专利名称：一种泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗的鉴别引物和方法
技术领域：
本发明属于水产养殖学领域DNA标记技术在生产实践中的应用，具体涉及应用微卫星标记对泰国笑壳鱼(云斑尖塘鳢Arァe/eotris fflarffiorates)和本地笑壳鱼(河川沙塘鳢(is potamophila)鱼苗进行鉴别。
背景技术：
云斑尖塘體(Arァ(^Zeotri1Smarmora tus )俗名泰国笑壳鱼(Marble goby),属鱼卢形目(Pereifomes)、鰕虎鱼亚目(Gobioidei)、塘鳢科(Eleotridae)、尖塘鳢属
かむ)，是塘鳢科鱼类中体型最大、生长最快的名贵淡水鱼种。云斑尖塘鳢是原产 于泰国、越南、马来西亚等东南亚国家，同时也是这些国家出口创汇的优良品种之一。由于该鱼具有花纹漂亮、味道鲜美、ロ感嫩滑，营养丰富等特点，深受我国沿海城市及港、澳、台消费者的欢迎。我国自上世纪八十年代从东南亚引种以来，现已成为我国南方沿海地区的重要淡水养殖对象。近年来，随着养殖规模的扩大，越冬成本的降低以及养殖技术的成熟，该鱼的养殖正在长江中下游省份等地兴起，并有逐年扩大和向北延伸的趋势。河川沙塘體(is,隶属于S卢形目(Perciformes)、锻虎鱼亚目(Gobioidei)、塘鳢科(Odontobutidae)、沙塘鳢属，俗名塘鳢鱼，也被江苏等地的人们称为本地笋壳鱼，是ー种较为名贵的小型经济鱼类。其主要分布于长江中、下游及沿江各支流，闽江水系，钱塘江水系，偶见黄河水系。河川沙塘鳢因其肉质细嫩、味道鲜美、肌间刺少，深受江浙、沪、闽等地人们的喜爱。同时，该鱼也是江苏省特色水产业中具有良好发展前景的鱼类品种之一。由于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢各具特色，并且市场需求量与日俱增，所以江苏等地两种鱼的养殖规模也在逐年扩大，苗种需求量也随之大幅度的増加，但随之而来的是苗种的来源问题。由于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢在鱼苗阶段相似度十分高，即使是养殖经验丰富的渔民用肉眼也很难将其分辨开来。所以，在经济利益的趋势下，国内笋壳鱼苗种市场鱼龙混杂。云斑尖塘鳢为我国从东南亚国家引进品种，个体虽大，但耐寒能力远不及河川沙塘鳢，且在水温低于10度的野外条件下难以存活，而河川沙塘鳢则多为野生，家养则需要对其进行驯化，且最大个体仅为200g左右，目前，该鱼在长江下游省份人工规模化繁育成功，且养殖面积不断扩大。若养殖者不慎将品种搞错，势必造成后期处理不当，如此ー来，对养殖户造成的经济损失将不可估量。因此，在养殖前景广阔但鱼苗市场混杂的背景下，迫切需要一种将两种笋壳鱼鱼苗鉴别开来的技术，避免养殖失误发生在源头。基因组中的微卫星DNA以孟德尔方式遗传，呈共显性表达，且同时具有分布广、遗传信息含量高和便于PCR检测等优点，已被广泛用于鱼类亲缘关系鉴定、遗传多祥性分析、遗传连锁图构建及系统进化等方面的研究。研究表明，微卫星侧翼序列在属内种间和有较近亲缘关系的属间相当保守，而且在基因组中有部分微卫星位点在亲缘关系较远的分类群间也有一定保守性。微卫星侧翼序列的保守性使得在某一物种中开发出的微卫星引物应用于相关的近缘物种成为可能。
发明内容
本发明提供ー种泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗的鉴别方法。借助分子手段(I对微卫星引物)快速将两种鱼苗鉴别开，避免因为苗种选取不当给养殖户带来经济损失。本发明的基本原理是(1)用高效磁珠富集法大量开发云斑尖塘鳢微卫星引物；(2)从所开发引物中选取在云斑尖塘鳢群体中能够稳定扩增且不具有多态性的数对微卫星引物用于河川沙塘鳢群体的扩增；(3)筛选出在河川沙塘鳢群体中亦能明显扩增，但扩增条带位置明显不同于云斑尖塘鳢的微卫星引物，用于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢鱼苗的鉴别。本发明筛选出ー对种用于泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗鉴别的引物，命名为H228,引物序列如下
FTCCAATCAGGCAGTAAGCAG (SEQ ID No. 8)；
RGGGACATCAGGACCAACTCT (SEQ ID No. 9)。用上述H228引物鉴别泰国笑壳鱼和本地笑壳鱼鱼苗的方法，包括下列步骤
(1)用H228引物对待鉴别样本进行扩增，获得PCR产物；
(2)用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，EB染色，250bp大小条带的为泰国笋壳鱼，300bp大小条带的为本地笋壳鱼；
本发明所述的H228引物是按照以下步骤获得的I.基因组DNA的提取(云斑尖塘鳢群体、河川沙塘鳢群体)；2.磁珠富集法筛选云斑尖塘鳢微卫星微点；3.筛选在云斑尖塘鳢群体中呈单态位点；4.用单态位点引物扩河川沙塘鳢群体；5.筛选出I对在两个群体均能稳定扩增，且片段大小明显不同的引物，用于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢鱼苗的鉴别。所述步骤1，基因组DNA的提取包括剪取实验鱼的尾鰭0. ro. 2g，采取常规酚-氯法提取基因组DNA ;核酸蛋白測定仪测定其纯度及浓度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。所述步骤2，磁珠富集法筛选云斑尖塘鳢微卫星微点将云斑尖塘鳢基因组DNA经Bspl43 I限制性内切酶进行酶切后连接接头，PCR扩增后进行磁珠富集，富集产物经克隆后对阳性克隆测序。所述步骤3，筛选在云斑尖塘鳢群体中呈单态位点对测序结果中含有微卫星微点的序列进行引物设计，引物合成后在云斑尖塘鳢群体中进行PCR扩增，扩增产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选，选出只扩增出一条清晰条带，即呈现单态的微卫星引物。所述步骤4，用单态位点引物扩河川沙塘鳢群体用筛选出来的引物对河川沙塘鳢群体进行PCR扩增，扩增过程中，退火温度、MgCl2浓度等条件与云斑尖塘鳢群体扩增完全相同。所述步骤5，筛选出在两个群体均能稳定扩增，且片段大小明显不同的引物，用于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢鱼苗的鉴别用1%琼脂糖凝胶电泳同时检测云斑尖塘鳢群体和河川沙塘鳢群体PCR扩增产物，筛选出能够对云斑尖塘鳢群体和河川沙塘鳢群体进行鉴别的微卫星引物。本发明所获得的微卫星引物H228 (退火温度51°C)，在云斑尖塘鳢群里和河川沙塘鳢群体中均能稳定扩増，结果稳定，条带清晰，只需用1%琼脂糖凝胶电泳检测就可看到、明显差异，且操作简单方便，成本低，实用强，对养殖生产很有帮助。
图I :H13在云斑尖塘鳢群体中扩增的部分结果(聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选单态引物)
图2 H228微卫星标记在部分云斑尖塘鳢群体和河川沙塘鳢群体中的扩增结果(琼脂糖凝胶电泳筛选鉴别引物)
具体实施例方式I.基因组DNA的提取(云斑尖塘鳢群体、河川沙塘鳢群体):
I)取实验鱼的尾鳍0. I 0. 3g加入450i! L DNA抽提缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA, 75 mmol/L NaCl)，混匀后依次加入SDS和蛋白酶K至终浓度分别为0. 5%和200吒/mL，然后于55°C水浴消化过夜。2)加入等体积饱和苯酚、苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)、氯仿/异戊醇(24:1)各抽提一次。每次抽提均轻柔混合10分钟后，4°C，12000rpm离心20分钟，取上清。3)将所得上清液加入2. 5 mo I/L NaCl (终浓度为0. 2 mol/L)和预冷的2倍体积的无水こ醇沉淀，12000rpm离心20分钟取沉淀；用70%こ醇漂洗2次后在室温下自然干燥，待こ醇挥发后溶于200 y L的TE中，置于4°C冰箱备用。在核酸蛋白测定仪上測定其纯度及浓度，琼脂糖凝胶电泳检测。2.磁珠富集法筛选云斑尖塘鳢微卫星微点
I)将云斑尖塘鳢基因组DNA经ガ印7ぬI四种粘末端限制性内切酶进行单酶切反应。筛选出酶切片段主要分布在400-1200bp范围的酶切体系。酶切体系基因组DNA 8呢，IOXbuffer 4ML，内切酶5U，总体积40ML。反应条件为37°C恒温水浴5h，酶切结束后65°C水浴20分钟终止反应。取5ML酶切产物琼脂糖凝胶检测。使用Axygen公司的AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物。2)将回收的DNA两端接上磷酸化接头Linker A，接头序列为
Linker A 5，-GCGGTACCCGGGAAGCTTGG-3’ (SEQ ID No. I)
3，-CGCCATGGGCCCTTCGAACCCTAG-p-5’ (SEQ ID No. 2)
接头长链粘末端(5’端)带磷酸根。取酶切后回收DNA 14ML，加入Linker A(100剛)2ML，连接buffer 2ML，T4连接酶，总体积20ML，16°C连接过夜。连接产物经AxyPr印DNA试剂盒回收，去除多余的接头，使用40ML洗脱液洗脱，取5ML电泳检測。3)剩余的洗脱液用于Pre-PCR，一共作10管PCR，每个反应管中加入IOXTaqbuffer 2ML，dNTP (2mM)lML，MgCl2 (25mM)l. 5ML，引物 Primer I (10剛)1ML，Taq 酶 1U，模板 DNA3. 5ML，总体积为 20ML。Primer I 的序列为5’-GCGGTACCCGGGAAGCTTGG_3’ (SEQ IDNo. 3)。PCR反应为12个循环，每个循环包括94°C变性30s，63°C退火30s，72°C延伸60s。反应结束后取少量预PCR产物琼脂糖电泳检测。剩余约200ML反应液经AxyPr印DNA试剂盒回收，洗脱于40ML的洗脱液中。4)生物素探针与文库杂交，链霉素磁珠富集及Post-PCR 取全部40ML的DNA洗脱液，加ddH20 460ML，将反应管置于95°C水浴变性5分钟；同时将50剛的生物素探针Biotin (CA)3ML加入另ー EP管中，并加入20XSSC (8. 8g NaCl，4. 4g柠檬酸钠，配置成IOOmL溶液，调节pH 7. 2后灭菌)13ML，68°C预热，加入完成变性步骤的DNA溶液并继续68°C保温杂交10分钟，之后放置室温冷却。生物素探针Biotin (CA)的序列如下Biotin-5，-ATAGAATATCACACACACACACACACACACACACACACACA-3’ (SEQ ID No. 4)用磁珠(Promega)进行片段富集，磁珠使用前需要洗涤轻弹管底，悬浮磁珠，利用磁架Separation Stand收集,弃溶液；往管中加入300ML 0. 5 X SSC,轻弹管底混勻，磁架收集后弃溶液(洗涤3次)；加入100ML 0. 5XSSC并重悬磁珠待用。在洗涤完毕的磁珠管中加入全量杂交好的DNA溶液，每1-2分钟颠倒混匀一次，混匀5-10次；利用磁架收集磁珠，/吸出溶液留存(防止磁珠失效造成实验失败，如Post-PCR反应失败可用此留存溶液与新磁珠反应)，使用300ML0. IXSSC洗涤磁珠，洗涤4次，最后一次尽可能吸尽溶液；加入100MLddH20，重悬磁珠，95°C水浴5分钟，利用磁架收集磁珠，将DNA溶液转入新管；利用真空干燥仪或烘箱将100MLDNA液浓缩至20ML左右。Post-PCR—共作 5 管，每个反应管中加入 IOXTaq buffer 2ML，dNTP (2mM) lML，MgCl2 (25mM) I. 5ML，引物 Primer I (10剛)1ML，Taq 酶 1U，模板 DNA 4ML，总体积为 20ML。PCR反应为12个循环，每个循环包括94°C变性30s，63°C退火30s，72°C延伸60s。PCR反应液取少量琼脂糖电泳检测，其余经AxyPr印DNA试剂盒回收，洗脱于40ML的洗脱液中并使用核酸蛋白仪测量DNA浓度。3.筛选在云斑尖塘鳢群体中呈单态位点
I)根据所得DNA的浓度，调节外源DNA与T载体的比例载体DNA与插入片段摩尔数之比范围为I :2-10。连接体系为:外源DNA 1-4ML，T载体(0. 03pmol)lML，连接buffer 5ML，总体积10ML，16°C连接过夜。2)将全量IOML连接液加入100ML DH5a感受态细胞中，冰上放置30分钟；42°C热激60s后立即冰上放置I分钟；加入900ML LB培养基，37°C IOOrpm震荡培养60分钟；取100ML 菌液均匀铺在含有 X-gal (40ML，20mg/mL)、IPTG (7ML，200mg/mL)、Amp (终浓度 60吒/mL)的90mL琼脂平板上，待液体被琼脂板完全吸收后，37°C培养12-15小时；挑取单个白色菌落，接种于500ML含有60Pg/mL Amp的LB液体培养基中，220rpm振荡培养3小吋。3)使用M13和RV-M引物做菌液PCR，检测细菌克隆是否含有插入片段，反应条件为 IOXTaq buffer 1ML，dNTP (2mM) 0. 5ML，MgCl2 (25mM) 0. 8ML，引物+ (10 剛)0. 3ML，弓 I物-(10剛)0. 3ML，Taq酶0. 5U，菌液0. 5ML，总体积为10ML。PCR反应为25个循环，每个循环包括94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s。琼脂糖凝胶电泳检测，选取扩增片段400-1200bp范围的阳性克隆做二次PCR筛选。M13 5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，(SEQ ID No. 5)
RV-M :5’ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’ (SEQ ID No. 6)
4)二次筛选采用M13、RV-M引物中的一条与PrimerII-CA组成ー对引物，一共两个组合M13 + PrimerII-CA, RV-M + PrimerII-CA。反应条件为 IOXTaq buffer 1ML，dNTP(2mM)0. 5ML，MgCl2 (25mM)0. 8ML，引物 + (10剛)0. 3ML，引物-(10剛)0. 3ML，Taq 酶 0. 5U，菌液0. 5ML，总体积为10ML。PCR反应为25个循环，每个循环包括94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s。琼脂糖凝胶电泳检测，选取出现扩增片段的对应菌液送生物公司测序。PrimerII-CA :5，-CACACACACACACACACACACACA-3’ (SEQ ID No. 7)5)用Primer 5. O对含有微卫星位点的序列设计引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物合成后用于云斑尖塘鳢群体PCR扩增。体系为10 X Taq buffer 2ML，dNTP(2mM) 2ML，MgCl2 (25mM) I. 5ML，引物 + (10剛)1ML，引物-(10剛)1ML，Taq 酶 1U，模板DNAmL,加灭菌双蒸水补足20ML体系。PCR程序为94°C预变性5min，94°C变性30sec，退火30sec，72°C延伸30sec，反应30个循环，最后7°C延伸5min。6) PCR扩增产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，功率80W，电泳I. 5h，硝酸银染色，相机拍照，筛选出在云斑尖塘鳢群体中呈单态的多对微卫星引物，以H13为例，效果如图I所 4.用单态位点弓丨物扩河)11沙塘鳢群体
用上一步筛选出来的微卫星引物对河川沙塘鳢群体进行PCR扩增，反应条件和体系与在云斑尖塘鳢群体中完全相同，即体系为10XTaq buffer 2ML，dNTP (2mM)2ML，MgCl2(25mM) I. 5ML，引物+ (10剛)1ML，引物-(10剛)1虬，Taq酶1U，模板DNA1ML，加灭菌双蒸水补足20ML体系。PCR程序为94°C预变性5min，94°C变性30sec，退火30sec，72°C延伸30sec，反应30个循环，最后TC延伸5min。虽然微卫星侧翼序列具有相当的保守性，但由于河川沙塘鳢与云斑尖塘鳢不属于同属鱼类，仍有部分引物无法在河川沙塘鳢群体中扩增。5.筛选出I对在两个群体均能稳定扩增，且片段大小明显不同的引物，用于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢鱼苗的鉴别将在两个群体中均有稳定扩增的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，筛选出条带清晰，位置明显不同，能够用于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢鱼苗的鉴别的一对微卫星引物，命名为H228，引物序列如SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9所示。H228微卫星标记在云斑尖塘鳢群体和河川沙塘鳢群体中的扩增结果如图2，250bp大小的为泰国笋壳鱼，300bp大小的为本地笋壳鱼。
权利要求
1.一种用于泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗鉴别的引物，其特征在于所述引物序列如下FTCCAATCAGGCAGTAAGCAG ；R:GGGACATCAGGACCAACTCT。
2.ー种泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗的鉴别方法，其特征在于，包括下列步骤 (1)用权利要求I所述引物对待鉴别样本进行扩增，获得PCR产物； (2)用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，EB染色，250bp大小条带的为泰国笋壳鱼，300bp大小条带的为本地笋壳鱼。
全文摘要
本发明属于水产养殖学领域DNA标记领域，具体涉及应用微卫星标记对泰国笋壳鱼(云斑尖塘鳢Oxyeleotrismarmoratus)和本地笋壳鱼(河川沙塘鳢Odontobutispotamophila)鱼苗进行鉴别。本发明的一对引物序列如SEQIDNo.8和SEQIDNo.9所示。鉴定时用上述引物对待鉴别样本进行PCR扩增，再用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，EB染色，250bp大小条带的为泰国笋壳鱼，300bp大小条带的为本地笋壳鱼；本发明所获得的微卫星引物，在云斑尖塘鳢群里和河川沙塘鳢群体中均能稳定扩增，结果稳定，条带清晰，且操作简单方便，成本低，实用性强。
文档编号C12N15/11GK102653795SQ20121015819
公开日2012年9月5日 申请日期2012年5月21日 优先权日2012年5月21日
发明者尹绍武, 朱晓平, 祝斐, 胡亚丽 申请人:南京师范大学