具体为 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成龄期ΑΒΑ胁迫的浓度低于200μΜ但不为ΟμΜ，具体为20 μ Μ、 50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ Μ、200 μ Μ、300 μ M ; 所述耐干旱性具体通过气孔开度和/或失水率体现；所述根生长具体通过主根长度体现；所述降低LHCB6编码基因的表达是通过外源ABA激活ABAR-WRKY40信号通路实现；
所述激活ABAR-WRKY40信号通路具体为外源的ABA激活植物的ABA受体，使ABA 受体与结合有转录因子WRKY40的LHCB6启动子竞争结合转录因子WRKY40，释放LHCB6的启动子，使LHCB6编码基因表达；所述ABA受体的氨基酸序列为序列表中的序列2 ；所述ABA受体的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；所述转录因子WRKY40的氨基酸序列为序列表中的序列4 ；所述转录因子WRKY40的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；所述LHCB6启动子的核苷酸序列为序列表中的序列6。本发明的第三个目的是提供提高一种植物耐逆性或延缓植物生长的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤用ABA对植物进行胁迫，得到具有如下性状的植物1)目的植物耐逆性高于出发植物；2)目的植物的生长延缓于出发植物；将处理前的植物记作出发植物，将处理后的植物记作目的植物。所述ABA胁迫为在植物幼苗期或者植物成龄期进行；所述在植物幼苗期ABA胁迫的浓度为0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA胁迫的浓度具体为 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成龄期ΑΒΑ胁迫的浓度低于200 μ Μ，具体为20 μ Μ、50 μ Μ、100 μ Μ、 150μΜ、200μΜ、300μΜ ；所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物为拟南芥。所述特征还体现在如下1)-6)中任一一种1)在ABA胁迫下，野生型植物耐逆性高于LHCB6蛋白表达失活的突变体lhcb6 ；2)在ABA胁迫下，LHCB6蛋白过表达植物耐逆性高于野生型植物；所述LHCB6蛋白过表达植物为将LHCB6蛋白的编码基因导入野生型植物，得到 LHCB6蛋白过表达植物；3)在ABA胁迫下，野生型植物的种子的萌发率低于LHCB6蛋白表达失活的突变体 lhcb6 ；4)在ABA胁迫下，LHCB6蛋白过表达植物种子的萌发率低于野生型植物；5)在ABA胁迫下，野生型植物的根长低于LHCB6蛋白表达失活的突变体lhcb6 ；6)在ABA胁迫下，LHCB6蛋白过表达植物根长低于野生型植物。本发明的实验证明，ABA调节LHCB6的表达是通过ABAR/CHLH参与的信号通路，各个LHCB家族成员的正常表达需要ABA的参与，并且生理水平内高浓度的ABA促进LHCB的表达，WRKY40作为负调节子直接作用于LHCB基因，LHCB通过ABAR-WRKY40介导的信号通路参与ABA信号转导过程，是ABA信号转导过程中的一个正调节子，响应ABA调节的种子萌发、幼苗生长和气孔运动等表型。


图1为LHCB6过表达和RNAi株系的荧光定量PCR检测图2为ABA刺激LHCBs的mRNA和蛋白的表达图3为ABA刺激LHCB6在种子萌发和幼苗生长方面表型
图4为ABA刺激LHCB6对气孔运动和干旱胁迫的影响图5为ABA刺激LHCB6对萌发率、气孔运动和干旱胁迫的影响图6为过表达LHCB6基因使种子萌发对ABA超敏图7为35S驱动LHCBs基因在Ihcbs突变体中表达，恢复植株的表型图8为ABA刺激下LHCB基因完全表达图9为LHCBs基因在不同的组织器官中表达图10为转录抑制子WRKY40与LHCB家族成员的启动子结合图11为WRKY40抑制LHCB基因的表达
图12为abar-3突变体中LHCB基因的表达图13为Ihcb双突变体及Ihcbcch双突变体的分子和生化检测图14为Ihcb突变体中ROS稳态及一系列ABA响应基因的表达图15为LHCB2基因表达量降低使wrky40突变体对ABA的敏感性部分恢复到野生型状态图16为突变体lhcbl-6的分子和生化鉴定。图17为不同Ihcb突变体中内源ABA含量及干物质含量测定图18为wrky40及wrky40wrkyl8突变体没有gun表型图19为LHCBs蛋白响应生理水平浓度ABA而增加的一个模式图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的材料如下1、T-DNA 插入突变体包括 LHCB1. 1 基因(Atlg29920)的 lhcbl. 1 (SALK-134810) (以下简称lhcbl，将野生型拟南芥中的LHCBl基因通过T-DNA插入进行敲除突变得到的，其余基因没有变化)，LHCB2.2基因(At2g05070)的lhcb2. 2 (SALK-005614)(以下简称lhcb2，将野生型拟南芥中的LHCB2基因通过T-DNA插入进行敲除突变得到的，其余基因没有变化)，LHCB3基因(At5g54270，将野生型拟南芥中的LHCB3基因通过T-DNA 插入进行敲除突变得到的，其余基因没有变化)的lhcb3 (SALK-036200)，LHCB4. 3基因 (At2g40100)的lhcb4. 3 (SALK-032779)(以下简称lhcb4，将野生型拟南芥中的LHCB4基因通过T-DNA插入进行敲除突变得到的，其余基因没有变化)，LHCB5基因(At4gl0340)的 lhcb5(SALK-139667，将野生型拟南芥中的LHCB5基因通过T-DNA插入进行敲除突变得到的，其余基因没有变化)，LHCB6基因(Atlgl5820)的lhcb6 (SALK-074622，将野生型拟南芥中的LHCB6基因通过T-DNA插入进行敲除突变得到的，其余基因没有变化)，这些突变体的种子均购自ABRC。2、wrky40-l (ET5883,Ler生态型背景，以下简称wrky40突变体)购自冷泉港实验室，该突变体在WRKY40(Atlg80840)基因的第二个外显子有一个Ds转座子插入。wrky40_l 突变体是通过回交从Ler背景转变成Col背景。wrkyl8-l (SALK-093916)购自 ABRC，是 WRKY18 (At4g31800)基因第一个外显子上的T-DNA插入敲除突变体，这两个突变体之前已经鉴定过是两个无效等位基因。3、双突变所有双突变体都经过杂交和PCR鉴定得到双突变体构建方法将一种突变体未开花的花苞用镊子去除其雄蕊仅剩雌蕊，取下另一种突变体中开花或未开花的花苞中的雄蕊，在剥离剩余的雌蕊柱头上摩擦，使花粉充分接触柱头，将此雌蕊做标记，荚果成熟后得到杂交Fl代种子，将Fl代种子再次播种，F2代生长，经PCR鉴定可得到纯合体。4、cch突变体(Col背景，ABA受体的突变体)(Shen Y-Y,Wang X-F,ffu F-QjDu S-Y, Cao Z, Shang Y，Wang X-L,Peng C-C,Yu X-C,Zhu S-Y,Fan R-C,Xu Y-H,Zhang D-P(2006). The Mg-chelatase H subunit is an abscisic acid receptor. Nature 443 :823-826,公众可从清华大学获得。)由J. Chory博士馈赠。5、ABA 合成突变体 aba2 (CS156 :aba2_l，Col 背景，ABA 受体)购自 ABRC。植物生长条件MS培养基在光照培养箱中19_20°C，光强为80 μ molm-2^，土中生长时光照强度为120 μ Hiolm-2S-1,16h光照。6、过表达拟南芥和RNAi拟南芥1)、LHCB6 过表达载体 pCAMBIA1300_LHCB6提取哥伦比亚(Col-O)生态型为背景的拟南芥植株(ABRC :CS60000,以下简称野生型拟南芥，记作col)的基因组DNA，以下列引物进行PCR扩增forward primer :5，-GCTCTAGAATGGCGATGGCGGTCTCC-3，reverse primer :5，-CGGTCGACTCACAAACCAAGAGCACCGAG-3，得到777bp的PCR产物，经过测序，该产物的为序列表中的序列1(LHCB6基因的 ORF 是 777bp)。将PCR产物经^CbaI和Mil酶切，得到酶切后产物与经过同样酶切得到的 pCAMBIAl300(Shang Y,Yan L,Liu ZQ，Cao Z，Mei C,Xin Q,Wu FQ，Wang XF,Du SY, Jiang Τ,Zhang XF,Zhao R,Sun HL, Liu R,Yu YT,Zhang D-P(2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ABA-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935含有花椰菜花叶病毒的35S启动子和绿色荧光蛋白(GFP)，公众可从清华大学获得。)载体大片段连接，得到连接产物转化大肠杆菌，提取转化子质粒，测序为将序列表中的序列1 (LHCB6基因的0RF)插入pCAMBIA1300的 XbaI和Mil酶切位点间得到的载体，命名为pCAMBIA1300-LHCB6。2)、LHCB6 的 RNAi 干扰载体 pSK-int_LHCB6-R提取哥伦比亚(Col-O)生态型为背景的拟南芥植株的基因组DNA，以下列引物进行PCR扩增forward primer :5，-CGGTCGACATGGCGATGGCGGTCTCC-3，reverse primer :5，-CCATCGATCGAGCCATCGAGCCATTCAG-3，得到228bp的片段(序列1自5’末端第1_2观位)，经过测序，该PCR产物具有 AF332425的第182-410位核苷酸，为LHCB6的cDNA起始密码子后1至228bp特异结合的 228-bp的片段。将上述228bp的片段用Sall/Clal酶切后，与经过同样酶切得到的pSK-int载体 (Shen Y-Y，Wang X-F，Wu F-Q，Du S-Y，Cao Z, Shang Y, Wang X-L，Peng C-C，Yu X-C，Zhu S-Y, Fan R-C, Xu Y-H, Zhang D-P (2006). The Mg-chelatase H subunit is an abscisic acid receptor. Nature 443 :823_826，公众可从清华大学获得。)片段连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将228bp的片段正向插入pSK-int载体的Sall/Clal酶切位点间得到的载体，命名为 pSK-int-228。将228bp的片段用EcoRIAbaI酶切后，与经过同样酶切得到的pSK-int-2^载体连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将228bp的片段反向插入pSK-int-2^载体的Sall/Clal酶切位点间得到的载体，命名为pSK-int-LHCB6-R，将质粒为将228bp的片段正向、反向插入pSK-int-228载体中，为RNAi干扰载体。3)、LHCB6过表达拟南芥、RNAi转LHCB6拟南芥、LHCB6 cch过表达拟南芥的获得将上述过表达载体pCAMBIA1300-LHCB6和RNAi干扰载体pSK-int_LHCB6-R分别转化入根癌农杆菌 GV3101 菌株(Shang Y, Yan L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P(2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935，公众可从清华大学获得。)，得到重组菌1和重组菌2。分别提取重组菌1和重组菌2的质粒，分别测序， 结果为重组菌1的质粒为PCAMBIA1300-LHCB6，重绍菌2的质粒为pSK-int_LHCB6-R，将重组菌 1 命名为 GV3101/pCAMBIA1300-LHCB6，将重组菌 2 命名为 GV3101/pSK-int_LHCB6-R。将GV3101/pCAMBIA1300-LHCB6 和 GV3101/pSK-int-LHCB6-R 分别通过花苞渗透法侵染野生型拟南芥，得到TO代LHCB6过表达拟南芥和TO代RNAi转LHCB6拟南芥。将GV3101/pCAMBIA1300-LHCB6通过花苞渗透法侵染cch突变体，得到TO代LHCB6 cch过表达拟南芥。分别从TO代LHCB6过表达拟南芥、TO代RNAi转LHCB6拟南芥、TO代LHCB6 cch 过表达拟南芥上收获种子、播种，继续传代，直到分别得到T3代LHCB6过表达拟南芥、T3代 RNAi转LHCB6拟南芥、T3代LHCB6 cch过表达拟南芥待用。提取T3代LHCB6过表达拟南芥、T3代RNAi转LHCB6拟南芥、T3代LHCB6 cch过表达拟南芥的RNA，反转录得到cDNA为模板，进行荧光定量检测，以LHCB6 forward primer 5' -GCGATGGCAGCGGTTCTTG-3' reverse primer 5，-CCATGGCGTTGCCCACTCA-3，为引物，以 β -Actin为内参；内参的引物为 forward primer :5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，；reverse primer 5’ -AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’ ；每一个数值都是三次独立生物学重复的平均值。以野生型拟南芥col和cch突变体为对照。结果如图IA所示，荧光定量PCR检测四个LHCB6过表达拟南芥株系(0E1，0E2, 0E5，0E8)和三个 RNAi 转 LHCB6 拟南芥(R8，R9，R18)株系，col、0El、0E2、0E5、0E8、R8、R9、 R18 中的 LHCB6 基因的 mRNA 相对表达量分别为 0. 85、1. 05、1. 30、1. 45、1. 10,0. 38,0. 45、 0. 30 ；与野生型拟南芥col中的表达量相比，在过表达株系中升高，RNAi株系中降低。LHCB6 在 cch 过表达的三个转基因株系(cch/LHCB6_4，cch/LHCB6_5，and cch/ LHCB6-10)中的 LHCB6 的 mRNA 相对表达量结果如图 IB 所示，col、cch、cch/LHCB6_4，cch/ LHCB6-5, and cch/LHCB6_10 分别为 0. 82,0. 58,0. 90,0. 90、1. 00 ；结果显示转基因株系中与野生型相当。7、Ihcbs突变体的互补拟南芥的获得提取哥伦比亚(Col-O)生态型为背景的拟南芥植株(ABRC，CS60000)的基因组 DNA,以下列引物进行PCR扩增forward primer 5' -TCCCCCGGGATGGCCGCCTCAACAATGG-3，(SmaI)reverse primer :5，-ACGCGTCGACTCACTTTCCGGGAACAAAGTTG-3，(Sail)得到777bp的PCR产物，经过测序，该产物具有序列表中的序列1 (LHCB6基因的0RF)所示的核苷酸。将PCR产物经SmaI和Mil酶切，得到酶切后产物，将该酶切后产物与经过同样酶切的 PCAMBIA1300-221 载体(Shang Y, Yan L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P(2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935，公众可从清华大学获得。)连接，得到转化子，提取转化子的质粒，经过测序，该质粒为将序列表中的序列1 (LHCB6基因的0RF)插入pCAMBIA1300_221载体的SmaI和Mil酶切位点间得到的载体,命名为 pCAMBIA1300-221-LHCB6。将pCAMBIA1300-221-LHCB6转入根癌农杆菌GV3101菌株，得到重组菌3，提取质粒送去测序，结果为重组菌3的质粒为pCAMBIA1300-221-LHCB6，将重组菌3命名为GV3101/ PCAMBIA1300-221-LHCB6。将GV3101/pCAMBIA1300-221-LHCB6通过花苞渗透法侵染突变体lhcb6，得到TO代 LHCB6互补拟南芥。将TO代LHCB6互补拟南芥收种、播种，继续传代，直到得到T3代LHCB6互补拟南芥，即为Ihcbs突变体的互补拟南芥，记作lhcb6*。8、chl-1为叶绿素合成突变体，购自拟南芥生物资源中心ABRC，CS3119。下述实施例中的实验均为三次重复，涉及定量试验的均为三次实验取平均值。实施例1、在ABA的胁迫下LHCB6表达影响植物种子萌发、幼苗生长及耐旱一、外源施加低浓度ABA (相当于生理条件高浓度ABA)对LHCB6 mRNA和蛋白水平表达的影响分别在植物发育的两个阶段进行ABA处理幼苗期和成龄期。幼苗期普通MS培养基生长三天的野生型拟南芥(col) (ABRC, CS60000)幼苗移至含O、0. 5、1、3、5或IOyM的ABA的培养基(ABA+MS培养基)中再生长两周；成龄期移至土壤中的野生型拟南芥幼苗生长三周后喷施不同浓度的ABA溶液 (配置IOml不同浓度的ABA水溶液)生长5h。mRNA 表达的具体检测方法参照 Biofcid Real-Time System CFX96TM ClOOO Thermal Cycler(Singapore)仪器说明书对LHCB6的mRNA水平的表达进行RT-PCR检测，模板为植株的 cDNA，引物为 forward primer :5，-GCGATGGCAGCGGTTCTTG-3，；reverse primer :5，-CCATGGCGTTGCCCACTCA-3，，内参为 β-Actin:内参的引物为 forward primer :5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，；reverse primer 5， -AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，。LHCB6蛋白表达的具体检测方法将植物组织(整个植株)在液氮中速冻，用预冷好的研磨钹与研磨棒将材料在液氮中磨成粉末，装入1.5mL离心管中。提取缓冲液成分为 50mMTris-HCl，pH 7. 5,150mMNaCl, ImM EDTA,0. 1% (v/v)Triton X-100,10% (ν/ν) glycerol，并加入蛋白酶抑制剂。按照提取缓冲液与样品4 1的比例加入离心管，并迅速放入液氮中速冻。利用细胞破碎超声仪将混合物超声处理至完全解冻，然后再次放入液氮内速冻。上述步骤重复三次。将混合物IOOOOg离心3分钟，除去不溶物和未破碎的细胞。将上清液转移至新离心管待用，即为LHCB6蛋白。将LHCB6蛋白进行SDS-PAGE和免疫印记，具体的实验步骤参照已发表的论文 (ffu F-Q, Xin Q, Cao Z, Liu Z-Q, Du S-Y, Mei C, Zhao C-X, Wang X-F, Shang Y, Jiang T, Zhang X-F, Yan L, Zhao R, Cui Z-N, Liu R, Sun H-L, Yang X-L, Su Z, Zhang D-P(2009). The Mg-chelatase H subunit binds abscisic acid and functions in abscisic acid signaling:New evidence in Arabidopsis. Plant Physiol 150 :1940-1954), LHCB6 的特异抗体购自 Agrisera(Stockholm, Sweden ；website :www. agrisera. com ；product No.AS01010。)。结果如图2所示，图2A 幼苗中0 IlJ 5 μ M ABA处理后LHCB6的mRNA表达水平升高，但10 μ M ABA 处理后LHCB6的mRNA表达水平降低。将三天的野生型幼苗，移到含不同浓度ABA的培养基上，继续生长两周取样检测(具体的检测方法见上述mRNA表达检测)。每组数据都是三次独立生物学重复的平均值。O μ M ABA处理，LHCB6的mRNA相对表达量为0. 40 ；0. 5 μ M ABA 处理，LHCB6 的 mRNA 相对表达量为 0. 70 ；1 μ M ABA处理，LHCB6的mRNA相对表达量为1. 00 ；2 μ M ABA处理，LHCB6的mRNA相对表达量为0. 98 ；3 μ M ABA处理，LHCB6的mRNA相对表达量为0. 95 ；5 μ M ABA处理，LHCB6的mRNA相对表达量为1. 00 ；10 μ M ABA 处理，LHCB6 的 mRNA 相对表达量为 0. 10 ；图2B 成龄苗中低于200 μ M ABA处理使LHCB6的mRNA表达水平升高，但高于 200 μ M ABA处理使LHCB6的mRNA表达水平降低。ABA溶液喷施三周龄的植株5小时后取样检测(具体的检测方法见上述mRNA表达检测)。每组数据都是三次独立生物学重复的平均值。0 μ M ABA处理，LHCB6的mRNA相对表达量为1. 20 ；20 μ M ABA 处理，LHCB6 的 mRNA 相对表达量为 1. 35 ；50ABA处理，LHCB6的mRNA相对表达量为2. 00 ；100 μ M ABA 处理，LHCB6 的 mRNA 相对表达量为 1. 20 ；150 μ M ABA 处理，LHCB6 的 mRNA 相对表达量为 1.15;
200 μ M ABA 处理，LHCB6 的 mRNA 相对表达量为 1. 00 ；300 μ M ABA 处理，LHCB6 的 mRNA 相对表达量为 0. 75。图2C 幼苗中0到5 μ MABA处理后LHCB6的蛋白表达水平升高，但10 μ M ABA处理后LHCB6的蛋白表达水平降低。材料处理同(A)。Actin为上样对照，实验三次重复得到相似的结果。检测方法具体见LHCB蛋白表达检测。图2D 成龄苗中低于200 μ M ABA处理使LHCBs (LHCB1 6)的蛋白表达水平升高，但高于200 μ M ABA处理使LHCBs (LHCB1 6)的蛋白表达水平降低。材料处理同(B)。 Actin为上样对照，实验三次重复得到相似的结果。检测方法具体见LHCB蛋白表达检测。
从上述可以看出在幼苗期，0. 5至5μΜ的ABA浓度促进LHCB6的mRNA表达， 10 μ M时表达量下降(图2Α)。在成龄期，低于200 μ M的ABA浓度处理拟南芥促进LHCB6 的mRNA表达，高于200 μ M时，LHCB6的mRNA表达量下降，50 μ M的ABA是促进LHCB6表达的最适浓度(图2Β)。进一步研究ABA对LHCB蛋白表达的影响。在幼苗期，LHCB蛋白表达对于ABA处理的响应与mRNA水平完全一致，表达量在1至3 μ M处理时达到最大(图2C)。在成龄期， 从20至300 μ M均促进LHCB蛋白的表达，随着ABA浓度的增加，表达量增加(图2D)，这与 mRNA的表达不同(图2B)。实验结果表明，LHCB的表达在转录与翻译水平受到不同的调节。总之，以上数据基本说明，外源施加的低浓度，相当于生理条件下高浓度ABA，促进而不是抑制LHCB的表达。二、提高出发植物中LHCB6编码基因的表达检测种子的萌发率和根长变化1、种子萌发实验将待测植物的约100粒种子消毒分三份播在MS培养基(Sigma，St. Louis,MO,USA ； full-strength MS)。培养基含有3%蔗糖和0. 8%琼脂粉(pH 5. 9)并含有0、0. 5、1 μ M的 ΑΒΑ。种子在4°C条件下春化3天，然后放在20°C光照条件下生长，在标示的时间记录萌发 (根的出现)的数据。上述待测植物为IhcM突变体、野生型拟南芥col、双突变体lhcbl lhcb6(双突变体构建方法将Ihcbl未开花的花苞用镊子去除其雄蕊仅剩雌蕊，取下IhcM中开花或未开花的花苞中的雄蕊，在Ihcbl雌蕊柱头上摩擦，使花粉充分接触柱头，将此雌蕊做标记， 荚果成熟后得到杂交Fl代种子，将Fl代种子再次播种，F2代生长，经PCR鉴定可得到纯合体)、lhcb6-i (RNAi转LHCB6拟南芥)、双突变体lhcb4 lhcb6 (双突变体构建方法将Ihcb 未开花的花苞用镊子去除其雄蕊仅剩雌蕊，取下lhcb6中开花或未开花的花苞中的雄蕊， 在lhcb4雌蕊柱头上摩擦，使花粉充分接触柱头，将此雌蕊做标记，荚果成熟后得到杂交Fl 代种子，将Fl代种子再次播种，F2代生长，经PCR鉴定可得到纯合体)、LHCB6 (LHCB6过表达拟南芥)、cch突变体、lhcb6 cch (双突变体构建方法将cch未开花的花苞用镊子去除其雄蕊仅剩雌蕊，取下lhcb6中开花或未开花的花苞中的雄蕊，在cch雌蕊柱头上摩擦，使花粉充分接触柱头，将此雌蕊做标记，荚果成熟后得到杂交Fl代种子，将Fl代种子再次播种，F2代生长，经PCR鉴定可得到纯合体)、cch/LHCB6 (将LHCB6基因的ORF全长序列(序列1)整合到35S启动子驱动的pCAMBIA1300-221载体中，引入cch突变体中)、chl_l (拟南芥生物资源中心ABRC，CS3119)。每一个数值都是三次独立生物学重复的平均值。结果如图3A-3D、图5A-5C和图6所示，从图3A可以看出，IhcM在ΟμΜ的ABA的培养基中，24、36、48、60、7浊的萌发率分别为 38 % UOO %, 100 % UOO %, 100 % ；在 0. 5μΜ 的 ABA 的培养基中，24、36、48、60、72h 的萌发率分别为20%,78%,97%,100%,100% ；在1 μ M的ABA的培养基中，24、洸、48、60、 72h 的萌发率分别为 5%,60%,80%,98%,100% ；lhcb6-i (RNAi 转 LHCB6 拟南芥)在 0 μ M 的 ABA 的培养基中，24、36、48、60、72h 的萌发率分别为30%、98%、100%、100%、100%;在0.5“] 的484的培养基中，24、36、48、60、72h的萌发率分别为37%、58%、90%、100%、100%在ΙμΜ的ABA的培养基中，24、36、48、 60、72h 的萌发率分别为 2%,57%,78%,88%,100% ；chl-1在ΟμΜ的ABA的培养基中，24、36、48、60、72h的萌发率分别为10%,80%, 98%,100%,100% ；在0. 5μΜ的ABA的培养基中，24、36、48、60、72h的萌发率分别为1%> 30%、72%、90%、100%在1 μ M的ABA的培养基中，24、36、48、60、72h的萌发率分别为0%, 20%,43%,75%,84% ；col在ΟμΜ的ABA的培养基中，24、36、48、60、72h的萌发率分别为10%,78%, 98%,100%,100% ；在0. 5μ M的ABA的培养基中，24、36、48、60、72的萌发率分别为0%, 22%、70%、86%、100%在ΙμΜ的ABA的培养基中，24、36、48、60、72h的萌发率分别为0%、 17%,35%,70%,83% ；从图IBB可以看出，lhcb6单突变体在Ομ M的ABA的培养基中，24、36、48、60、72h的萌发率分别为 10%,90% ,100% ,100% ,100% ；在 0. 5μ M 的 ABA 的培养基中，24、36、48、60、72h 的萌发率分别为 18%、75%、98%、100%、100%在 ΙμΜ的ABA 的培养基中，24、36、48、60、72h 的萌发率分别为 10%,65%,82%,98%,100% ；双突变体lhcbl IhcM在ΟμΜ的ABA的培养基中，24、36、48、60、7浊的萌发率分别为 10%,90%,98% ,100% ,100% ；在 0. 5μ M 的 ABA 的培养基中，24、36、48、60、72h 的萌发率分别为8 %、50 %、78 %、80 %、100 %在1 μ M的ABA的培养基中，24、36、48、60、7 的萌发率分别为 2%,35%,62%,80%,95% ；双突变体lhcb4 IhcM在ΟμΜ的ABA的培养基中，24、36、48、60、7浊的萌发率分别为 12%,90%,98% ,100% ,100% ；在 0. 5μ M 的 ABA 的培养基中，24、36、48、60、72h 的萌发率分别为 10%、47%、78%、90%、100%在 ΙμΜ 的 ABA 的培养基中，24、36、48、60、72h 的萌发率分别为 2%,38%,56%,80%,98% ；col在ΟμΜ的ABA的培养基中，24、36、48、60、7浊的萌发率分别为8 %、80 %、 96%,100%,100% ；在0. 5μΜ的ABA的培养基中，24、36、48、60、72h的萌发率分别为2%, 22%、65%、82%、100%在1“] 的六8六的培养基中，24、36、48、60、7211的萌发率分别为0%、 10%、30%、62%、80%。从图3C可以看出，lhcb6单突变体在1 μ M的ABA的培养基中，24、36、48、60、7 的萌发率分别为 18%,90%,95% ,100% ,100%lhcb6 cch在ΙμΜ的ABA的培养基中，24、36、48、60、7汕的萌发率分别为15%、 80%, 90%,100%,100%,野生型col在1 μ M的ABA的培养基中，24、36、48、60、7浊的萌发率分别为10%、 78%,88%,100%,100%,cch在ΙμΜ的ABA的培养基中，24、36、48、60、7浊的萌发率分别为19%、90%、 98%,100%,100% ；LHCB6在1 μ M的ABA的培养基中，24、36、48、60、72h的萌发率分别为15%,78%, 90%、100%、100%。从图3D可以看出，cch/LHCB6在经ΟμΜ ABA处理36、48、60h的萌发率分别为98%,100%,100%,野生型col在经0μ M ABA处理36、48、60h的萌发率分别为96%、98%、100% ；cch 在经 Ομ M ABA 处理 36、48、60h 的萌发率分别为 96%、100%、100% ；cch/LHCB6 在经 3 μ M ABA 处理 36、48、60h 的萌发率分别为 40%、63%、70%，野生型col在经3μ M ABA处理36、48、60h的萌发率分别为15%、20%、35%，Cch 在经 3μ M ABA 处理 36、48、60h 的萌发率均分别为 65%、95%、100%，从图5A-5C也可以看出，突变体LHCB6的萌发率高于野生型col。从图5D可以看出，突变体在幼苗生长方面对于ABA脱敏，LHCB家族的双突变体在幼苗生长方面对于ABA脱敏，突变体与cch的双突变体在幼苗生长方面对于ABA脱敏。待测植物种子分布直接播在含有0. 5和1 μ M的ABA的MS培养基中播种，春化后生长12统计萌发率，结果如图6所示，其中待测植物为野生型拟南芥col、LHCB6过表达拟南芥(OEl)。每一个数值都是三次独立生物学重复的平均。从图6中可以看出，Co 1在0. 5 μ MABA培养基上处理M、36、48、60h的种子萌发率为20%、28%、68%、 98% ；OE1在0. 5 μ MABA培养基上处理M、36、48、60h的种子萌发率为10%、18%、30%、 60% ；Col在14獻8々培养基上处理对、36、48、6011的种子萌发率为12%、23%、40%、 65% ；OEl在1 μ MABA培养基上处理M、36、48、60h的种子萌发率为8 %、12 %、25 %、 52% ；以上实验说明1. Ihcb单突变体和LHCB6_RNAi株系在ABA抑制种子萌发方面表现出对ABA脱敏的表型；2. LHCB6在ABAR参与的ABA信号转导过程的下游。2、根长实验待测植物种子直接播在含有1 μ M的ABA的MS培养基中播种，春化后生长12天 (3E，3F)或10天(3G，3H)拍照观察统计根长，以主根长度统计。待测植物为单突变体lhcb6、双突变体lhcbl lhcb6(双突变体构建方法将Ihcbl 未开花的花苞用镊子去除其雄蕊仅剩雌蕊，取下Ihcbe中开花或未开花的花苞中的雄蕊， 在剥离剩余的雌蕊柱头上摩擦，使花粉充分接触柱头，将此雌蕊做标记，荚果成熟后得到杂交Fl代种子，将Fl代种子再次播种，F2代生长，经PCR鉴定可得到纯合体)、野生型拟南芥 C0l、CCh单突变体、双突变体lhcb6 cch (双突变体构建方法将IhcM未开花的花苞用镊子去除其雄蕊仅剩雌蕊，取下cch中开花或未开花的花苞中的雄蕊，在剥离剩余的雌蕊柱头上摩擦，使花粉充分接触柱头，将此雌蕊做标记，荚果成熟后得到杂交Fl代种子，将Fl代种子再次播种，F2代生长，经PCR鉴定可得到纯合体)、LHCB6 cch过表达拟南芥(LHCB6cch)、 LHCB6过表达拟南芥(0E1、OEQ、RNAi转LHCB6拟南芥(R9和R18)。每一个数值都是三次独立生物学重复的平均。结果如图3E-3H所示(以下都是相同时间点检测的根长)，从3E中可以看出，lhcb6的根长为6. 5mm ；Col 的根长为 2. Omm ；
双突变体lhcbl lhcb6的根长为5. 5mm ；从图3F可以看出，LHCB6 cch在含1 μ M的ABA培养基上的幼苗根长为4. Omm ；lhcb6 cch双突变体在含1 μ M的ABA培养基上的幼苗根长为6. Omm ；cch单突变体在含1 μ M的ABA培养基上的幼苗根长为6. 3mm ；野生型col在含1 μ M的ABA培养基上的幼苗根长为2. Omm ；从图3G可以看出，LHCB6的RNAi转基因植株和过表达转基因植株在幼苗生长方面对ABA脱敏。以上实验表明1. Ihcb单突变体在ABA抑制幼苗生长方面表现出对ABA脱敏的表型；2. LHCB6在ABAR参与的ABA信号转导过程的下游。从3Η可以看出，LHCB6过表达拟南芥(OEl)的根长为1. 8mm ；LHCB6过表达拟南芥(0E5)的根长为2. 6mm ；RNAi 转 LHCB6 拟南芥(R9)的根长为 8. Omm ；RNAi 转 LHCB6 拟南芥(R18)的根长为 12. 5mm ；Col 的根长为 5. 6_。上述实验可以看出，所有的Ihcb cch双突变体(lhcbl cch, lhcb3 cch, lhcb4 cch, and lhcb6 cch)在种子萌发(图3C)和幼苗生长(图3F)方面表现出对ABA脱敏的表型。lhcb cch双突变体在种子萌发方面对ABA脱敏的程度低于Ihcb或者cch单突变体， 与Ihcb双突变体一致(图3A至C)。在幼苗生长方面，lhcb cch双突变体对于ABA脱敏的程度与Ihcb双突变体、单突变体和cch单突变体表型一致(图3E，3F)。有趣的是，发现在 cch突变体中过表达LGCB6基因，转基因株系在所有响应ABA的表型中都能部分恢复cch突变体对于ABA脱敏的表型ABA抑制种子萌发(图3D)，ABA抑制幼苗生长(图3F)。三、提高出发植物中LHCB6编码基因的表达对耐逆性的影响1、气孔运动实验ABA诱导的气孔关闭体系将土壤中生长3周的待测植物叶片浸泡在含有50mM KCl和IOmMMes-Tris (pH 6. 15)的缓冲液中，以200 μ moIm-2S^1强度在冷光源下放置2. 5h， 然后加入不同浓度的(士)_ABA。在ABA处理2. 后，撕取表皮条，记录气孔开度。ABA抑制气孔开放体系将土壤中生长3周的待测植物叶片浸泡在相同的缓冲液中，黑暗处理2. 5h,然后在缓冲液中加入ABA移至冷光源下照射2h，记录气孔开度。待测植物为col、chl-1 (购自 ABRC, CS3119)，cch, lhcb6 突变体及 LHCB6 过表达拟南芥(LHCB6)、双突变体lhcbl lhcb6(双突变体构建方法将lhcbl未开花的花苞用镊子去除其雄蕊仅剩雌蕊，取下lhcb6中开花或未开花的花苞中的雄蕊，在剥离剩余的雌蕊柱头上摩擦，使花粉充分接触柱头，将此雌蕊做标记，荚果成熟后得到杂交Fl代种子，将Fl代种子再次播种，F2代生长，经PCR鉴定可得到纯合体)、双突变体lhcb6 cch (双突变体构建方法将IhcM未开花的花苞用镊子去除其雄蕊仅剩雌蕊，取下cch中开花或未开花的花苞中的雄蕊，在剥离剩余的雌蕊柱头上摩擦，使花粉充分接触柱头，将此雌蕊做标记，荚果成熟后得到杂交Fl代种子，将Fl代种子再次播种，F2代生长，经PCR鉴定可得到纯合体)、 cch/LHCB6(实施例前面的LHCB6 cch过表达拟南芥(LHCB6 cch))。
结果如图4A、图4B和图5F所示，其中诱导气孔关闭为上图，抑制气孔开放为下图。 每一个数值都是五次独立生物学重复的平均。每次重复记录60个气孔的开度。从图4A中可以看出，Col 在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理 2. 5h的诱导气孔关闭时气孔的开度为5. 5 μ M、5. 2 μ M、2. 8 μ M、0. 8 μ M ；Col 在 O μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理 2. 5h的抑制气孔开放时气孔的开度分别为1. O μ M、5. 6 μ M、2. 5 μ M、0. 8 μ M ；chl-1 在ΟμΜΑΒΑ 处理 ΟΚΟμΜΑΒΑ 处理2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5Κ30μΜΑΒΑ 处理 2. 5h的诱导气孔关闭时气孔的开度为5. 3 μ M、5. O μ M、2. 6 μ M、0. 7 μ M ；chl-1 在ΟμΜΑΒΑ 处理 ΟΚΟμΜΑΒΑ 处理2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5Κ30μΜΑΒΑ 处理 2. 5h的抑制气孔开放时气孔的开度为1. 1 μ M、5. 4 μ M、2. 6 μ M、0. 9 μ M ；lhcb6 突变体在 O μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、 30 μ MABA处理2. 5h的诱导气孔关闭时气孔的开度为5. 5 μ M、5. 3 μ Μ、4· 9 μ Μ、4· O μ M ;lhcb6 突变体在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、 30 μ MABA处理2. 5h的抑制气孔开放时气孔的开度为0. 8 μ Μ、5· 5 μ Μ、5· 0 μ Μ、3· 5 μ M ；LHCB6 在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理 2. 5h的诱导气孔关闭时气孔的开度为5. 2 μ M、5. 1 μ Μ、1. 6 μ Μ、0. 4 μ M ;LHCB6 在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理 2. 5h的抑制气孔开放时气孔的开度为0. 8μΜ、5. 6μΜ、1. 0μΜ、0. 5μΜ ；从如图4Β可以看出，Col 在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理 2. 5h的诱导气孔关闭时气孔的开度为5. 0 μ M、5. 1 μ M、2. 8 μ M、0. 3 μ M ；Col 在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理 2. 5h的抑制气孔开放时气孔的开度为1. 4 μ Μ、4. 4 μ Μ、2. 2 μ Μ、0. 2 μ M ;cch 在 O μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理 2. 5h的诱导气孔关闭时气孔的开度为6. 2 μ Μ、6. 3 μ Μ、5. 8 μ Μ、2. 6 μ M ；cch 在 O μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理 2. 5h的抑制气孔开放时气孔的开度为1. 5 μ Μ、6. 7 μ Μ、5. 5 μ Μ、2. 3 μ M ；lhcb6 突变体在 O μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、 30 μ MABA处理2. 5h的诱导气孔关闭时气孔的开度为5. 1 μ Μ、4· 9 μ Μ、4· 7 μ Μ、1· 5 μ M ；lhcb6 突变体在 O μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、 30 μ MABA处理2. 5h的抑制气孔开放时气孔的开度为1. 0 μ M、5. 0 μ M、4. 1 μ Μ、1. 5 μ M ；lhcbl lhcb6 双突变体在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理2. 5h、30yMABA处理2. 5h的诱导气孔关闭时气孔的开度为5·0μΜ、5· 1μΜ、5·0μΜ、 1. 7μΜ ；lhcbl lhcb6 双突变体在 ΟμΜΑΒΑ 处理 ΟΚΟμΜΑΒΑ 处理 2. 5h、20yMABA 处理2. 5h、30 μ MABA处理2. 5h的抑制气孔开放时气孔的开度为1. 0 μ Μ、5. 0 μ Μ、4. 9 μ Μ、 1. 7μΜ ；lhcb6 cch 双突变体在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、30 μ MABA处理2. 5h的诱导气孔关闭时气孔的开度为6. 0 μ Μ、6· 1 μ Μ、5· 1 μ Μ、2· 0 μ M ；lhcb6 cch 双突变体在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、 30 μ MABA处理2. 5h的抑制气孔开放时气孔的开度为1. 1 μ Μ、6· 4 μ Μ、5· 5 μ Μ、2· 3 μ M ；值得注意的是，lhcb6 cch双突变体与cch单突变体相比对ABA的脱敏没有显著增强。从图5F中可以看出，col在ΟμΜΑΒΑ处理0h、0yMABA处理2. 5h、20yMABA处理 2. 5h、30 μ MABA处理2. 5h的诱导气孔关闭时气孔的开度分别为5. 3 μ m、5. 2 μ m、2. 8 μ m、 0. 8ym ；col 在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理 2. 5h的抑制气孔开放时气孔的开度分别为1. 2 μ m、5. 4 μ m、2. 5 μ m、0. 8 μ m ；cch 在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理 2. 5h的诱导气孔关闭时气孔的开度分别为6. 8 μ m、6. 8 μ m、5. 9 μ m、4. 9 μ m ；cch 在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理
2.5h的抑制气孔开放时气孔的开度分别为1. 3 μ m、6. 5 μ m、6. 0 μ m、4. 2 μ m ；单突变体lhcb6 在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、 30 μ MABA处理2. 5h的诱导气孔关闭时气孔的开度分别为5. 2 μ m、5. 1 μ m、4. 8 μ m、
4.0 μ m ；单突变体lhcb6 在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、 30 μ MABA处理2. 5h的抑制气孔开放时气孔的开度分别为1. 0 μ m、5. 3 μ m、4. 9 μ m、
3.6 μ m ；双突变体cch/LHCB6 (通过XbaI和Mil酶切位点将LHCB6的ORF (序列1，777bp) 与花椰菜花叶病毒的35S启动子连接引入pCAMBIA1300载体，通过花苞渗透法侵染植物 cch,筛选阳性苗，繁衍至T3代纯合体进行实验)在0 μ MABA处理0h、0 μ MABA处理2. 5h、 20 μ MABA处理2. 5h、50yMABA处理2. 5h的诱导气孔关闭时气孔的开度分别为5. 5 μ m、
5.2 μ m>3. 8 μ m>2. 8 μ m ；双突变体cch/LHCB6 在 0 μ MABA 处理 0h、0 μ MABA 处理 2. 5h、20 μ MABA 处理 2. 5h、 50 μ MABA处理2. 5h的抑制气孔开放时气孔的开度分别为1. 2 μ m、6. 2 μ m、3. 7 μ m、2. 0 μ m。2、干旱实验和失水率实验将待测植物从培养基移入土壤中生长后，不浇水进行干旱胁迫，拍照。以正常浇水为对照。将野生型和不同的Ihcb突变体，每次每个样取5株叶片进行实验(选取四周龄未抽薹植株上的发育成熟的叶片，放在称量纸上，每隔Ih称重一次，计算出叶片失水率。公式应为(Oh重量-Ih重量)/Oh重量)，统计6小时内离体叶片的失水速率。待测植物为野生型拟南芥Col、突变体lhcb6。拍照观察的结果如图4C-E和图5H所示，从图4C可以看出，为正常浇水，野生型拟南芥Col、突变体IhcM无差异。从图4D可以看出，为干旱胁迫停止浇水18天后复水2天，野生型拟南芥Col生长较好、突变体IhcM基本枯萎。从图4E可以看出，为干旱胁迫干旱21天后复水，2天后拍照记录，野生型拟南芥Col生长较好、突变体IhcM基本枯萎。从5H可以看出，干旱胁迫干旱21天后复水，2天后拍照，野生型拟南芥Col生长较好、突变体IhcM基本枯萎。图5D表明lhcb6突变体在幼苗生长方面对于ABA脱敏，lhcbl lhcb6和lhcb6 cch 双突变体在幼苗生长方面对于ABA脱敏。。失水率的结果如图5G所示，可以看出，lhcb6 在 ABA 处理 l、2、3、4、5、6h 的失水率分别为 16%,32%,48%,59%,76% ；col 在 ABA 处理 l、2、3、4、5、6h 的失水率分别为 12% ,24% ,34% ,44% ,54% 可以看出，在ABA诱导的气孔关闭和抑制气孔开放方面，IhcM突变体表现出对 ABA的脱敏表型，而LHCB6的过表达株系表现出对ABA敏感的表型。双突变体lhcbl lhcb6 表现出相同程度的脱敏表型。chl-1突变体在ABA诱导的气孔关闭和抑制气孔开放方面未表现出对ABA脱敏的表型，这与以前对于chl-2突变体研究结果一致。研究发现Ihcb突变体的离体叶片在干燥的条件下同等时间失水更多。这可能是由于这些突变体在气孔运动方面对ABA脱敏引起的。同时，发现Ihcb突变体在正常浇水条件下生长状态与野生型一致，而在干旱条件下，突变体的保水能力低于野生型。4、Ihcbs突变体的互补拟南芥在种子萌发、幼苗生长及耐旱的研究1)种子萌发、根长Lhcb6*代表LHCB6基因的互补株系(获得方法如上所示)。将lbcb6*和col在1 μ M的ABA培养基上春化后48小时后，统计种子萌发率。将lbcb6*和col在1 μ M的ABA培养基上春化后12天后，统计根长。结果如图7Α所示，col、lbcb6*在1 μ M的ABA培养基上春化后48小时的萌发率分别为32%、21 %，可以看出IhcM突变体在种子萌发方面对ABA脱敏的表型是由于LHCB6 基因表达量降低引起的。col、lbcb6*在ΙμΜ的ABA培养基上春化后12天的根长(主根长度)分别为 2. 5mm、1. 7mm，可以看出IhcM突变体在幼苗生长方面对ABA脱敏的表型是由于LHCB6基因表达量降低引起的。可以看出lbcb6*可以恢复野生型表型，结合前面的实验，lh(A6突变体在幼苗生长方面对ABA脱敏的表型是由于LHCB6基因表达量降低引起的。2)耐旱(气孔开度)将lbcb6*和col按照上述方法进行诱导气孔关闭及抑制气孔开放实验，在O μ M ABA O小时记录初始气孔开度，Ομ M或20μ M ABA处理2. 5小时后再记录气孔开度。每一个数值都是五次独立生物学重复的平均。每次重复记录60个气孔的开度。字母相同表示 (在P < 0. 05差异水平)没有显著差异，字母不同表示有显著差异。结果如7Β所示，ABA诱导气孔关闭为上图，抑制气孔开放为下图，col和lbcb6*在O μ M的ABA处理O小时的诱导气孔关闭的气孔开度分别为 6. O μ m、6. O μ m，可以看出本实验中野生型与转基因株系初始状态相同。col和lbcb6*在O μ M的ABA处理O小时的抑制气孔开放的气孔开度分别为 1. O μ m、1.0 μ m，可以看出本实验中野生型与转基因株系初始状态相同。col和lbcb6*在Ομ M的ABA处理2. 5小时的诱导气孔关闭的气孔开度分别为5. 1 μ m、5. 0 μ m，可以看出本实验中，以水作为负对照处理野生型与转基因株系，其表型一致。col和lbcb6*在O μ M的ABA培养基上春化后2. 5小时的抑制气孔开放的气孔开度分别为5. 5 μ m、5. 8 μ m，可以看出本实验中，以水作为负对照处理野生型与转基因株系，
其表型一致。col和lbcb6*在20 μ M的ABA处理2. 5小时的诱导气孔关闭的气孔开度分别为 3. 2 μ m、2. 4 μ m，可以看出在ABA处理后，转基因株系基本恢复IhcM突变体在气孔运动方面对ABA脱敏的表型，说明IhcM突变体对ABA脱敏的表型是由于LHCB6基因表达量降低引起的。col和lbcb6*在20 μ M的ABA处理2. 5小时的抑制气孔开放的气孔开度分别为 2. 4 μ m、2. 2 μ m，可以看出在ABA处理后，转基因株系基本恢复IhcM突变体在气孔运动方面对ABA脱敏的表型，说明IhcM突变体对ABA脱敏的表型是由于LHCB6基因表达量降低引起的。实施例2、LHCB6基因的表达由ABAR-WRKY40信号通路调节一、LHCB6基因的正常表达需要ABA的参与为了检测ABA对LHCB6的表达是否是必须的，利用ABA缺陷突变体aba2进行实验。LHCB6的mRNA的表达检测方法三天的aba2幼苗移到不含或含有(1_60 μ M) ABA的培养基上，继续生长两周后取样，进行荧光定量PCR(模板样品的cDNA ； 弓I ^ :LHCB6 forward primer 5' -GCGATGGCAGCGGTTCTTG-3‘ reverse primer 5，-CCATGGCGTTGCCCACTCA-3，内参β -Actin、内参的引物为 forward primer :5，-GGTAACA TTGTGCTCAGTGGTGG-3，reverse primer 5，-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，)检测 LHCB6 的表达水平，以野生型拟南芥(col)为对照。每组数据都是三次独立的生物学重复的平均值。结果如图8A所示，可以看出，ABA合成突变体aba2中，LHCB6的表达是被调低的(aba2-ABA)，ABA处理后能够使ABA合成突变体aba2中的LHCB6的表达得到恢复 (aba2+ABA)，但是当ABA浓度高于40 μ M时出现抑制作用。LHCB6蛋白表达的检测方法三天的aba2幼苗移到含有(0，1，3，5，10，20，40， and60 μ Μ) ABA的培养基上，继续生长两周后取样，提取总蛋白，进行Wfestern blot检测(特异抗体购自 Agrisera(Stockholm, Sweden ；website :www. agrisera. com ；product No. AS01010)，，结果如图8B所示，Western blot条带浓度表示蛋白相对表达量。条带下面的数值代表蛋白表达的相对水平。设定Col中LHCB蛋白量为100，突变体中LHCB蛋白量与之相比进行量化。Actin为上样对照，实验三次重复得到相似的结果。从上述可以看出，LHCB6的mRNA和蛋白表达量在aba2突变体中均低于野生型。 ABA的处理可以恢复各个LHCB成员在aba2突变体中的表达水平，但是较高浓度的ABA处理 (> 20or > 40 μ M 处理 LHCB mRNAs ； > 20 μ M 处理除 LHCB5 蛋白的 LHCB 蛋白> 40 μ Μ) mRNA和蛋白水平在突变体中的表达均开始下降(图8A，8B)。这些实验结果表明LHCB6在转录和翻译水平的正常表达需要ABA的参与。值得注意的是，在aba2突变体中，LHCB6对于ABA的响应在蛋白水平与mRNA水平完全一致(图8A，8B)。然而，在aba2突变体中，刺激LHCB表达的最高浓度是野生型实验体系中的三倍。二、Promoter-GUS 分析基因表达以野生型拟南芥的基因组DNA为模板，利用正向引物5’ -CCCAAGCTTCCGGACATGGG TTCAAATCA-3，和反向引物 5，-C GGGATCCAACCAAGCCCACTGAGGACA-3，扩增，得到 1109bp 的产物，将该产物送去测序，结果为该产物具有序列表中的序列6核苷酸，即为拟南芥 Atlgl5820(LHCB6)基因的启动子 pLHCB6。将启动子pLHCB6DNA利用I^stl/BamHI酶切位点，将启动子片段连入载体到 pCAMBIAl391(Shang Y,Yan L,Liu ZQ，Cao Z，Mei C,Xin Q,Wu FQ，Wang XF,Du SY,Jiang Τ,Zhang XF,Zhao R，Sun HL,Liu R,Yu YT,Zhang D-P(2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ABA-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909_1935，公众可从清华大学获得。含有 gus 基因。)中，转化至农杆菌GV3101，通过花侵染法分别转化野生型拟南芥(Col)，wrky40突变体及wrky40wrkyl8双突变体(双突变体构建方法将wrky40未开花的花苞用镊子去除其雄蕊仅剩雌蕊，取下wrkylS中开花或未开花的花苞中的雄蕊，在剥离剩余的雌蕊柱头上摩擦，使花粉充分接触柱头，将此雌蕊做标记，荚果成熟后得到杂交Fl代种子，将Fl代种子再次播种，F2代生长，经PCR鉴定可得到纯合体。)，分别得到TO代转pLHCB6的野生型拟南芥、TO代转pLHCB6的wrky40突变体和TO代转pLHCB6的wrky40wrkyl8双突变体。将上述TO代植株传代，得到T3代植株。采用GUS染色方法筛选T3代植株，GUS染色方法参照 Jefferson RA, Kavanagh ΤΑ, Bevan MW(1987) GUS fusions β -glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 20 3901-3907，结果如图9A-9I所示，(A)干种子；(B)和(C)萌发的种子；(D) 9天的幼苗；(E) 和(F)成熟叶片的气孔；主要在气孔的保卫细胞中表达。(G)根；(H)花；⑴角果。可以看出，LHCB6在T3代转pLHCB6的野生型拟南芥的如上组织中均有LHCB6的表达。分别提取野生型拟南芥的不同组织的RNA，反转录得到cDNA，LHCB6 forward primer :5’ -GCGATGGCAGCGGTTCTTG-3’ reverse primer :5’ -CCATGGCGTTGCCCACTCA-3’ 内参β -Actin、内参的引物为 forward primer :5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，reverse primer 5，-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，，荧光定量 PCR 检测，结果如图 9J，LHCB6 在野生型植株中的根、茎、叶、花、角果和种子中的mRNA相对表达量分别为0. 05、0. 55、1. 75,0. 40、 0. 20,0. 00。三、WRKY40转录因子与LHCB家族成员的启动子结合并抑制其表达尝试研究直接作用于ABAR下游的一个关键转录抑制子——WRKY40转录因子是否能直接与LHCB的启动子区域结合而调节LHCB的表达。1、通过染色质免疫共沉淀实验的PCR和实时荧光定量PCR具体实验见下述的图10A-10D所示，图10A为LHCB6基因启动子的结构:ffn(ffl, W2,…)代表从左到右ff-box的顺序及它们相对于起始密码子(ATG)的位置。红线代表CHIP分析(图10B)中检测的序列片段。 箭头代表凝胶阻滞分析中所用的序列片段，同一片段用相同颜色的两个箭头表示，Pl, P2… 代表所选片段的数目。图10B为WRKY40与LHCB6基因的启动子互作
具体方法用WRKY40的N端特异抗体(WRKY40的N端的为genbank号 CP002684的第21-131位核苷酸，WRKY40的核苷酸序列为序列表的序列5，氨基酸序列为序列表中的序列4)进行CHIP分析的PCR电泳检测结果(CHIP分析参照之前的方 法(Saleh A，Alvarez-Venegas R，Avramova Z (2008)An efficient chromatin immunoprecipitation (Chip)protocol for studying hi stone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc 3 :1081-1025 ；Shang Y，Yan L，Liu ZQ, Cao Z，Mei C， Xin Q，Wu FQ，Wang XF，Du SY，Jiang T，Zhang XF，Zhao R，Sun HL，Liu R，Yu YT，Zhang D-P (2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22: 1909-1935)。实验材料为野生型拟南芥的两周龄苗。WRKY40的特异抗体为WRKY40的N-端抗体(Shang Y，Yan L，Liu ZQ，Cao Z，Mei C，Xin Q，Wu FQ，Wang XF，Du S Y，Jiang T， Zhang XF，Zhao R，Sun HL，Liu R，Yu YT，Zhang D-P(2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ABA-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22:1909-1935)。为了检测 WRKY40 与 LHCB 启动子的结合活性，参照(Mukhopadhyay A，Deplancke B, Walhout AJM, Tissenbaum HA(2008). Chromatin immunoprecipitation(Chip) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc 3 :698-709 ；Shang Y， Yan L, Liu ZQ, Cao 1, Mei C， Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T，Zhang XF, Zhao R，Sun HL, Liu R，Yu YT, Zhang D-P (2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935)方法，以 Actin2的3’非翻译区序列为内参对照进行实时定量PCR检测。内参引物Actin2:forward primer :5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，reverse primer :5，-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，启动子片段的序列在(图10A)中标示。结果如图IOB所示，iInput'泳道野生型拟南芥两周龄苗的基因组DNA为模板，扩增的PCR产物；‘control’泳道免疫前血清沉淀(抗体制作公司提供)得到的DNA为模板，扩增的PCR产物；‘LHCB-p’泳道:WRKY40N端特异抗体沉淀得到的DNA为模板，扩增的PCR产物。pLHCB6-l forward primer :5，-TCCCGTGACTTTGCCTCCA-3，reverse primer :5，-ACCAATAGAGTCCATCCCAACAAT-3，扩增得到的片段序列为序列7。可以看出，WRKY40与LHCB6基因的启动子结合。图IOC为WRKY40与LHCB6基因的启动子互作用WRKY40的N端特异抗体进行CHIP 分析的荧光定量PCR。结果如IOC所示，Actin启动子(Actin-p)(是以Actin2的3’非翻译区序列为内参对照进行实时定量PCR的产物)为负对照。可以看出，LHCB6基因的启动子(LHCB6_p)与WRKY40结合的相对结合率为沈。
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每组数据都是三次独立的生物学重复的平均值。显示，WRKY40与LHCB基因的启动子结合。图IOD为酵母单杂交实验酵母单杂交利用Clontech试剂盒(Matchmaker. One-Hybrid Library Construction&Screening Kit CATALOG No. 630304)提供的AH109 菌株。以野生型拟南芥植株全基因组DNA为模板，以下列引物进行PCR扩增，得到1137bp 产物(测序为序列表中的序列6的自5’末端第1-1137位核苷酸)LHCB6 promoter (1137bp)forward primer :5，-TCCCCCGGGACCAGTCAACATTAACGCCACC-3，reverse primer :5，-CGACGCGTTCCGGTGAGGAACGAAGAAC-3，用Smal/Mlul酶切1137 bp产物，与经同样酶切的pHIS2载体(Clontech试剂盒 (Matchmaker One-Hybrid Library Construction&Screening Kit CATALOG No. 630304) 连接，得到 pHIS2-pLHCB6。利用AH109菌株的酵母单杂交方法根据手册的说明进行。用包括靶基因启动子的pHIS2载体和含有WRKY40开放读码框的猎物载体(pGADT7_WRKY40 (Clontech试剂盒 (Matchmaker One-Hybrid Library Construction&Screening Kit CATALOG No. 630304), 共同转化酵母细胞。同时转化空载体 pGADT7 (Clontech 试剂盒(MatchmakerTM One-Hybrid Library Construction&Screening Kit CATALOG No. 630304))和 pHIS2 O^lontech 试剂盒 (Matchmaker One-Hybrid Library Construction&Screening Kit CATALOG No. 630304)) 到酵母细胞，作为负对照。该实验重复三次，得到同样的结果。转化后的酵母细胞先在SD-Trp-Leu培养基上生长确认载体转化进入细胞，然后将转化的细胞在SD-Trp-Leu-Hi s培养基上生长。SD-Trp-Leu或SD-Trp-Leu-Hi s培养基包含 25mM 3-AT (SIGMA) (WRKY40-LHCB1-, LHCB2-或 LHCB5-promoter 互作)或者 10mM(WRKY40-LHCB3启动子或LHCB6-启动子互作)。酵母平板在30°C生长3天。结果如10D所示，从图中看出，WRKY40与LHCB6基因的启动子结合。图10E为凝胶阻滞实验利用从大肠杆菌中纯化的His-WRKY40融合蛋白(WRKY40 蛋白序列见序列4，为WRKY40的全长，将WRKY40蛋白编码基因连接到pET48_b载体上，构成 His-WRKY40 融合蛋白，HIS 为 pET48-b 载体(Shang Y, Yan L，Liu ZQ, Cao Ζ,Mei C,Xin Q, Wu FQ,Wang XF,Du SY,Jiang Τ,Zhang XF,Zhao R，Sun HL,Liu R，Yu YT,Zhang D-P(2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ABA-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935,公众可从清华大学获得)上带有的标签)进行凝胶阻滞实验，具体如下LHCB6启动子的片段(测序为序列表中的序列6的自5’末端第704-905位核苷酸)是利用下述引物从PCR产物中纯化而来的，模板为野生型Col的cDNA LHCB6 启动子(pLHCB6 ；-374 _173，202bp) forward primer5' -A T T C A T T G C T G T C A T T T A C A T T T C - 3 ‘ reverse primer 5’ -GATAGATTTCTGACCAATTAGGAG-3'LHCB6启动子在W-box的关键位点进行了突变，由GTCA变为GTTA或者TGAC变为TTAC，方法是利用下列引物(突变位点已下标)和上述相应引物进行两次独立的PCR:forward primer 5’ -ATTCATTGCTGTCATTTACATTTC-3’ reverse primer5， -GATAGATTTCTAACCAATTAGGAGTTAG-3，将 W-boxes Wl(GTCA_GTTA)和 W2(TGAC_ TTAC)突变；forward primer 5’ -AATTTCCACGTGTTATTTTATTTTCC-3’ reverse primer5，-GATAGATTTCTGACCAATTAGGAG-3，将 W_box W3 (GTCA_GTTA)突变；forward primer 5， -ATTCATTGCTGTTATTTACATTT-3，和 reverse primer5，-GATAGATTTCTGACCAATTAGGAG-3，将 W_box W4 (GTCA-GTTA)突变。LHCB6启动子的W1-W4位置已标注在图IOA0每一个启动子利用由PCR扩增得来的等摩尔质量的片段，作为第三次PCR的模板。突变体的序列经测序鉴定。每一个启动子的片段根据操作手册由地高辛-dUTP (Roche，Mannheim，Germany)标记。标记反应的操作方法参照已发表的论文(Shang Y, Yan L，Liu ZQ, Cao Ζ,Mei C, Xin Q,ffu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang Τ,Zhang XF,Zhao R，Sun HL,Liu R，Yu YT,Zhang D-P(2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ABA-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22:1909-1935)。使用 50ng His_WRKY40 融合蛋白和 ^ng相应的地高辛标记过的启动子片段。竞争性实验使用5-20倍未标记片段。结果如图10G，Y40 纯化的6His_WRKY40融合蛋白；Lp 标记的启动子探针(ATTCA TTGCTGTCATTTACATTTCAATAAGAAAATAAATTAATTTCCACGTGTCATTTTATTTTCCTCTCACAATTTAGATT TAGATAAGTAAAGTATTAGAAAAATGTAAATACTGAGTTGGCAGAATAAGACAGTGGTGAGTGTGGGTGATGTGGAT ATGGTGAAGTAGTTTCTGACTCCTAATTGGTCAGAAATCTATC ；5p, IOp, 20p 分别代表 5 倍，10 倍，20 倍非标记的探针量，(G)图中Lpl/2mW，Lp3mff and Lp4mW分别代表对LHCB6启动子中的第一个和第二个、第三个、第四个W-box进行点突变(Wl，W2，W3 and W4已在图10A中标出)。 6His代表带6个组氨酸标签的肽，BSA代表牛血清白蛋白，6His和BSA分别作为负对照。该实验重复三次，得到同样的结果。验证了 WRKY40与启动子的结合(WRKY40与LHCB6的启动子上W-box区域结合)。2、WRKWO与启动子互作的体内实验此实验方法参照已发表的论文Shang Y，Yan L，Liu ZQ, Cao Z，Mei C，Xin Q，Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF,Zhao R,Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P(2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22:1909-1935。WRKY40的cDNA利用下列引物通过PCR扩增得到(模板为野生型Col的cDNA)5， -CGCGGATCCATGGATCAGTACTCAT-3，和 reverseprimer5' -CCGCTCGAGCTATTTCTCGGTATGA-3，，PCR 产物(序列表中的序列幻利用 8&1^1/^101位点连接在卩81121载体(511&1^ Y, Yan L，Liu ZQ, Cao Ζ,Mei C,Xin Q,ffu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang Τ, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P(2010) The Mg-chelataseH subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935，公众可从清华大学获得。)的CaMV 35S启动子下游，得到PBI121-WRKY40。LHCB6启动子利用下列引物扩增得到
LHCB6 forward primer5' -GGGGTACCTCCCGTGACTTTGCCTCCA-3，reverse primer5' -TCCCCCGGGTCCGGTGAGGAACGAAGAAC-3‘ (1109 bp)。扩增得到的片段序列为序列8。LUC的cDNA序列利用下列引物以包含LUC的cDNA片段的pGL3_Basic载体(Shang Y, Yan L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P (2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909_1935，公众可从清华大学获得。)为模板扩增得到: forward primer 5’ -TCCCCCGGGATGGAAGACGCCAAAAAC-3reverseprimer 5，-CGGGATCCTTACACGGCGATCTTTCCGC-3，，得到 LUC 的 cDNA。LHCB6启动子利用KpnI/Smal位点连接pCAMBIA1300载体，得到 PCAMBIA1300-LHCB6。将LUC 的 cDNA 序列通过 Smal/BamHI 位点连接在 pCAMBIA1300_LHCB6 的 LHCB6 启动子的下游，得到pLHCB-LUC (单转)，转入GV3101菌株，得到GV3101/pLHCB-LUC_LHCB6 (单转)。将PBI121-WRIW40 转入 GV3101 菌株，得到 GV3101/PBI121-WRKY40。用无针注射器将GV3101/pLHCB-LUC_LHCB6(单转)注射进幼嫩同时完全伸展的七周的烟草 N. benthamiana 叶片(Shang Y, Yan L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P(2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935，公众可从清华大学获得。)，得到转pLHCB-luc烟草。用无针注射器将GV3101/pLHCB-LUC-LHCB6 和 GV3101/PBI121-WRKY40 混合菌液一同注射进幼嫩同时完全伸展的七周的N. benthamiana叶片；得到转pLHCB_luc+WRKY40烟草。实验组载体与对照组载体GV3101/pLHCB-LUC_LHCB6总量相同。注射后，将烟草黑暗处理12h，然后放在室温(25度)条件16h/天光照下继续生长 60h。LUC活性通过CCD(AndoriXon，Andor，UK)图像设备观察。以LUC空载体和对照组载体GV3101/pLHCB-LUC-LHCB6为对照，本实验独立重复五次以上，且实验结果相同。结果如图11所示，图IlA为WRKY40和LHCB启动子-荧光素酶(Luc)载体共同转化烟草叶片的结果， 可以看出，活体内WRKY40显著抑制LHCB6基因的启动子活性。共转pLHCB_LUC+WRKY40后， pLHCB-LUC的表达明显变弱甚至不表达。实验三次重复，得到同样的结果。为了检测LHCB基因的表达在这两个突变体中是否受到影响，将 PCAMBIA1391-LHCB6转化wrky40单突变体和wrky40wrkyl8双突变体，得到野生型拟南芥 (Col)-⑶S、突变体 wrky40-GUS、双突变体 wrky40/18_GUS。结果如图IlB所示，图IlB为野生型拟南芥(Col)-GUS、突变体wrky40_GUS、双突变体wrky40/18-GUS的T3代纯合体在13天的幼苗⑶S染色结果，其中，最上面(a，b)是野生型拟南芥(Col)-GUS，中间(c，d)是突变体wrky40-GUS，下面(e，f)是双突变体 wrky40/18-GUS。可以看出，wrky40和wrky4018b中LHCB6的表达明显增强。WRKY18是与 WRKY40同源性较高的基因，它与WRKY40共同参与ABA信号转导过程。发现在wrky40单突变体和wrky40wrkyl8双突变体中LHCB6基因的表达量显著提高。图1IC为检测野生型拟南芥(Col)突变体wrky40、双突变体wrky40/18的 LHCB6的mRNA表达和蛋白表达实时定量PCR检测野生型拟南芥(Col)、突变体wrky40、 双突变体 wrky40/18 的 LHCB6 的 mRNA 水平表达，LHCB6 forward primer :5，-GCGAT GGCAGCGGTTCTTG-3’ reverse primer :5’ -CCATGGCGTTGCCCACTCA-3’ 内参β -Actin、 内参的引物为 forward primer 5' -GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3‘ reverse primer 5’ -AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。免疫印迹检测蛋白水平的表达，Actin为上样对照拟南芥总蛋白提取方法参照 LHCB抗体供应商Agrisera建议的方案进行，SDS-PAGE和免疫印迹检测参照Siang Y，Yan L, LiuZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P (2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909_1935。上述结果如图IlC所示，方框中的数值代表蛋白的相对表达水平。设定Col (野生型拟南芥)中LHCB蛋白量为标准，突变体中LHCB蛋白量与之相比进行量化。免疫印迹分析进行三次独立生物学重复，得到类似的结果。RT-PCR的每组数据是三次独立生物学重复的平均值。可以看出，在wrky40单突变体和wrky40wrkyl8双突变体中，LHCB6的表达量显著提高，LHCB6蛋白表达量在wrky40单突变体中显著提高。然而，在wrky40wrkyl8双突变体中，LHCB6表达量没有显著变化。综上所述，以上实验结果表明，WRKY40和WRKY18共同抑制LHCB基因表达。为了研究ABA对LHCB表达的刺激作用在一定程度上依赖于ABAR和WRKY40的功能，进行如下实验将cch、wrky40、col生长三天的幼苗分别移至含0、1、3、5μΜ ABA的培养基上继续生长两周后取样检测。实时定量PCR检测野生型拟南芥(Col)、突变体wrky40、 双突变体 wrky40/18 的 LHCB6 的 mRNA 水平表达，LHCB6 forward primer :5，-GCGAT GGCAGCGGTTCTTG-3’ reverse primer :5’ -CCATGGCGTTGCCCACTCA-3‘内参β -Actin、 内参的引物为 forward primer 5' -GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，reverse primer 5’ -AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。免疫印迹检测蛋白水平的表达，Actin为上样对照拟南芥总蛋白提取方法参照 LHCB抗体供应商Agrisera建议的方案进行，SDS-PAGE和免疫印迹检测参照Siang Y，Yan L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P (2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935，实验重复三次，结果一致。结果图IlD和IlE所示，
其中，IlD左侧图所示，cch和野生型拟南芥相比，cch的LHCB6 ( ‘*’标出)在蛋
白水平的只有轻微升高。图IlD右侧图所示，cch和wrky40相比，LHCB6的蛋白表达不受影响。根据免疫印迹条带的浓度对蛋白表达量进行估计，以不进行ABA处理的野生型中的表达量为标准参照(柱形图中红色箭头所示)。结果如图IlE所示，在1，3，5μΜ的ABA 对LHCB6表达的刺激作用，在cch和wrky40突变体中显著低于野生型中。数据为三次独立生物学重复的平均值。Cch 在 0、1、3、5 μ M 的 ABA 处理下 LHCB6 相对表达量为 40,50,55,wrky40 突变体在 0、1、3、5 μ M 的 ABA 处理下 LHCB6 相对表达量为 500，500，500，co 1 在0、1、3、5 μ M的ABA处理下LHCB6相对表达量为100，400，270，150。四、ABAR和WRKY40的突变体影响ABA对LHCB表达的调控将abar-3突变体(ABAR等位基因的单点突变体，Shang Y, Yah L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P (2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935,公众可从清华大学获得。)和野生型Col提取RNA和蛋白质，通过荧光定量PCR和免疫印迹检测(检测方法同上)LHCB基因mRNA和蛋白水平的表达，免疫印迹以Actin为上样对照。蛋白条带下方框内的数值代表LHCB蛋白的相对表达量。以Actin 条带为标准。免疫印迹三次生物学重复，结果一致。每一个数值都是三次独立生物学重复的平均值。结果如图12所示，col的LHCB6基因mRNA相对表达量为1. 00 ；
abar-3突变体的LHCB6基因mRNA相对表达量为0. 75 ；结合上述LHCB家族成员的蛋白水平在低浓度ABA(1，3或5μΜ)处理下表达量提高，但是在cch和wrky40突变体中LHCB3，LHCB4和LHCB6响应ABA的能力显著地下降的结果，表明ABA通过ABAR-WRKY40介导的信号通路促进LHCB的表达。五、ABAR和LHCB因的双突变体具有对ABA脱敏的表型，cch突变体中过表达LHCB6 基因可以部分恢复其对ABA的脱敏表型Mf 双突变体 lhcbl lhcb3，lhcbl lhcb6、lhcbl cch、lhcb3 cch、lhcb4 cch、lhcb6 cch和野生型Col提取RNA和蛋白质，通过荧光定量PCR和免疫印迹检测(检测方法同上) LHCB基因mRNA和蛋白水平的表达，免疫印迹以Actin为上样对照。蛋白条带下方框内的数值代表LHCB蛋白的相对表达量。结果如图13所示图13A为双突变体lhcbl lhcb3, Ihcbl lhcb6 中不同 LHCB基因的表达，图 1 为双突变体 lhcbl cch、lhcb3 cch、lhcb4 cch、lhcb6 cch中不同LHCB基因的表达。mRNA水平的表达通过荧光定量PCR检测(图13A，13B中的柱形图)，蛋白水平表达通过免疫印迹检测，Actin为上样对照。图13A中蛋白条带下面的数值表示LHCB蛋白的相对表达量，以野生型为标准进行比较量化。六个LHCB (LHCB1-LHCB6) 的表达在cch突变体(图13B)及所有双突变体(13A，13B)中都做了检测。免疫印迹分析三次独立生物学重复，结果相似。荧光定量PCR的每一个数值都是三次独立生物学重复的平均值。
为了研究ABAR与LHCBs基因在遗传学的上下游关系，以cch-lhcbs双突变体 lhcbl cch，lhcb3 cch，lhcb4 cch，和lhcb6 cch为对象研究其响应ABA的表型。cch突变体中，LHCB基因表达量显著下降(图13B)。然而，单个LHCB下调的突变体(lhcbl，lhcb4， 或lhcb6)与cch杂交后得到的双突变体与cch单突变体相较，LHCB家族基因含量并没有显著下调，反而促进了其他LHCB家族成员的表达。LHCB3敲除突变体与cch突变体杂交后得到的双突变体中，LHCB3基因被敲除，但是LHCB2，LHCB4, LHCB6基因的mRNA被调高，LHCB4 蛋白水平表达被调高(图13B)。这些数据说明在双突变体中有一套复杂的反馈调节机制来维持LHCB基因家族整体的稳定性。六、调低或敲除LHCB基因影响活性氧的稳态和一系列参与ABA信号通路的基因和响应ABA的基因的表达1、影响活性氧的稳态众所周知，活性氧(ROS)参与ABA信号转导过程(Pei et al,2000 ；Murata et al,2001 ；Mustilli et al,2002 ；Kwak et al,2006 ；Miao et al,2006 ；Zhang et al, 2009)，并且在植物细胞中ROS主要产生于叶绿体中(Kwak et al，2006 ；Nott et al,2006 ； Galvez-Valdivieso和Mullineaux，2010)。叶绿体内，ROS的产生主要与光吸收和电子传递有关,而LHCB也在这两个过程中起到重要作用(Jansson，1994，1999 ；Galvez-Valdivieso 和 Mullineaux，2010)。因此，检测lh(A6突变体中ROS的含量。叶片取自土壤中生长三周的野生型拟南芥植株，在50mMKCl，IOmMMes-Tris (pH 6.15)并含有不同浓度的ABA的缓冲液中，置于200μΜο1 n^sec—1光照下预处理lh。然后将缓冲液中加入0. lmg/mL NBT(溶于IOOmM磷酸钾溶液)并抽真空渗透使叶子染色 (Amresco, Solon, OH, USA)。样品在室温黑暗放置2h.然后移入80 %乙醇，沸水浴处理 IOmin,以去除叶绿素的干扰。保卫细胞中ROS含量的检测利用H2DCF-DA(SIGMA，D6883) 浸染剥落的叶片表皮条，方法参照Miao Y，Lv D，Wang P，Wang XC，Chen J, Miao C， Song CP (2006)An Arabidopsis glutathione peroxidase functions as both a redox transducer and a scavenger in abscisic acid and drought stress responses. Plant Cell 18 :2749-2766。在含有0(相同体积乙醇作为对照)或者5 μ M(士)-ABAMES-Tris缓冲液(同上文)中预处理表皮条，促进气孔张开。然后将表皮条浸入50mMTriS-KCl(pH 7.2) 包含50mM H2DCF-DA的缓冲液中黑暗处理20分钟。利用MES-Tris缓冲液漂洗样品，去除多余的染料。利用fluorescence microscopy (Olympus, BX51, Japan)检测表皮条中的荧光。ROS浸染荧光按一下参数观察激发光，488nm;透射光，525nm。实验结果如图14所示， 图14A为NBT染色检测不同浓度ABA (野生型col 0-50 μ Μ, lhcb6突变体中0_10 μ Μ)处理野生型和Ihcbs突变体叶片后ROS的产生。实验重复三次得到相似的结果。图14Β为图14Α中ROS产生的量化。通过扫描染色亮度进行估计，将野生型中ROS 的染色浓度定为100%，其他与之相比进行量化。结果为lhcb6 在 O、5、10 μ MABA 处理下的 ROS 量为 150%，50%，50% ；col 在 0、5、10、50μΜΑΒΑ 处理下的 ROS 量为 100%，150%，100%，50% ；图14C为5 μ M ABA处理野生型和不同Ihcb突变体的表皮条，通过&DCF_DA染色观察保卫细胞中的ROS产生情况。实验三次重复得到类似的结果。
图14D为实时定量PCR检测Ihcbs突变体中一系列ABA响应基因的表达。每组数据都是三次独立生物学重复的平均值。从上述可以看出，Ihcb突变体中ROS的含量高于野生型植株，这在叶片和保卫细胞中都有体现(图14A至C)。发现用较低浓度(1至5 μ M)的ABA处理叶片会促进ROS的产生。这与以前的研究结果一致(Pei et al,2000 ；Murata et al,2001 ；Mustilli et al, 2002 ；Kwak et al，2006 ；Miao et al，2006 ；Zhang et al，2009)；而用较高浓度(10 μ M)的 ABA处理就不再有促进效应甚至会降低ROS的含量(50 μ Μ)(图14Α)。然而在Ihcb突变体中，用较低浓度ABA处理植株，不论是完整的叶片(1至10 μ M ΑΒΑ,图14Α和图12Β)还是保卫细胞内(5 μ M ABA处理，图14C)的ROS含量都下降。这些实验结果表明调低或敲除LHCB 基因都将影响植物细胞内ROS的稳态和ROS对ABA的响应。2、调低或敲除LHCB基因影响一系列参与ABA信号通路的基因和响应ABA的基因的表达采用荧光定量检测了 Ihcb突变体1-6中下列参与ABA信号通路基因及ABA响应基因的表达ABF1，ABF2/AREB1, ABF3, ABF4/AREB2 (Choi et al，2000 ；Uno et al，2000)， ABIl (Leung et al, 1994 ；Meyer et al, 1994 ；Gosti et al, 1999), ABI2 (Leung et al, 1997), ABI3(Giraudat et al，1992)，ABI4(Finkelstein et al，1998)，ABI5 (Finkelstein and Lynch, 2000), ERDlO (Kiyosue et al，1994)，KINl 禾口 KIN2 (Kurkela and Borg-Franck, 1992)，MYB2 和 MYC2 (Abe et al，2003)，OSTl (Mustilli et al，2002)，RAB18 (Lang and Palva, 1992), RD29A (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki，1994)。引物如下
ABFl(Atlg49720)
forward primer :5，-TCAACAACTTAGGCGGCGATAC-3’
reverse primer :5，-GCAACCGAAGATGTAGTAGTCA-3’
ABF2 (Atlg45249)
forward primer :5，-TTGGGGAATGAGCCACCAGGAG-3’
reverse primer :5，-GACCCAAAATCTTTCCCTACAC-3’
ABF3(At4g34000)
forward primer :5，-CTTTGTTGATGGTGTGAGTGAG-3’
reverse primer :5，-GTGTTTCCACTATTACCATTGC-3’
ABF4(At3gl9290)
forward primer :5，-AACAACTTAGGAGGTGGTGGTC-3’
reverse primer :5，-CTTCAGGAGTTCATCCATGTTC-3’
ABIl(At4g26080)
forward primer :5，-AGAGTGTGCCTTTGTATGGTTTTA-3’
reverse primer :5，-CATCCTCTCTCTACAATAGTTCGCT-3
ABI2(At5g57050)
forward primer :5，-GATGGAAGATTCTGTCTCAACGATT-3
reverse primer :5，-GTTTCTCCTTCACTATCTCCTCCG-3’
ABI3(At3g24650)j
forward primer5-TCCATTAGACAGCAGTCAAGGTTT-3，
reverse primer5-GGTGTCAAAGAACTCGTTGCTATC-3，
ABI4(At2g40220)
forward primer5-GGGCAGGAACAAGGAGGAAGTG-3，
reverse primer5-ACGGCGGTGGATGAGTTATTGAT-3，
ABI5(At2g36270)
forward primer5-CAATAAGAGAGGGATAGCGAACGAG-3，
reverse primer5-CGTCCATTGCTGTCTCCTCCA-3’
ERDlO(Atlg20450)
forward primer5-TCTCTGAACCAGAGTCGTTT-3’
reverse primer5-CTTCTTCTCACCGTCTTCAC-3，
KINl(At5gl5960)
forward primer5-ACCAACAAGAATGCCTTCCA-3’
reverse primer5-CCGCATCCGATACACTCTTT-3’
KIN2(At5gl5970)
forward primer5-ACCAACAAGAATGCCTTCCA-3’
reverse primer5-ACTGCCGCATCCGATATACT-3’
MYB2(At2g47190)
forward primer5-TGCTCGTTGGAACCACATCG-3’
reverse primer5-ACCACCTATTGCCCCAAAGAGA-3，
MYC2(Atlg32640)
forward primer5-TCATACGACGGTTGCCAGAA-3’
reverse primer5-AGCAACGTTTACAAGCTTTGATTG-3，
OSTl (At4g33950)
forward primer5-TGGAGTTGCGAGATTGATGAGAG-3，
reverse primer5-CCTGTGGTTGATTATCTCCCTTTTT-3，
RAB18(At5g66400)
forward primer5-CAGCAGCAGTATGACGAGTA-3’
reverse primer5-CAGTTCCAAAGCCTTCAGTC-3’
RD29A(At5g52310)
forward primer5-ATCACTTGGCTCCACTGTTGTTC-3，
reverse primer5-ACAAAACACACATAAACATCCAAAGT-3，
结果如图14D所示，其中十个重要的基因:ABI4, ABI5, ERD10, KIN1, KIN2, MYB2,
MYC2，OST1, RAB18和RD29A在Ihcb突变体中的表达被显著抑制。所有这些被抑制的基因都是正响应ABA的基因或编码ABA信号通路的正调节子。三个编码重要转录因子——ABA 信号通路的正调节子的基因，ABFl, ABF4和ABI3，在lhcb2，lhcb4，lhcb5突变体中也被显著抑制。ABFl和ABF4在IhcM突变体中的表达并没有明显变化，ABI3的表达在Ihcbl和 lhcb3突变体中也没有显著变化(图14D)。然而，ABIl和ABI2这两个直接作用于ABA受体PYR/PYL/RCAR(Fujii et al，2009)下游的，编码ABA信号通路负调节子的基因，在Ihcb突变体中的表达量并没有显著变化(图14D)。相反地，ABF2和ABF3这两个编码ABA信号通路正调节子的基因在除lh(A5和lhcb6以外的Ihcb突变体中表达量上调，在lh(A5和 lhcb6突变体中，ABF2和ABF3基因表达量没有明显变化(图14D)。这些ABA信号转导过程相关基因的表达量变化从根本上说明LHCB基因ABA信号的正调节子，但是这其中有一个潜在的复杂机制。九、调低或者敲除LHCB基因部分抑制wrky40突变体对ABA敏感的表型1、蛋白表达和萌发速率将 wrky401hcbl> wrky401hcb3> wrky401hcb6 突变体(wrky40Ihcbl 双突变体构建方法将Ihcbl未开花的花苞用镊子去除其雄蕊仅剩雌蕊，取下wrky40中开花或未开花的花苞中的雄蕊，在剥离剩余的雌蕊柱头上摩擦，使花粉充分接触柱头，将此雌蕊做标记， 荚果成熟后得到杂交Fl代种子，将Fl代种子再次播种，F2代生长，经PCR鉴定可得到纯合体；wrky401hcb3双突变体构建方法将Ihcb殊开花的花苞用镊子去除其雄蕊仅剩雌蕊，取下wrky40中开花或未开花的花苞中的雄蕊，在剥离剩余的雌蕊柱头上摩擦，使花粉充分接触柱头，将此雌蕊做标记，荚果成熟后得到杂交Fl代种子，将Fl代种子再次播种，F2代生长，经PCR鉴定可得到纯合体；wrky401hcb6双突变体构建方法将lhcb6未开花的花苞用镊子去除其雄蕊仅剩雌蕊，取下wrky40中开花或未开花的花苞中的雄蕊，在剥离剩余的雌蕊柱头上摩擦，使花粉充分接触柱头，将此雌蕊做标记，荚果成熟后得到杂交Fl代种子，将 Fl代种子再次播种，F2代生长，经PCR鉴定可得到纯合体)>wrky40和野生型Col提取RNA 和蛋白质，通过荧光定量PCR和免疫印迹检测(检测方法同上)LHCB6基因mRNA和蛋白水平的表达，免疫印迹以Actin为上样对照。蛋白条带下方框内的数值代表LHCB蛋白的相对表达量，并统计春化后72小时的萌发速率。以col为对照。结果如图15A所示，wrky401hcbl在0、0. 5、1、3μΜΑΒΑ培养基上的萌发速率为 100%,80%,65%,40% ；wrky401hcb3 在 0、0. 5、1、3μΜΑΒΑ 培养基上的萌发速率为 100 %、85 %、65 %、 50% ；wrky401hcb6突变体在0、0. 5、1、3 μ MABA培养基上的萌发速率为100%、80%、 62%,47% ；wrky40 在 0、0. 5、1、3μΜΑΒΑ 培养基上的萌发速率为 100%、75%、50%、25% ；col 在 0,0. 5、1、3 μ MABA 培养基上的萌发速率为 100% ,100% ,90% ,59% ；可以看出，双突变体可以显著抑制wrky40突变体在ABA抑制种子萌发方面对于 ABA敏感的表型。2、LHCBl，LHCB3, LHCB6表达量降低使wrky40突变体在萌发后生长方面对ABA的敏感性减弱将 wrky401hcbl、wrky401hcb3、wrky401hcb6 突变体、wrky40 种子直接播种在不含或含(0.6 μ M) ABA的培养基上生长9天后的结果。结果如图15Β所示，上图为表型观察图，下面的柱形图显示了在含有0.6μΜ ABA 的培养基上生长9天后，野生型和突变体主根伸长长度；wrky40Ihcbl的主根伸长长度为0. 58cm ；wrky401hcb3的主根伸长长度为0. 58cm ；
wrky401hcb6突变体的主根伸长长度为0. 58cm ；wrky40的主根伸长长度为0. 34cm ；col的主根伸长长度为1. OOcm ；3、在ABA诱导气孔关闭(上)及ABA抑制气孔开放方面，LHCB1, LHCB3, LHCB6表达量降低不影响wrky40突变体对ABA的响应将 wrky401hcbl> wrky401hcb3、wrky401hcb6 突变体、wrky40 种子直接播种在含 (0. 6 μ Μ) ABA的培养基上生长9天后的结果。结果如图15C所示，wrky40Ihcbl 在 0 μ M ABA 处理 0h、0 μ M ABA 处理 2. 5h、20 μ M ΑΒΑ 处理 2. 5h、 30 μ MABA处理2. 5h诱导气孔关闭的气孔开度分别为6. 0 μ m、5. 9 μ m、2. 5 μ m、0. 9 μ m ；wrky401hcb3 在 0 μ M ABA 处理 0h、0 μ M ABA 处理 2. 5h、20 μ M ABA 处理 2. 5h、 30 μ MABA处理2. 5h诱导气孔关闭的气孔开度分别为5. 7 μ m、5. 9 μ m、2. 0 μ m、1. 0 μ m ；wrky401hcb6 在 0 μ M ABA 处理 0h、0 μ M ABA 处理 2. 5h、20 μ M ABA 处理 2. 5h、 30 μ MABA处理2. 5h诱导气孔关闭的气孔开度分别为6. 0 μ m、5. 9 μ m、2. 5 μ m、1. 0 μ m ；wrky40 在 0 μ M ABA 处理 0h、0 μ M ABA 处理 2. 5h、20 μ M ABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理2. 5h诱导气孔关闭的气孔开度分别为5. 9 μ m、5. 9 μ m、2. 7 μ m、0. 8 μ m ；col 在 0 μ M ABA 处理 0h、0 μ M ABA 处理 2. 5h、20 μ M ABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理2. 5h诱导气孔关闭的气孔开度分别为6. 0 μ m、6. 0 μ m、2. 3 μ m、1. 0 μ m ；wrky40Ihcbl 在 0 μ M ABA 处理 0h、0 μ M ABA 处理 2. 5h、20 μ M ABA 处理 2. 5h、 30 μ MABA处理2. 5h抑制气孔开放的气孔开度分别为0. 8 μ m、6. 0 μ m、3. 0 μ m、l. 0 μ m ；wrky401hcb3 在 0 μ M ABA 处理 0h、0 μ M ABA 处理 2. 5h、20 μ M ABA 处理 2. 5h、 30 μ MABA处理2. 5h的抑制气孔开放的气孔开度分别为0. 8 μ m、5. 8 μ m、3. 0 μ m、l. 2 μ m ；wrky401hcb6 在 ΟμΜ ABA 处理 ΟΚΟμΜ ΑΒΑ 处理 2. 5h、20 μ M ΑΒΑ 处理 2. 5h、 30 μ MABA处理2. 5h的抑制气孔开放的气孔开度分别为0. 8 μ m、5. 6 μ m、3. 0 μ m、l. 0 μ m ；wrky40 在 0 μ M ABA 处理 0h、0 μ M ABA 处理 2. 5h、20 μ M ABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理2. 5h的抑制气孔开放的气孔开度分别为0. 6 μ m、5. 8 μ m、2. 8 μ m、l. 2 μ m ；col 在 0 μ M ABA 处理 0h、0 μ M ABA 处理 2. 5h、20 μ M ABA 处理 2. 5h、30 μ MABA 处理2. 5h的抑制气孔开放的气孔开度分别为0. 8 μ m、5. 7 μ m、2. 9 μ m、l. 0 μ m ；1-3每组数据为三次独立生物学重复的平均值。以前的实验结果证明wrky40突变体在ABA抑制种子萌发、抑制幼苗生长方面表现出对ABA敏感的表型，但是在ABA诱导的气孔关闭与ABA抑制气孔开放方面未表现出响应 ABA的表型。将lhcbl、lhcb3、lhcb6突变体分别与wrky40突变体杂交发现，双突变体可以显著抑制wrky40突变体在ABA抑制种子萌发和幼苗生长方面对于ABA敏感的表型(图 15A，15B)；但是对于wrky40突变体在响应ABA诱导的气孔关闭和ABA抑制气孔开放方面的表型并没有改变(图15C)。这可能是因为WRKY40参与的ABA信号通路在调节气孔运动方面有一套复杂的机制引起的，在这个过程中WRKY40功能的缺失可能会导致ABA信号通路复杂的效应。然而，这些数据提供了足够的遗传学证据表明LHCB作用于WRKY40转录因子的下游，与LHCB基因是WRKY40转录抑制子的直接靶基因结果一致。十、突变体lhcbl-6的分子和生化鉴定
图 16 (A-F) LHCB1-6 的 T-DNA 插入示意图.A，lhcbl-1 (salk-134810)； B, lhcb2(salk-005614) ；C, lhcb3(salk-036200) ；D, lhcb4 (salk-032779) ；Ε, lhcb5(salk-139667) ；F, lhcb6 (salk-074622). LP 和 RP 分别是鉴定 Ihcbs 用的基因组上左端引物和右端引物；LBal, T-DNA序列左端引物；RBal, T-DNA序列右端引物；T-DNAl和 T-DNAn分别代表插入的同一位点插入的第一个拷贝和最后一个拷贝(一个以上拷贝反向串联插入)。图16 (A)在LHCBl中，单拷贝的T-DNA序列插入到LHCBl基因的promoter区，具体的插入位置在启始密码子ATG上游-592nt和_523nt之间，插入导致70bp缺失；图16(B)在LHCB2中，T-DNA序列插入到LHCB2基因的启动子区，具体的插入位置在启始密码子ATG上游-102nt和之间，插入导致Mbp的缺失；图16(C)LHCB3中，T-DNA序列插入到LHCB3基因的第一个外显子区，具体的插入位置在启始密码子ATG下游120nt和125nt之间，插入导致6bp的缺失；图16(D)LHCB4中，T-DNA序列以反向串联的方式插入到LHCB4基因的promoter 区，具体的插入位置在启始密码子ATG上游-1263nt和-1247nt之间，插入导致17bp的缺失；图16(E)LHCB5中，T-DNA序列插入到LHCB5基因的promoter区，具体插入位置在启始密码子ATG上游-483nt和_477nt之间，插入导致7bp的缺失；图16(F)LHCB6中，T-DNA序列插入到LHCB6基因的promoter区，具体插入位置在启始密码子ATG上游-391nt和_346nt之间，插入导致46bp的缺失。图16 (G) RT-PCR和western blot检测突变体Ihcbl 6中LHCB的转录和翻译水平。免疫印迹检测以Actin为上样对照。实时定量PCR的柱形图，以野生型中相应基因的表达设为标准，突变体中的表达量为相对值，其中Ihcbl-I，lhcb2，hcb4, lhcb5, lhcb6 是被不同程度调低的，lhcb3是基因敲除突变体。Western blot检测，方框中的数值代表蛋白表达的相对水平。设定Col中LHCB蛋白量为100，突变体中LHCB蛋白量与之相比进行量
化。该实验重复三次，结果一致。图16(H)突变体(lhcbl lhcb6)中叶绿素a/b含量没有显著受到影响。左图 不同突变体中叶绿素a、叶绿素b及总的叶绿素含量。每一个数值都是三次独立生物学重复的平均值。右图不同突变体的幼苗生长状态没有叶绿素缺失的表型。十一、不同Ihcb突变体中内源ABA含量及干物质含量测定分析材料为生长两周的幼苗(野生型拟南芥col和突变体lhcb6)。(A) ABA水平。试剂盒通过ELISA测定莲座叶片中的ABA含量(Sigma试剂盒，Plant GrowthRegulator Immmunoassay DETECTION Kit)。(B)通过干重/鲜重估计干物质含量。结果如图17所示，显示突变体与野生型中的ABA及干物质含量没有显著差异。十二、wrky40 及 wrky40wrkyl8 突变体没有 gun 表型A、将野生型Col、cch, wrky40单突变体、wrky40wrkyl8双突变体种子直接播在不含或含5yMNF(NF Aorflurazon，是一种除草剂，将它添加进培养基后，幼苗的质体发育被严重破坏，质体向细胞核发出质体-核逆向信号；而这个过程产生的突变体，即不受NF影响，细胞核能继续编码质体基因的表型为与核解偶联的表型——GUN表型)的培养基上，春化三天后，放到IOOym0InT2s-1光照下，进行M小时连续光照，6天后取样荧光定量PCR检测。实验重复三次得到同样的结果。引物为以 LHCB6 forward primer 5‘-GCGATGGCAGCGGTTCTTG-3‘reverse primer 5，-CCATGGCGTTGCCCACTCA-3，为引物，以 β -Actin 为内参、内参的引物为 forward primer 5， -GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3， reverse primer 5’ -AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，，结果如图18A所示，在wrky40单突变体及wrkywrkyl8双突变体中均检测不到LHCBsmRNA的表达。B、将野生型Col、cch, wrky40单突变体种子直接播在不含或含5 μ MNF的培养基上，春化三天后，放到100 μ Hi0InT2s-1光照下，进行M小时连续光照，6天后取样免疫印迹检测。实验重复三次得到同样的结果。结果如图18Β所示，与在野生型、wrky40及wrkywrkyl8突变体一样，NF处理cch 后，LHCBs六个基因的表达均检测不到，显示了 GUN-type叶绿体反向信号的复杂性。所有这些结果表明wrky40和wrky40wrkyl8突变体是非gun突变体。从上述可以看出，LHCBs蛋白响应生理水平浓度ABA而增加的一个模式图如图19 所示，WRKY40转录因子抑制LHCB的表达，ABA促进WRKY40从细胞核进入细胞质，促进ABAR 与WRKY40互作，通过下调WRKY40的表达解除对LHCBs (LHCB1/2/3/4/5/6)基因的抑制作用。细胞质内合成的LHCB蛋白转运到叶绿体以维持LHCB蛋白的稳态，使植物适应环境的挑战，LHCB蛋白的稳态对ROS稳态的建立是必需的。
权利要求
1.一种控制植物性状的方法，是提高出发植物中LHCB6蛋白编码基因的表达，得到具有下述1)或幻特征的目的植物1)耐逆性高于所述出发植物；2)生长延缓于所述出发植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的植物生长延缓于所述出发植物为如下A或B A、所述目的植物种子的萌发迟于所述出发植物；B、所述目的植物根的生长迟于所述出发植物；所述提高出发植物中LHCB6蛋白编码基因的表达是在激素胁迫下进行； 所述激素具体为ABA ；所述LHCB6蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于 所述耐逆性为耐干旱性；所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物为拟南芥。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述提高出发植物中LHCB6蛋白编码基因的表达是通过向出发植物中导入所述LHCB6 编码基因实现的。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于 所述ABA胁迫为在植物幼苗期或者植物成龄期进行；所述在植物幼苗期ABA胁迫的浓度为0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA胁迫的浓度具体为 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成龄期ABA胁迫的浓度低于200 μ Μ,所述在植物成龄期ABA胁迫的浓度具体为 20 μ Μ、50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ Μ、200 μ Μ、300 μ Mo
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于 所述耐干旱性通过气孔开度和/或失水率体现； 所述根生长通过主根长度体现。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述提高LHCB6蛋白编码基因的表达是通过外源ABA激活ABAR-WRKY40信号通路实现。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述激活ABAR-WRKY40信号通路为外源的ABA激活植物的ABA受体，使ABA受体与结合有转录因子WRKY40的LHCB6启动子竞争结合转录因子WRKY40，释放LHCB6的启动子，使 LHCB6蛋白编码基因表达；所述ABA受体的氨基酸序列为序列表中的序列2 ；所述ABA受体的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；所述转录因子WRKY40的氨基酸序列为序列表中的序列4 ；所述转录因子WRKY40的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；所述LHCB6启动子的核苷酸序列为序列表中的序列6。
9.一种控制植物性状的方法，是降低目的植物中LHCB6蛋白编码基因的表达，得到具有下述1)或幻特征的植物1)耐逆性低于所述目的植物；2)生长快于所述目的植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于 所述植物的生长快于所述出发植物为如下A或B A)所述植物的种子的萌发早于所述目的植物；B)所述植物的根的生长早于所述目的植物；所述降低目的植物中LHCB6蛋白编码基因的表达是在激素胁迫下进行； 所述激素具体为ABA ；所述LHCB6蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1 ； 所述耐逆性为耐干旱性；所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物为拟南芥； 所述ABA胁迫为在植物幼苗期或者植物成龄期进行；所述在植物幼苗期ABA胁迫的浓度为0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA胁迫的浓度具体为 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成龄期ABA胁迫的浓度低于200 μ Μ,所述在植物成龄期ABA胁迫的浓度具体为 20μΜ、50μΜ、100μΜ、150μΜ、200μΜ、300μΜ ；所述耐干旱性具体通过气孔开度和/或失水率体现； 所述根生长具体通过主根长度体现；所述降低LHCB6蛋白编码基因的表达是通过外源ABA激活ABAR-WRKY40信号通路实现；所述激活ABAR-WRKY40信号通路具体为外源的ABA激活植物的ABA受体，使ABA受体与结合有转录因子WRKY40的LHCB6启动子竞争结合转录因子WRKY40，释放LHCB6的启动子，使LHCB6蛋白编码基因表达；所述ABA受体的氨基酸序列为序列表中的序列2 ；所述ABA受体的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；所述转录因子WRKY40的氨基酸序列为序列表中的序列4 ；所述转录因子WRKY40的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；所述LHCB6启动子的核苷酸序列为序列表中的序列6。
11.一种提高植物耐逆性或延缓植物生长的方法，包括如下步骤用ABA对植物进行胁迫，得到具有如下性状的植物1)目的植物耐逆性高于出发植物；2)目的植物的生长延缓于出发植物；将处理前的植物记作出发植物，将处理后的植物记作目的植物。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于 所述ABA胁迫为在植物幼苗期或者植物成龄期进行；所述在植物幼苗期ABA胁迫的浓度为0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA胁迫的浓度具体为 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成龄期ABA胁迫的浓度低于200 μ Μ,所述在植物成龄期ABA胁迫的浓度具体为 20μΜ、50μΜ、100μΜ、150μΜ、200μΜ、300μΜ ；所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物为拟南芥。
全文摘要
本发明公开捕光色素叶绿素a/b结合蛋白LHCB6在植物育种中的应用。本发明提供了LHCB6蛋白提高植物耐逆性中的应用。所述提高植物耐逆性受激素胁迫。所述激素为ABA；所述LHCB6蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2。所述提高植物耐逆性为如下1)或2)1)向LHCB6表达失活的突变体植物中导入LHCB6蛋白的编码基因，得到LHCB6蛋白表达恢复的植物，所述LHCB6蛋白表达恢复的植物的耐逆性高于所述LHCB6蛋白表达失活的突变体；2)LHCB6蛋白表达失活的突变体的耐逆性高于LHCB6表达的植物。本发明的实验证明，ABA调节LHCB6的表达是通过ABAR/CHLH参与的信号通路。
文档编号C12N15/84GK102229955SQ20111014893
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者严璐, 刘志强, 刘蕊, 张大鹏, 徐艳红, 王小芳 申请人:清华大学