专利名称：一种辅助鉴定早熟禾属植物的方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助鉴定早熟禾属植物的方法。
背景技术：
草坪草是一种城市绿化植物，也广泛应用于体育场地、高速公路及河岸提坡防护、消除污染等方面，体现了巨大的生态效益。草坪草种类繁多，生长环境迥异，按气候条件分类可分为暖季型草坪草和冷季型草坪草，按不同科属分类可分为禾本科虎尾草亚科 Poaceae (Gramineae) (7 个属)、黍亚科 Panicoideae (6 个属)、早熟禾亚科 Pooideae (12 个属)，以及莎草科Cyeraceae O个属)和豆科及旋花科的一些品种等。早熟禾属(Poa L)植物为禾本科早熟禾亚科多年生草本，喜光、耐阴性差、具有很强的耐寒能力、抗旱性差，夏季炎热时生长停滞、春秋季生长繁茂，喜冷凉湿润的环境，根茎繁殖力强、再生性好、形成草皮的能力极强、耐践踏、绿期长。早熟禾属(Poa L)植物是北方建植各类绿地的主要草种，也是建植运动场草坪的主要草种。在草坪草杂交育种工作中，为了提高杂交育种的效率和成功率，需要选用亲缘关系较近且品质优良的两个品种进行杂交。因此杂交育种的前期工作，就是要明确每个品种的亲缘关联、隶属关系等。长期以来，生物学家主要通过形态学和解剖学证据划分不同的物种，但这些表型特征种类有限，且容易受到环境因素和发育阶段的影响，加之自然选择导致的普遍趋同效应和平行进化因素等，使得物种系统发育关系的判断困难重重。草坪草基因组复杂，长期自然或人工选择的结果，产生了各种各样的草坪草种类，包括各种各样的生态类型、丰富多彩的野生资源等。如果不能高效准确的鉴别草坪草不同的基因型，确认它们之间的亲缘关系，杂交育种的亲本选择就存在一定的盲目性，多样化草坪草基因资源的利用就会受到极大的限制。基因作为遗传信息的载体，保留了很多进化的痕迹，同一基因在不同物种中的序列差异可以作为分类鉴定的分子标记，具有信息量大、能够稳定遗传等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定早熟禾属植物的方法。本发明提供了辅助鉴定早熟禾属(Poa L)植物的引物对，由序列表的序列1所示 DNA(DNA区段)和序列表的序列2所示(DNA区段)区段组成。所述早熟禾属植物具体可为Nuglade(中文名称为新哥求德，英文名称为 NuGlade)、America (中文名称为美洲王，英文名称为America)、Award (中文名称为奖品，英文名称为award)、Youmei (中文名称为优美，英文名称为Euromyth)、Carbenet、 Freedom3(中文名称为自由3，英文名称为Freedom 3)、Dayue jin (中文名称为大跃进，英文名称为Quantum Leap)或Siufeng(中文名称为珠峰，英文名称为Everest)。所述引物对可用于制备辅助鉴定早熟禾属植物的试剂盒。所述早熟禾属植物具体可为Nuglade(中文名称为新哥求德，英文名称为NuGlade)、America (中文名称为美洲王，英文名称为America)、Award (中文名称为奖品，英文名称为award)、Youmei (中文名称为优美，英文名称为Euromyth)、Carbenet、 Freedom3(中文名称为自由3，英文名称为Freedom 3)、Dayuejin (中文名称为大跃进，英文名称为Quantum Leap)或Zhufeng (中文名称为珠峰，英文名称为Everest)。
所述弓ι物对可用于辅助鉴定早熟禾属植物。所述早熟禾属植物具体可为Nuglade(中文名称为新哥求德，英文名称为 NuGlade)、America (中文名称为美洲王，英文名称为America)、Award (中文名称为奖品，英文名称为award)、Youmei (中文名称为优美，英文名称为Euromyth)、Carbenet、 Freedom3(中文名称为自由3，英文名称为Freedom 3)、Dayuejin (中文名称为大跃进，英文名称为Quantum Leap)或Siufeng (中文名称为珠峰，英文名称为Everest)。本发明还保护一种辅助鉴定早熟禾属植物的方法，包括如下步骤以待测植物的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物待测植物为候选的早熟禾属植物，如果没有得到PCR扩增产物待测植物为候选的非早熟禾属植物。所述PCR扩增产物具体可为180bp。所述待测植物具体可为剪股颖属(Agrostis)植物、早熟禾属(Poa)植物、羊茅属 (Festuca)植物、结缕草属(Zoysia)植物、黑麦草属(Lolium)植物或狗牙根属(Cynodon) 植物。所述剪股颖属植物具体可为A4(中英文名称均为PennA4)、Century、Putter、 hcbpendence、Declaration、L93、Shark、NTAS、FTAS 或 Backspin。所述早熟禾属植物具体可为Nuglade (中文名称为新哥求德，英文名称为NuGlade)、America (中文名称为美洲王， 英文名称为America)、Award (中文名称为奖品，英文名称为award) Joumei (中文名称为优美,英文名称为Euromyth)、Carbenet, Freedom3 (中文名称为自由3，英文名称为Freedom 3) ,Dayuejin (中文名称为大跃进，英文名称为Quantum Leap)或Siufeng (中文名称为珠峰，英文名称为Everest)。所述羊茅属植物具体可为PicasscKQiangjin (中文名称为强劲， 英文名称为hferno)、Dynasty (中文名称为王朝，英文名称为Dyansty)、Starlet (中文名称为新秀，英文名称为Marlet)、Day (中文名称为帝王，英文名称为Diva)、Arid3 (中文名称为爱瑞3，英文名称为Arid 3)或Hoimdog (中文名称为猎狗5，英文名称为Hoimdog 5)。 所述结缕草属植物具体可为结缕草(英文名称为Lawngrass)或青岛结缕草(英文名称为 Qingdao Lawngrass)。所述黑麦草属植物具体可为LeishenIV(中文名称为雷神4号，英文名称为Blazer 4) ,Cutter或Qi jian。所述狗牙根属植物具体可为狗牙根不脱壳包衣(中文名称为狗亚根(不脱壳，包衣)，英文名称为Common Burmudagrass)或狗牙根脱壳(中文名称为狗亚根(脱壳)，英文名称为Unhulled Burmudagrass)。本发明还保护辅助鉴定早熟禾属植物的试剂盒，包括引物对甲；所述引物对甲由序列表的序列1所示DNA (DNA区段)和序列表的序列2所示DNA (DNA区段)组成。所述试剂盒还可包括引物对乙；所述引物对乙由序列表的序列3所示DNA (DNA区段)和序列表的序列4所示DNA(DNA区段)组成。所述试剂盒可用于辅助鉴定早熟禾属植物。所述早熟禾属植物具体可为Nuglade(中文名称为新哥求德，英文名称为 NuGlade)、America (中文名称为美洲王，英文名称为America)、Award (中文名称为奖品，英文名称为award)、Youmei (中文名称为优美，英文名称为Euromyth)、Carbenet、 Freedom3(中文名称为自由3，英文名称为Freedom 3)、Dayue jin (中文名称为大跃进，英文名称为Quantum Leap)或Siufeng(中文名称为珠峰，英文名称为Everest)。本发明还保护辅助鉴定早熟禾属植物的方法，包括如下步骤以待测植物的基因组DNA为模板，分别用所述引物对甲和所述引物对乙进行PCR扩增；如果用所述引物对甲能得到PCR扩增产物且用所述引物对乙能得到PCR扩增产物，待测植物为候选的早熟禾属植物；如果用所述引物对甲不能得到PCR扩增产物且用所述引物对乙能得到PCR扩增产物，待测植物为候选的非早熟禾属植物。用所述引物对甲得到的PCR扩增产物具体可为180bp (180bp左右)。用所述引物对乙得到的PCR扩增产物具体可为221bp (221bp左右)。所述待测植物具体可为剪股颖属(Agrostis)植物、早熟禾属(Poa)植物、羊茅属 (Festuca)植物、结缕草属(Zoysia)植物、黑麦草属(Lolium)植物或狗牙根属(Cynodon) 植物。所述剪股颖属植物具体可为A4(中英文名称均为PennA4)、Century、Putter、 hcbpendence、Declaration、L93、Shark、NTAS、FTAS 或 Backspin。所述早熟禾属植物具体可为Nuglade (中文名称为新哥求德，英文名称为NuGlade)、America (中文名称为美洲王， 英文名称为America)、Award (中文名称为奖品，英文名称为award) Joumei (中文名称为优美,英文名称为Euromyth)、Carbenet, Freedom3 (中文名称为自由3，英文名称为Freedom 3) ,Dayuejin (中文名称为大跃进，英文名称为Quantum Leap)或Siufeng (中文名称为珠峰，英文名称为Everest)。所述羊茅属植物具体可为PicasscKQiangjin (中文名称为强劲， 英文名称为hferno)、Dynasty (中文名称为王朝，英文名称为Dyansty)、Starlet (中文名称为新秀，英文名称为Marlet)、Day (中文名称为帝王，英文名称为Diva)、Arid3 (中文名称为爱瑞3，英文名称为Arid 3)或Hoimdog (中文名称为猎狗5，英文名称为Hoimdog 5)。 所述结缕草属植物具体可为结缕草(英文名称为Lawngrass)或青岛结缕草(英文名称为 Qingdao Lawngrass)。所述黑麦草属植物具体可为LeishenIV(中文名称为雷神4号，英文名称为Blazer 4)、Cutter或Qi jian。所述狗牙根属植物具体可为狗牙根不脱壳包衣(中文名称为狗亚根(不脱壳，包衣)，英文名称为Common Burmudagrass)或狗牙根脱壳(中文名称为狗亚根(脱壳)，英文名称为Unhulled Burmudagrass)。本发明通过对不同草坪草种属品种抗逆性基因AsEXPl的克隆，分析其序列位点差异，了解该基因在不同种属间的变异规律，并通过种属间序列特征分析，筛选得到了早熟禾属草坪草特异性的分子标记，以及用于鉴定所述分子标记的特异引物对。本发明提供的特异引物对(CAs4F/CAs4R)可以辅助鉴定早熟禾属(Poa)植物，可以用于草坪草种属品种的鉴定、亲缘关系分析及进化路径分析等，并为草坪草的分子标记辅助育种和品种遗传改良工作提供理论基础和技术支持。
图1为利用cAslF/cAslR对不同草坪草品种基因组DNA的PCR扩增结果；泳道1_6 依次为 A4、Century、Carbenet、Award、Starlet、Arid3 ；Μ, DL2000 ladder。图2为基于AsEXPl基因片段序列多态性建立的草坪草不同种属间系统进化树。
图3为3个属6个草坪草品种AsEXPl基因片段序列比对结果。图4为2种引物组合对草坪草3个属6个品种的PCR扩增结果；A 采用cAs4F和 cAs4R组成的引物对；B 采用cAs2F和cAs2R组成的引物对；泳道1_6依次为草坪草品种 A4、Century>Carbenent>Award>Starlet、Arid3。图5为2种引物组合对草坪草6个属32个品种的PCR扩增结果；A 采用cAs4F和 cAs4R组成的引物对；B 采用cAs2F和cAs2R组成的引物对；1 :A4 ；2 =Century ；3 =Putter ； 4 Independence ；5 !Declaration ；6 :Nuglade ；7 America ；8 Award ；9 Youmei ； 10 结缕草；11 =Picasso ；12 =Qiangjin ；13 =Dynasty ；14 =Starlet ；15 =Day ；16 狗牙根不脱壳包衣；17 :L93 ；18 =Shark ；19 =NTAS ；20 =FTAS ；21 =Backspin ；22 =Carbenet ；23 :Freedom3 ； 24 =Dayuejin ；25 =Zhufeng ；26 青岛结缕草；27 :Arid3 ；28 =Houndog ；29 =LeishenIV ；30 Cutter ；31 =Qijian ；32 狗牙根脱壳。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、草坪草种属特异性分子标记的筛选和特异引物对的设计一、AsEXPl基因片段克隆及序列分析从草坪草剪股颖属、早熟禾属、羊茅属中随机选取各2个品种(A4、CentrUy为剪股颖属，Carbenet, Award为早熟禾属，Marlet、Arid3为羊茅属)，以基因组DNA为模板，用 cAslF和cAslR组成的引物对进行AsEXPl基因的同源片段扩增。见图1。结果显示，所有检测品种在460bp左右均有一特异性条带，不同品种草坪草的同源片段大小相近，在1. 5% 的琼脂胶上无法分辨。二、AsEXPl基因片段的同源性比较分析将上述扩增的条带切割、回收并克隆，测序后去除内含子部分并进行序列比对。图 3为多重序列比对结果(所注碱基位置均以统一序列为准)，可以看出不同品种间序列呈现多态性，并显示出很好的属间特异性。其中，剪股颖属的2个品种AsEXPl基因同源片段长度为368bp，早熟禾属为359bp，羊茅属为371bp。与剪股颖属相比，早熟禾两个品种在261 到270bp处有9bp的缺失，羊茅属两品种在40到43bp处有一个!3bp的插入。在核苷酸替换方面，剪股颖属的两个品种在30bp和31bp处为GG，而其它2个属的品种为CT ；在240bp 处，剪股颖属为G，其他属为C ；早熟禾在116、117、119bp处分别为G、T、G，而另外2个属的品种皆为A、G、C ；在处，早熟禾属品种碱基分别为G、T、C，而其他属品种碱基为C、Gλ G0表1为同源性比对结果，同属内不同品种间同源性很高，同为剪股颖属的Α4和 Century的同源性为99. 46%，同为早熟禾属的Carbenet和Award为99. 72%，同为羊茅属的Marlet和和Arid3的同源性为97. 04%；不同属的品种间的差异相对较大，如Carbenet 和Century同源性仅为91. 92%。表1 不同品种间AsEXPl基因片段序列两两同源率比较结果(DNAMAN比对结果)
品种A4CenturyCarbenetAwardStarletCentury99. 46%Carbenet91. 92%91. 92%Award92. 20%92. 20%99. 72%Starlet93. 21%93. 21%93. 59%93. 31%Arid393. 75%93. 21%93. 31%93. 04%97. 04%图2为进化树分析结果，同属的两个品种均聚在一个分支上，3个属分属两个大的分支，其中早熟禾属单独一个分支，剪股颖属和羊茅属隶属同一分支，显示这两个属具有较近的亲缘关系。三、草坪草种属特异性分子标记的筛选上述分析结果显示，AsEXPl基因片段在不同草坪草中呈现DNA序列的种属特异性。设计cAs4F和cAs4R组成的特异性引物，设计cAs2F和cAs2R组成的保守引物。cAs4F(上游引物)5，-GCCACGTTCTACGGCGGTGG-3，(序列表的序列 1)；cAs4R(下游引物)5，-CGGCACGCAGTAGCTCCCCT-3，(序列表的序列 2)。cAs4F和cAs4R的靶序列为序列表的序列5自5，末端第97-276位核苷酸，180bp。cAs2F(上游引物)5，-CGACGCGTCCGGCACAATGG-3，(序列表的序列 3)；cAs2R(下游引物):5，-CGTCGTTGGGCAGCGCGTAG-3，(序列表的序列 4)。cAs2F和cAs2R的靶序列为序列表的序列5自5’末端第117-337位核苷酸，221bp。用cAs4F和cAs4R组成的引物对对6个品种的基因组DNA进行扩增，只在早熟禾属中有特异性扩增，在其他2个属中均无条带。用cAs2F和cAs2R组成的引物对对6个品种的基因组DNA进行扩增，在所有6个品种中均有条带显示(图4)。实施例2、特异引物对的应用(草坪草种属特异分子标记的验证)实验样本如下剪股颖属(10个品种):A4(中英文名称均为 PennA4)参考文献Journal of Experimental Botany ； 2007,58(13) :3789-3796。Century 参考文献Journal of Experimental Botany ；2007,58 (13) 3789-3796。Putter 参考文献 Journal of Experimental Botany ；2007, 58 (13) :3789_3796。Independence 参考文献Journal of Experimental Botany ；2007, 58 (13) 3789-3796。Declaration 参考文 Journal of Experimental Botany ；2007,58(13) 3789-3796。L93 参考文献Journal of Experimental Botany ；2007, 58 (13) :3789_3796。
Shark 参考文献Journal of Experimental Botany ；2007, 58 (13) :3789_3796。NTAS 参考文献Journal of Experimental Botany ；2007, 58 (13) :3789_3796。FTAS 参考文献Journal of Experimental Botany ；2007, 58 (13) :3789_3796。Backspin 参考文 Journal of Experimental Botany ；2007,58 (13) 3789-3796。早熟禾属(8个品种)Nuglade (中文名称为新哥求德，英文名称为NuGlade)购自中种公司，产品目录号为 70-76-0;3B。America(中文名称为美洲王，英文名称为America)购自中种公司，产品目录号为 69-19-03。Award(中文名称为奖品，英文名称为award)购自中种公司，产品目录号为 70-557-00A。^umei (中文名称为优美，英文名称为Euromyth)购自中种公司，产品目录号为 70-557-00A。Carbenet 购自北京北方杰士生物科技有限责任公司。Freedom3(中文名称为自由3，英文名称为Freedom 3)购自中种公司，产品目录号为 70-94-04B。Dayuejin (中文名称为大跃进，英文名称为Quantum Leap)购自中种公司，产品目录号为68-441-00。amfeng(中文名称为珠峰，英文名称为Everest)购自中种公司，产品目录号为 70-88-03。羊茅属(7个品种)Picasso 购自北京北方杰士生物科技有限责任公司。Qiangjin (中文名称为强劲，英文名称为hferno)购自中种公司，产品目录号为 B18-5-30TF。Dynasty (中文名称为王朝，英文名称为Dyansty)购自中种公司，产品目录号为 LA18-5-57。Marlet (中文名称为新秀，英文名称为Marlet)购自中种公司，产品目录号为 L5-5-TF46。Day(中文名称为帝王，英文名称为Diva)购自中种公司，产品目录号为 M146-GBS-BD5-453-3。Arid3(中文名称为爱瑞3，英文名称为Arid 3)购自北京北方杰士生物科技有限
责任公司。Houndog(中文名称为猎狗5，英文名称为Houndog 5)购自中种公司，产品目录号为 Y41-6-HD5-41-1。结缕草属O个品种)结缕草(英文名称为Lawngrass)购自中种公司。青岛结缕草(英文名称为Qingdao Lawngrass)购自中种公司，产品目录号为 L30-5-7。
8
黑麦草属(3个品种)LeishenIV(中文名称为雷神4号，英文名称为Blazer 4)购自中种公司，产品目录号为Y21-5-70。Cutter 购自北京北方杰士生物科技有限责任公司。Qijian(中文名称为旗舰，英文名称为Flagship)购自中种公司。狗牙根属O个品种)狗牙根不脱壳包衣(中文名称为狗亚根(不脱壳，包衣)，英文名称为Common Burmudagrass)购自中种公司。狗牙根脱壳(中文名称为狗亚根(脱壳)，英文名称为Unhulled Burmudagrass) 购自中种公司。分别提取各个实验样本的叶片的基因组DNA，将每个样本的基因组DNA分别用引物对甲(cAs4F和cAs4R组成的引物对)和引物对乙(cAs2F和cAs2R组成的引物对)进行 PCR扩增，用引物对甲PCR扩增得到的PCR扩增产物命名为PCR扩增产物甲，用引物对乙PCR 扩增得到的PCR扩增产物命名为PCR扩增产物乙。PCR 扩增体系 QO 微升)10XPCR buffer 2 μ l,5mmol/L dNTPs 1 μ 1, Mg2+I μ 1, 5口11101/1上游引物和5“11101/1下游引物各1μ l,40ng/y 1基因组DNA 1μ 1， υ/μ 1高保真 DNA 聚合酶 0. 5μ 1，ddH20 12. 5μ1。PCR扩增参数为95°C预变性IOmin ；95°C变性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸 lmin，共35个循环；最后72°C延伸IOmin0将各个实验样本得到的PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图5。结果显示，cAs4F和cAs4R组成的特异性引物只在早熟禾属品种(8个品种)中有扩增条带，而其他5个属的品种中均不见明显条带，而cAs2F和cAs2R组成的保守引物在6 个属的32个品种均有扩增。
权利要求
1.辅助鉴定早熟禾属植物的引物对，由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。
2.权利要求1所述引物对在制备辅助鉴定早熟禾属植物的试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述引物对在辅助鉴定早熟禾属植物中的应用。
4.一种辅助鉴定早熟禾属植物的方法，包括如下步骤以待测植物的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物待测植物为候选的早熟禾属植物，如果没有得到PCR扩增产物待测植物为候选的非早熟禾属植物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述PCR扩增产物为ISObp；所述待测植物为剪股颖属(Agrostis)植物、早熟禾属(Poa)植物、羊茅属O^estuca)植物、结缕草属 (Zoysia)植物、黑麦草属(Lolium)植物或狗牙根属(Cynodon)植物。
6.辅助鉴定早熟禾属植物的试剂盒，包括引物对甲；所述引物对甲由序列表的序列1 所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括引物对乙；所述引物对乙由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
8.权利要求6或7所述试剂盒在辅助鉴定早熟禾属植物中的应用。
9.一种用权利要求7所述试剂盒辅助鉴定早熟禾属植物的方法，包括如下步骤以待测植物的基因组DNA为模板，分别用所述引物对甲和所述引物对乙进行PCR扩增；如果用所述引物对甲能得到PCR扩增产物且用所述引物对乙能得到PCR扩增产物，待测植物为候选的早熟禾属植物；如果用所述引物对甲不能得到PCR扩增产物且用所述引物对乙能得到 PCR扩增产物，待测植物为候选的非早熟禾属植物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于用所述引物对甲得到的PCR扩增产物为ISObp ；用所述引物对乙得到的PCR扩增产物为221bp ；所述待测植物为剪股颖属 (Agrostis)植物、早熟禾属(Poa)植物、羊茅属O^estuca)植物、结缕草属(Zoysia)植物、 黑麦草属(Lolium)植物或狗牙根属(Cynodon)植物。
全文摘要
本发明公开了一种辅助鉴定早熟禾属植物的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤以待测植物的基因DNA为模板，用序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物，待测植物为早熟禾属植物。本发明通过对不同草坪草种属品种抗逆性基因AsEXP1的克隆，分析其序列位点差异，了解该基因在不同种属间的变异规律，并通过种属间序列特征分析，筛选得到了早熟禾属草坪草特异性分子标记。本发明提供的特异引物对(cAs4F/cAs4R)可以辅助鉴定早熟禾属品种，可以用于草坪草种属品种的鉴定、亲缘关系分析及进化路径分析等，并为草坪草的分子标记辅助育种和品种遗传改良工作提供理论基础和技术支持。
文档编号C12N15/11GK102304577SQ201110248309
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者代亮, 徐倩, 徐吉臣, 徐筱 申请人:北京林业大学