专利名称：一种蓟柄锈菌的离体保存方法
技术领域：
本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种蓟柄锈菌的离体保存方法。
背景技术：
锈菌，菌丝有隔膜，初生菌丝单核，随后双核化，生长在寄主的细胞间隙，以吸器侵入细胞。吸器一般围绕着细胞核与细胞质紧密地结合在一起。锈菌的细胞质中含有核微粒、 线粒体、肉质网、糖元颗粒和类脂体。菌丝隔膜的结构与高等担子菌不同，而与子囊菌近似， 向心生长，上下各有1层电子密集层，中间为1层电子稀薄层，从四周向中心逐渐变薄。中央有被填充物填塞的孔，上下无盖状结构。锈菌不生子实体，只生孢子器和孢子。最典型的锈菌有5类孢子，即性孢子、锈孢子、夏孢子、冬孢子和担孢子，其中夏孢子在生长季节中可连续产生多次，是多数植物锈病的主要孢子形态，在植物锈病的发生中起主导作用。锈菌易引发植物发生锈病，锈菌在自然条件下只能在活的寄主植物体上生长，寄主植物被锈病菌侵染后，在叶片、叶鞘或茎等植物器官组织上长出铁锈状的孢子堆。锈病是流行性很强的植物病害。2006年我们在山东青岛地区发现了染锈菌的杂草小蓟植株，患病植株轻者矮化， 或不能正常开花结籽，重者死亡。病叶背面长满了锈色的孢子粉。申请人对小蓟植株的锈菌进行了鉴定，发现其属于担子菌亚门，冬孢菌纲，锈菌目，柄锈菌科，柄锈菌属，蓟柄锈菌 (Puccinia obtegens )。夏孢子近圆形，黄褐色至褐色，直径为沈-27. 5 μ m，有微细小刺。冬孢子短椭圆形，双细胞大小为32-39 X 21-27 μ m，褐色有微细小疣，横隔处不缢所，柄很短， 无色透明。申请人对该锈菌进行了详细地研究，以期为杂草小蓟的生物防治开辟新的资源。 并且，以此锈菌作为杂草小蓟生物防治的新菌源。长期以来，杂草防除问题对农业生产提出了严峻的挑战。McWhorter等和Parker 等统计结果表明，由杂草造成的全球农作物平均产量损失大约为12%。20世纪50年代除草剂的销量只占整个农业化学剂总销量的20%，而20世纪80年代上升为50%，此后上升为 60%。化学除草剂的大量应用，已明显暴露出诸多弊端，首先是除草剂雾滴飘移，药液挥发， 选择性不理想，降解产物危害作物，甚至造成作物药害；其次是反复使用除草剂造成耐药杂草种群的上升、抗除草剂杂草的出现和对环境污染的加重。由此可见，寻求更为安全有效的除草剂已成为除草剂产业今后的发展方向。生物除草剂有利于环境保护，并对杂草防除有效。尤其是植物病原物除草剂越来越突现出优点，在一定程度上激发人们对其产生浓厚的兴趣。小蓟又称刺儿菜[C印halanoplos segetum (Bunge) Kitam.]，是我国农田(包括烟田) 的主要杂草之一，发生十分广泛。小蓟与其它农田杂草一样与作物竞争水、肥和空间，直接影响作物的产量和质量。目前农田杂草的防除主要依靠人工除草和化学除草剂防除，大量化学农药的使用也是无公害烟叶生产的主要障碍。为此，针对小蓟病原锈菌进行研究，以期为小蓟等杂草的生物防治开辟新的途径。通常锈菌只能在活体植株上保存，即，锈菌不能在人工培养基上培养。因此，迫切需要研制一种保存简单，操作方便，夏孢子萌发率高，并能够达到研制生防制剂目的离体保存方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，发明一种新的保存简单，操作方便，夏孢子萌发率高，并能够达到研制生防制剂目的蓟柄锈菌离体保存方法。为了实现上述目的，本发明提供了一种蓟柄锈菌离体保存方法，其中，按照下述步骤操作a、制备夏孢子粉，b、取一种固体颗粒，并在其表面喷洒一层羧甲基纤维素钠水溶液，然后滚上一层夏孢子粉，c、A粉包衣10 15层，形成以固体颗粒为核心的颗粒，d、B粉包衣次外层，e、滑石粉包衣最外层，f、晾干并贮藏。步骤a为从田间人工采集感染了蓟柄锈菌的小蓟植株，然后在室内进行单孢纯化，人工接种小蓟，使小蓟感染蓟柄锈菌。然后用手术刀从发病的小蓟叶片上刮取成熟的夏孢子，将刮取的夏孢子与其3 5倍重量分数的A粉混合制成夏孢子粉。步骤b为用天平称取与夏孢子粉等重量的固体颗粒，然后在颗粒表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，充分搅拌使羧甲基纤维素钠水溶液均勻地分布在颗粒表面；将颗粒与夏孢子粉混合，并滚动颗粒，直至所有的夏孢子粉全部均勻滚粘在颗粒的表面。步骤c为再次在颗粒表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，喷后在颗粒表面再滚粘上A粉1层；上述操作重复10 15次，直至粘有A粉的颗粒，能够通过8目 10目的筛孔为准，粘有A粉的颗粒要求大小均勻。步骤d为在步骤c所得的颗粒的表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，再均勻滚粘上B粉1层。步骤e为在步骤d所得的颗粒的表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，再均勻的滚粘上滑石粉，使颗粒表面形成了滑石粉层。步骤f为过筛，选取通过了 8目 10目的颗粒，并在室内室温下晾干20 观小时；将晾干的颗粒装入离心管中并封闭离心管，于4°C和-20°C冰箱保存。所述A粉的成分为金叶牌烟草包衣剂型号A，其由六和农业科学研究所生产。所述B粉的成分为金叶牌烟草包衣剂型号B，其由六和农业科学研究所生产。蓟柄锈菌夏孢子经本发明保存方法保存120天时，其萌发率高于80%。所述固体颗粒的大小为40 50目，所述固体颗粒为灭活的烟草种子、油菜种子、 大白菜种子或硅胶颗粒中的任一种。步骤c中重复操作10 15次的具体操作为“在固体颗粒表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，喷后在固体颗粒表面再滚粘上A粉1层。
本发明的优点在于，方法简单，操作方便，易于保存，保存效果好，夏孢子萌发率高，能够达到研制生防制剂目的的离体保存。具体为通常植物病原锈菌只能在活体植株上保存，S卩，锈菌不能在人工培养基上培养，而本发明采用离体保存方式，创新了保存方法，又能保证经此保存的锈菌具有高萌发率。利用烟草包衣剂的A粉和B粉对夏孢子进行包衣，A粉包衣夏孢子10 15层，B 粉包衣次外层，滑石粉包衣最外层，这种保存方法简单，不仅使锈菌变得易于保存，而且保存效果好。本发明的保存方法，可以有力的支撑蓟柄锈菌的研究，以期为小蓟等杂草的生物防治开辟新的途径。
图1为本发明保存方法的示意流程图。
具体实施例方式下面结合附图，对发明进行说明。如图1所示，图1为本发明保存方法的示意流程图。本发明提供了一种蓟柄锈菌的离体保存方法，其中，按照下述步骤操作a、制备夏孢子粉，b、取一种固体颗粒，并在其表面喷洒一层羧甲基纤维素钠水溶液，然后滚上一层夏孢子粉，c、A粉包衣10 15层，形成以固体颗粒为核心的颗粒，d、B粉包衣次外层，e、滑石粉包衣最外层，f、晾干并贮藏。步骤a为从田间人工采集感染了蓟柄锈菌的小蓟植株，然后在室内进行单孢纯化，人工接种小蓟，使小蓟感染蓟柄锈菌。然后用手术刀从发病的小蓟叶片上刮取成熟的夏孢子，将刮取的夏孢子与其3 5倍重量分数的A粉混合制成夏孢子粉。步骤b为用天平称取与夏孢子粉等重量的固体颗粒，然后在颗粒表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，充分搅拌使羧甲基纤维素钠水溶液均勻地分布在颗粒表面；将颗粒与夏孢子粉混合，并滚动颗粒，直至所有的夏孢子粉全部均勻滚粘在颗粒的表面。步骤c为再次在颗粒表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，喷后在颗粒表面再滚粘上A粉1层；；上述操作重复10 15次，直至粘有A粉的颗粒，能够通过 8目 10目的筛孔为准，粘有A粉的颗粒要求大小均勻。步骤d为在步骤c所得的颗粒的表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，再均勻滚粘上B粉1层。步骤e为在步骤d所得的颗粒的表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，再均勻的滚粘上滑石粉，使颗粒表面形成了滑石粉层。
5
步骤f为过筛，选取通过了 8目 10目的颗粒，并在室内室温下晾干20 观小时；将晾干的颗粒装入离心管中并封闭离心管，于4°C和-20°C冰箱保存。A粉的成分为金叶牌烟草包衣剂型号A，其由六和农业科学研究所生产。B粉的成分为金叶牌烟草包衣剂型号B，其由六和农业科学研究所生产。蓟柄锈菌夏孢子经本发明保存方法保存120天时， 其萌发率达80%以上。固体颗粒的大小为40 50目，所述固体颗粒为灭活的烟草种子、油菜种子、大白菜种子或硅胶颗粒中的任一种。例 1首先从田间人工采集感染蓟柄锈菌的小蓟植株，然后在室内进行单孢纯化，人工接种小蓟，使小蓟感染蓟柄锈菌。然后用手术刀从发病的小蓟叶片上刮取夏孢子，将刮取的夏孢子与其3 5倍体积的A粉混合制成夏孢子粉；然后称取夏孢子粉等重量的、灭活的烟草种子，烟草种子大小选用40 45目，并在烟草种子表面喷洒羧甲基纤维素钠水溶液；然后在烟草种子表面滚上夏孢子粉；再在烟草种子表面喷洒羧甲基纤维素钠水溶液，滚上A粉；重复喷洒1 %羧甲基纤维素钠水溶液，并滚上A粉10 15次，直至颗粒直径能通过8目 10目的筛孔；喷洒羧甲基纤维素钠水溶液，再滚上B粉1层；喷洒羧甲基纤维素钠水溶液，滚上滑石粉1层；过筛，并在室内晾干20 ^h ；将颗粒封闭在离心管中，于4°C和-20°C条件下保存。保存120天时夏孢子萌发率高于80%。(萌发结果如下表)保存的夏孢子萌发结果
保存时间萌发率(%) VC-20Γ48h86. 9698. 297d80. 0086. 5014d26. 1962. 5021d72. 5037. 5035d64. 7085. 4265d53. 7564. 1795d80. 0086. 50120d81. 0083. 20127d67. 0079. 83例 2a、制备夏孢子粉，b、取油菜种子，并在其表面喷洒一层羧甲基纤维素钠水溶液，然后滚上一层夏孢子粉，c、A粉包衣10 15层，形成以油菜种子为核心的颗粒，d、B粉包衣次外层，
e、滑石粉包衣最外层，f、晾干并贮藏。步骤a为从田间人工采集感染了蓟柄锈菌的小蓟植株，然后在室内进行单孢纯化，人工接种小蓟，使小蓟感染蓟柄锈菌。然后用手术刀从发病的小蓟叶片上刮取成熟的夏孢子，将刮取的夏孢子与其3 5倍重量分数的A粉混合制成夏孢子粉。步骤b为用天平称取与夏孢子粉等重量的固体颗粒，固体颗粒为灭火的油菜种子，大小为48 50目，然后在油菜种子表面喷洒质量分数比为1 %羧甲基纤维素钠水溶液， 充分搅拌使羧甲基纤维素钠水溶液均勻地分布在油菜种子表面；将粘有羧甲基纤维素钠水溶液的油菜种子与夏孢子粉混合，并滚动油菜种子，直至所有的夏孢子粉全部均勻滚粘在油菜种子的表面。步骤c为再次在油菜种子表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，喷后在油菜种子表面再滚粘上A粉1层；上述操作重复10 15次，直至粘有A粉的油菜种子形成的颗粒能够通过8目 10目的筛孔为准，粘有A粉的颗粒要求大小均勻。步骤d为在步骤c所得的颗粒的表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，再均勻滚粘上B粉1层。步骤e为在步骤d所得的颗粒的表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，再均勻的滚粘上滑石粉，使颗粒表面形成了滑石粉层。步骤f为过筛，选取通过了 8目 10目的颗粒，并在室内室温下晾干20 观小时；将晾干的颗粒装入离心管中并封闭离心管，于4°C和-20°C冰箱保存。A粉的成分为金叶牌烟草包衣剂型号A，其由六和农业科学研究所生产。B粉的成分为金叶牌烟草包衣剂型号B，其由六和农业科学研究所生产。蓟柄锈菌夏孢子经本发明保存方法保存120天时， 其萌发率高于80%。(萌发结果如下表)保存的夏孢子萌发结果
保存时间萌发率(%) 4 0C-2 O0C48h95. 5389. 277d48.4854. 1714d77. 8362. 5021d45. 0077. 5035d58. 0085. 4265d85. 7185. 7195d80. 0082. 50120d81. 9080. 60127d68. 0276. 90
例 3a、制备夏孢子粉，b、取大白菜种子，并在其表面喷洒一层羧甲基纤维素钠水溶液，然后滚上一层夏孢子粉，c、A粉包衣10 15层，形成以大白菜种子为核心的颗粒，d、B粉包衣次外层，e、滑石粉包衣最外层，f、晾干并贮藏。步骤a为从田间人工采集感染了蓟柄锈菌的小蓟植株，然后在室内进行单孢纯化，人工接种小蓟，使小蓟感染蓟柄锈菌。然后用手术刀从发病的小蓟叶片上刮取成熟的夏孢子，将刮取的夏孢子与其3 5倍重量分数的A粉混合制成夏孢子粉。步骤b为用天平称取与夏孢子粉等重量的固体颗粒，固体颗粒为灭活的大白菜种子，大小为48 50目，然后在大白菜种子表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，充分搅拌使羧甲基纤维素钠水溶液均勻地分布在大白菜种子表面；将粘有羧甲基纤维素钠水溶液的大白菜种子与夏孢子粉混合，并滚动大白菜种子，直至所有的夏孢子粉全部均勻滚粘在大白菜种子的表面。步骤c为再次在大白菜种子表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液， 喷后在颗粒表面再滚粘上A粉1层；上述操作重复10 15次，直至粘有A粉的大白菜种子形成的颗粒，能够通过8目 10目的筛孔为准，粘有A粉的颗粒要求大小均勻。步骤d为在步骤c所得颗粒的表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，再均勻滚粘上B粉1层。步骤e为在步骤d所得的颗粒的表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，再均勻的滚粘上滑石粉，使颗粒表面形成了滑石粉层。步骤f为过筛，选取通过了 8目 10目的颗粒，并在室内室温下晾干20 观小时；将晾干的颗粒装入离心管中并封闭离心管，于4°C和-20°C冰箱保存。A粉的成分为金叶牌烟草包衣剂型号A，其由六和农业科学研究所生产。B粉的成分为金叶牌烟草包衣剂型号B，其由六和农业科学研究所生产。蓟柄锈菌夏孢子经本发明保存方法保存120天时， 其萌发率高于80%。(萌发结果如下表)保存的夏孢子萌发结果
权利要求
1.一种蓟柄锈菌的离体保存方法，其特征在于，按照下述步骤操作a、制备夏孢子粉，b、取一种固体颗粒，并在其表面喷洒一层羧甲基纤维素钠水溶液，然后滚上一层夏孢子粉c、A粉包衣10 15层，形成以固体颗粒为核心的颗粒，d、B粉包衣次外层，e、滑石粉包衣最外层，f、晾干并贮藏。步骤a为从田间人工采集感染了蓟柄锈菌的小蓟植株，然后在室内进行单孢纯化，人工接种小蓟，使小蓟感染蓟柄锈菌。然后用手术刀从发病的小蓟叶片上刮取成熟的夏孢子， 将刮取的夏孢子与其3 5倍重量分数的A粉混合制成夏孢子粉。
2.根据权利要求1所述蓟柄锈菌的保存方法，其特征在于，步骤b为用天平称取与夏孢子粉等重量的固体颗粒，然后在颗粒表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，充分搅拌使羧甲基纤维素钠水溶液均勻地分布在颗粒表面；将颗粒与夏孢子粉混合，并滚动颗粒，直至所有的夏孢子粉全部均勻滚粘在颗粒的表面。
3.根据权利要求2所述蓟柄锈菌的保存方法，其特征在于，步骤c为再次在颗粒表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，喷后在颗粒表面再滚粘上A粉1层；上述操作重复10 15次，直至粘有A粉的颗粒，能够通过8目 10目的筛孔为准，粘有A粉的颗粒要求大小均勻。
4.根据权利要求3所述蓟柄锈菌的保存方法，其特征在于，步骤d为在步骤c所得颗粒表面喷洒质量分数比为1 %羧甲基纤维素钠水溶液，再均勻滚粘上B 粉1层。
5.根据权利要求4所述蓟柄锈菌的保存方法，其特征在于，步骤e为在步骤d所得颗粒表面喷洒质量分数比为羧甲基纤维素钠水溶液，再均勻的滚粘上滑石粉，使颗粒表面形成滑石粉层。
6.根据权利要求5所述蓟柄锈菌的保存方法，其特征在于，步骤f为过筛，选取通过了 8目 10目的颗粒，并在室内室温下晾干20 观小时；将晾干的颗粒装入离心管中并封闭离心管，于4°C和-20°C冰箱保存。
7.根据权利要求1所述蓟柄锈菌的保存方法，其特征在于，所述A粉的成分为金叶牌烟草包衣剂型号A，其由六和农业科学研究所生产。
8.根据权利要求1所述蓟柄锈菌的保存方法，其特征在于，所述B粉的成分为金叶牌烟草包衣剂型号B，其由六和农业科学研究所生产。
9.根据权利要求1所述蓟柄锈菌的保存方法，其特征在于，蓟柄锈菌夏孢子经本发明保存方法保存120天时，其萌发率高于80%。
10.根据权利要求2所述蓟柄锈菌的保存方法，其特征在于，所述固体颗粒的大小为 40 50目，所述固体颗粒为灭活的烟草种子、油菜种子、大白菜种子或硅胶颗粒中的任一种。
全文摘要
本发明公开了一种蓟柄锈菌的离体保存方法，其特征在于，按照下述步骤操作a、制备夏孢子粉，b、取一种固体颗粒，并在其表面喷洒一层1％羧甲基纤维素钠水溶液，然后滚上一层夏孢子粉，c、A粉包衣10～15层，形成以固体颗粒为核心的颗粒，d、B粉包衣次外层，e、滑石粉包衣最外层，f、晾干并贮藏。A粉的成分为金叶牌烟草包衣剂型号A，其由六和农业科学研究所生产。B粉的成分为金叶牌烟草包衣剂型号B，其由六和农业科学研究所生产。本发明方法简单，操作方便，易于保存，并且在离体保存条件下，夏孢子萌发率高，保存效果好，能够达到研制生防制剂的目的。
文档编号C12R1/645GK102391952SQ201110369158
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者刘少云, 张峻铨, 徐宜民, 时焦 申请人:中国农业科学院烟草研究所