用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法

专利名称：用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学检测鉴定技术领域，具体涉及一种用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法。
背景技术：
植物寄生性线虫是世界范围内一类危害农林业生产的植物病原生物。到目前为止，大约有4100种植物线虫被描述,约占已描述的所有线虫种类的15% (Decraemer&Hunt,2006)。很多植物寄生线虫,如香蕉穿孔线虫(Radopholussimilis)、根结线虫(Meloidogynespp.)和松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)等都是破坏性强的病原物，已经在很多粮食作物、观赏植物、蔬菜和林业树木上引起严重的危害，所以，很多国家将这些植物线虫列为检疫性有害生物(CABI&EPP0，1998)。传统的植物寄生线虫分类鉴定依赖形态特征，该方法需要丰富的分类鉴定经验，在种类水平上，一些近似种的准确鉴定更是比较复杂和困难。自从发明PCR技术,且秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的基因组被完全测序后，分子诊断和鉴定方法已经被广泛应用于自由生活线虫、动物寄生线虫和植物寄生线虫，并为这些线虫的系统进化和分类研究提供了更丰富的信息(Floyd et al,2002 ；Powers,2004 ；Abebe et al,2011)。在线虫分类上，核糖体RNA的排列和其间隔区以及线粒体基因组一些区间的序列特征常被用来作为鉴定的依据。根据序列区间的保守性，目前很多通用或者特异引物已经被设计出来用于线虫的鉴定或者系统进化分析。例如，用内转录间隔区(ITS)通用引物扩增的序列作为鉴定的标记，用28S rRNA基因D2-D3扩展区的通用引物扩增的序列分析线虫系统进化，此外，还有一些用于系统进化分析的线粒体细胞色素氧化酶基因的一些保守区间的特异引物(Cl O 或 C0II) (Powers&Harris, 1993 ；A1-Banna et al, 1997 ；Subbotin etal, 2000 ；Powers,2004 ；Subbotin et al, 2005a ；De Ley et al,2005)。植物寄生线虫的分子鉴定，需要先获得DNA模板。从自然界的土壤中、植物组织中通常一次能分离到多个种类混合的植物线虫，所以单条植物寄生线虫的DNA提取在分类学、系统进化和线虫检测鉴定等研究方面更有意义。单条植物线虫DNA的获得通常包括两个步骤，一是获得线虫裂解物，二是获得DNA粗提液。对于第一步，常用的方法就是挑取单条虫到载玻片上，在体视显微镜下切成2 3段，用移液器移到线虫裂解液(WLB)中，有的还会再把裂解物再进行反复冻融，使虫体组织充分裂解(Subbotin et al, 2000 ；ffawyenbergeet al, 2000 ；Elbadri et al, 2002 ；Bert et al, 2008 ；Troccoli et al, 2008 ；Huang etal，2010);也可以把线虫虫体碎段或整条虫放入线虫简易裂解液中(如聚合酶的I倍缓冲液MSubbotin et al，2005，2006)，获得线虫裂解物。第二步就是将获得的线虫裂解液，用蛋白酶K进行消化约lh，然后再灭活蛋白酶，最终得到DNA模板粗提液，进行下一步PCR反应。此外，其它一些简单和快速获得线虫裂解液的方法也有报道，例如利用NaOH和TritonX-100直接裂解整条虫(Stantonet al, 1998; Floyd et al，2002)，或用SDS裂解液整条虫(Sakai, 2010 ；Sakai etal，2011)，然后直接用于PCR反应。总之，这些方法在PCR反应之前都需要加入试剂，所以相对耗时和操作复杂，且痕量的试剂残留可能会影响PCR的反应或后续的操作。而且由于植物寄生线虫虫体细小,成熟雌雄虫一般O. 5-1. 2_，虫体直径为30-60 μ m,使得上述提及的单条线虫碎断转移过程使样本模板量损失很大或丢失，存在导致实验用PCR中DNA模板量不足的缺陷。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，该方法即可实现简单、快速PCR反应鉴定，又能保证PCR目的片段的酶切及测序等后续试验操作不受影响。
本发明通过以下技术方案实现上述目的一种用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，为以单条线虫虫体或单个线虫虫卵为PCR模板，扩增得到保守序列，鉴定后确定线虫种类的方法。具体步骤如下(I)植物线虫样品的洗涤在无菌的载玻片上滴无菌去离子水，用线虫挑针挑入单条线虫或单个虫卵；(2) PCR模板制备将三蒸水滴到PCR管内壁上，挑入步骤(I)洗涤过的单条线虫或单个虫卵，用无菌昆虫针在体视显微镜下扎破线虫虫体或虫卵，把线虫裂解液甩入管底，该线虫裂解液作为PCR模板直接使用或者放入-80°C超低温冰箱中保存备用；为防止无菌昆虫针将线虫虫体或虫卵带走，最好在线虫裂解液甩入管底后，在显微镜下检查管底是否有线虫虫体或虫卵；(3)PCR反应选取线虫的保守区域设计引物，以步骤(2)制备的PCR模板为模板，进行PCR ；(4)鉴定将得到的PCR产物进行分析，从而确定线虫的种类。步骤(2)中所述的三蒸水的量根据线虫大小而定，对于线形虫态的线虫虫体或虫卵，虫体短于1. 5mm的线虫和虫卵三蒸水用量为6 μ 1，虫体长于1. 5mm的线虫三蒸水用量为12 μ I ;对于膨大成球形、梨形等较大的非线形虫态的虫体，三蒸水用量为24μ I ;步骤(2)中所述的三蒸水滴到PCR管内壁的位置，优选为水滴在距管口 Icm左右的位置；步骤(2)中所述的昆虫针优选为不锈钢昆虫针I号；步骤(2)中所述的无菌昆虫针是指将昆虫针用无水酒精浸泡，然后在酒精灯火焰灼烧处理；步骤(2)中所述的线虫裂解液为扎破的线虫虫体或虫卵得到的线虫裂解物和三蒸水的混合液；步骤(3)中所述的保守区域优选为线粒体细胞色素氧化酶基因II与LrRNA基因序列、内转录间隔区ITS序列、28S D2-D3扩增区序列和植物线虫细胞色素氧化酶基因Co I区间序列中的一种或至少两种；所述的线粒体细胞色素氧化酶基因II与LrRNA基因序列的引物如下上游引物#C2F3 :5’ -GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3’下游引物#1108 :5’ -TACCTTTGACCAATCACGCT-3，；
所述的内转录间隔区ITS序列的引物如下上游引物5，-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3，下游引物5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’ ；所述的28S D2-D3扩增区序列的引物如下上游引物5’ -ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3 ’下游引物5，-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’；所述的植物线虫细胞色素氧化酶基因Co I区间序列的引物如下
上游引物5’ -CCTACTATGATTGGTGGTTTTGGTAATTG-3 ’下游引物5’-GTAGCAGCAGTAAAATAAGCACG-3’ ；步骤(3)中所述的PCR反应的反应条件如下94°C 3min预变性；98°C变性lOsec，52°C 55°C退火30sec，68°C延伸lmin，35个循环；然后68°C再延伸IOmin ；步骤(4)中所述的分析包括电泳分析、酶切分析以及测序分析。所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法由于能以单条线虫虫体或单个线虫虫卵制备得到PCR模板进行保守序列的扩增，因此，也能通过此方法得到所需的线虫DNA序列。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果(I)与传统的单条植物寄生线虫鉴定PCR相比，本发明不需要使用试剂配制的线虫裂解液(WLB)或碱裂解或者反复冻融法先进行Ih的蛋白酶K裂解，所以本发明避免了其它试剂的污染，节省了操作步骤，节约了 PCR准备的时间，提高了工作效率。(2)与其它已报道的不用配制裂解液处理的单条植物寄生线虫PCR相比，本发明的方法避免了先在载玻片上将线虫切碎，再转移到PCR管中，因为该过程易发生线虫材料丢失和DNA降解。本发明包含了一步直接在PCR管中简单刺破虫体或虫卵的操作，这样既保证了线虫虫体或虫卵及其裂解物的存在，即DNA模板的存在，也不需要进行把线虫裂解液从其它载体转移到PCR管中，所以鉴定成功率更高。(3)已报道的方法，多数单一用于某一个基因组区间的扩增实验，未有系统、广泛进行应用研究的报道，应用范围和实用性不明确。本发明对目前在植物寄生线虫鉴定和系统进化研究等多个方面的分子诊断标记进行了验证，并且对进一步的酶切实验也进行了验证，所以该方法实用性明确、应用范围广。此外，本发明首次报道了用单个虫卵可以扩增目的片段。


图1是使用Co I1-LrRNA基因通用引物扩增根结线虫的PCR产物电泳结果图，其中图(I)中泳道I 2为南方根结线虫卵，泳道3 4为南方根结线虫幼虫，泳道5 6为南方根结线虫雌虫，泳道7 10为南方根结线虫雄虫；图(2)中泳道I为南方根结线虫二龄虫，泳道2为禾谷根结线虫二龄虫，泳道3为爪哇根结线虫二龄虫，泳道4为象耳豆根结线虫二龄虫，泳道5为花生根结线虫二龄虫；图中泳道M为Marker DL2000。图2是利用不同裂解方法使用Co I1-LrRNA基因通用引物扩增南方根结线虫的PCR产物电泳结果图，其中图A为利用本专利方法扩增南方根结线虫二龄幼虫，泳道I 10为不同根结二龄幼虫虫体；图B利用传统方法扩增南方根结线虫二龄幼虫，I 10为不同根结线虫二龄幼虫虫体。图3是使用ITS通用引物扩增植物寄生线虫的PCR产物电泳结果图，其中图中泳道标号M为Marker DL2000 ；1.腐烂茎线虫虫体，2.腐烂茎线虫虫体，3.香蕉穿孔线虫虫体，4.香蕉穿孔线虫虫卵，5.短体线虫虫体，6.短锥线虫虫体，7.矮化线虫虫体，8.螺旋线虫虫体，9.南方根结线虫二龄虫，10.南方根结线虫雌虫，11.南方根结线虫雄虫，12.小环线虫虫体，13.盘小环线虫虫体，14.松材线虫虫体，15.滑刃线虫虫体，16.剑针线虫虫体，17.毛刺线虫虫体，18.针属线虫虫体，19.肾状线虫虫体，20.小杆线虫虫体。图4是使用28SD2-D3通用引物扩增植物寄生线虫的PCR产物电泳结果图，其中图中泳道标号1.丝尾线虫虫体，2.腐烂茎线虫虫体，3.起绒草茎线虫虫体，4.短体线虫虫体，5.香蕉穿孔线虫雌虫，6.香蕉穿孔线虫虫卵，7.矮化线虫虫体，8.螺旋线虫虫体，9.南方根结线虫二龄虫，10.南方根结线虫虫卵，11.盘小环线虫虫体，12.肾状线虫虫体，13.针 属线虫虫体,14.剑针线虫虫体，M为Marker DL2000。图5是使用细胞色素Co I通用引物扩增植物寄生线虫的PCR产物电泳电泳图，其中图中泳道编号1.起绒草茎线虫虫体；2.短体线虫虫体；3.矮化线虫虫体；4 5.肾状线虫虫体；6.松材线虫虫体；7.水稻干尖线虫虫体;M:Marker DL2000。图6是使用限制性酶对PCR产物进行酶切分析的结果电泳图，其中图中泳道标号内转录间隔区ITS :1.腐烂茎线虫虫体，2.短体线虫虫体，3.香蕉穿孔线虫虫体，4.短锥线虫虫体；CO I基因5.短体线虫虫体，6.肾状线虫虫体，7.水稻干尖线虫虫体，8.松材线虫虫体；D2-D3扩展区9.起绒草茎线虫虫体，10.短体线虫虫体，11.盘小环线虫虫体，12.肾状线虫虫体，13.南方根结线虫虫体；A为PCR产物用Hinf I进行酶切处理；B为PCR产物用Alu I进行酶切处理；M =Marker DL2000。
具体实施例方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例材料中涉及的种类香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、腐烂莖线虫(又名甘薯莖线虫，Ditylenchusdestructor)、短体线虫(Pratylenchus spp.)、螺旋线虫(Helicotylenchusspp.)、肾状线虫(Rotylenchulus spp.)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、爪睡根结线虫(M. javanica)、矮化线虫(Tylenchorhynchus spp.)、丝尾线虫(Filenchus spp.)、滑刃线虫(Ahelenchoides spp.)、小杆线虫(Rhabditida),已在文献“刘一帆,徐春玲，张超，苏秀敏，谢辉.从混合线虫样品和植物组织中直接检测香蕉穿孔线虫的ITS-PCR方法·中国农业科学，2011，44 (19) :3991-3998”公开。起绒草莖线虫(又名鳞球莖莖线虫，Ditylenchus dipsaci),已在文献“赵立荣,徐春玲，胡学难，钟国强.武目涛.截获的鳞球茎茎线虫的检验鉴定.植物检疫，2011，25(5):45-47” 公开。水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi),已在文献“裴艳艳,程曦,徐春玲,杨再福，谢辉.中国水稻干尖线虫部分群体对水稻的致病力测定.中国水稻科学，2012，26 (2)218-226” 公开。
象耳豆根结线虫(M.enterolobii)，已在文献“Hu Μ· X.，Zhuo K. , and LiaoJ. L. . Multiplex PCR for the simultaneous identification and detection ofMeloidogyneincognitaj M. enterolobii, and M. javanica using DNA extracted directlyfromindividual galls. Pytopathologyj 2011，101 (11) : 1270-1277” 公开。花生根结线虫(M. arenaria)，已在文献“文艳华，冯志新，陈立，徐汉虹.三尖杉枝叶粉末防治花生根结线虫病.植物保护学报，2004，31 (2)，161-165”公开。松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)，已在文献“Wang Xin-rong，ChengXi，Li Ya—dong，Zhang Jin—ai，Zhang Zh1-fen,Wu Han-rong. Cloning arginine kinasegeneand its RNAi in Bursaphelenchus xylophilus causing pine wilt disease. Eur JPlantPathol，2012，134:521 - 532” 公开。禾谷根结线虫(又名拟禾本科根结线虫，M. graminicola)，已在文献“刘国坤，王玉，肖顺，张绍升.水稻根结线虫病的病原鉴定及其侵染源的研究.中国水稻科学，2011，25
(4):420-426” 公开。针属线虫(Paratylenchus spp.)，已在文献“陈立杰，刘维志，秦博.中国针属线虫的寄主植物种类和地域分布研究.辽宁农业科学，2002,3:4-8”公开。剑针线虫(Longidorus spp.)和毛剌线虫(Tricodorus spp.)，已在文献“迟远丽，张卫东，吴长坤，邵晓勇，廖力，陈其文.广东省园林植物长针科和毛剌科线虫调查初报.植物检疫，2011，25 (4) :87-83” 公开。盘小环线虫(Discocriconemellaspp.)，已在文献“Powers T. 0. , HarrisT.，Higgins R.，Sutton L.，Powers K. S. . Morphological and molecularcharacterizationof Discocriconemella inarata，an endemic nematode from NorthAmerican Nativetallgrass prairies. Journal ofNematology，2010，42 (I) : 35 - 45”公开。小环线虫(Criconernellaspp.)，已在文献“Nyczepir A. P. , ReillyC. C.，Motsinger R.E.，Okie W. R. . Behavior,parasitism，morphology, and biochemistry ofCriconernella xenoplax and C.ornata on peach.JournalofNematology, 1988，20 (I) : 40-46” 公开。短维线虫(Brachydorusspp.)，已在文献 “Koshy P. K.，Raski D. j.，andSosammaV. K. . Brachydorus swarupi sp.n. (Nematoda:Dolichodorinae)from Soilabout RootsofArecanut Palm in Kerala State, India. Journal ofNematology，1981，13(3):401-404”公开。实施例1根结线虫(Meloidogynespp.)线粒体细胞色素氧化酶基因II (Co II)与LrRNA基因保守序列的扩增该线粒体细胞色素氧化酶基因IKCo II )与LrRNA基因保守序列目前常用来鉴定农业生产上危害较大的植物寄生线虫——根结线虫。(I)研究材料I)线虫种群供试南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、禾谷根结线虫(M. graminicola)、爪卩圭根结线虫(M. javanica)、象耳豆根结线虫(M. enterolobii)和花生根结线虫(M. arenaria)种群均为华南农业大学植物线虫研究室保存在空心菜根系上的种群。
2)引物Co I1-LrRNA通用引物见文献[Powers TO, Harris TS. 1993. Apolymerasechain reaction method for identification of five major Meloidogynespecies.Journal of Nematology 25 (I) : 1-6]中所不，具体如下上游引物#C2F3 5 ’ -GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3 ’下游引物#1108 :5’ -TACCTTTGACCAATCACGCT-3’。(2)试验方法I)根结线虫的分离和收集拔取接种根结线虫的空心菜，清洗根部基质土,把有根结的部分切下来,放入培养 皿内，在体视显微镜下，解剖出雌虫，并获得部分雄虫；此外，在体视显微镜下，分离雌虫末端的卵囊，获取卵，并把部分卵放入水中孵化，2 3天后收集二龄幼虫；2)线虫样品的洗涤在无菌的载玻片上滴无菌去离子水，用线虫挑针，将上述步骤I)中获得的雌虫、雄虫、二龄幼虫和卵挑入其中进行清洗；3) PCR模板制备用微量移液器吸取6 μ I三蒸水滴到PCR管内壁距管口 Icm左右的位置上,然后分别挑入步骤2)中洗涤过的单个卵、幼虫或雄虫；吸取24 μ I三蒸水滴到PCR管内壁距管口Icm左右的位置，然后挑入步骤2)中洗涤过的单头膨大成梨形的雌虫。用无菌不锈钢昆虫针I号在体式显微镜下扎破线虫虫体或线虫卵，然后把线虫裂解液甩入管底，并在显微镜下检查管底是否有线虫虫体，若有则作为PCR模板直接使用，或者放入-80°C超低温冰箱中保存备用；4) PCR 反应配制PCR 反应体系为模板 6μ 1，12. 5μ I 2Xbuffer (2 倍缓冲液)，5μ1 2. OmMdNTP (TOYOBO,日本)，0· 75 μ I 上游引物(10 μ Μ)，O. 75 μ I 下游引物(10 μ Μ)，O. 5 μ I KOD酶(Τ0Υ0Β0，日本)，其余用灭菌三蒸水补足。PCR 反应程序为94°C 3min 预变性，98°C变性 lOsec，52°C 退火 30sec，68°C 延伸lmin, 35个循环,然后68°C再延伸IOmin0配好体系的反应产物，放入伯乐C-1000PCR仪上进行PCR扩增。5) PCR反应结果检测取5 μ I PCR产物使用质量体积比1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR结果进行检测，在凝胶成像系统上观察PCR产物扩增片段的大小和有无(图1)。由图1 (I)可知使用该方法可以扩增到南方根结线虫雌虫、雄虫、卵和二龄幼虫的保守区段，扩增效率高，目的条带非常清晰。此外，由图1 (2)可知，使用该方法扩增不同种类的根结线虫，也可以非常明显的扩增到目的片段，该目的片段与文献报道的一致。实施例2比较不同裂解方法扩增根结线虫线粒体Co II与LrRNA基因保守序列( I)研究材料I)线虫种群供试南方根结线虫(Meloidogyne incognita)为华南农业大学植物线虫研究室保存在空心菜根系上的种群。2)引物同实施例1。(2)试验方法
I)根结线虫的分离和收集、洗涤同实施例1。2) PCR模板制备A组为本发明提供的方法，同实施例1步骤(2) 3)。B组传统方法挑取单条二龄幼虫到滴有一小滴无菌水的无菌玻片上，然后用酒精灯火焰烧过的解剖刀在体视镜下快速将线虫虫体切成2 3段，并迅速用移液器吸走悬浮液到预冷的PCR管中，加入IX聚合酶缓冲液(Takara)至10 μ 1，放入超低温培养箱冷 冻处理30min以上。取出冷冻处理过的线虫裂解液，再加入蛋白酶K于65°C消化lh，然后95°C处理lOmin，使蛋白酶K失活，通过这些步骤获得PCR模板。3) PCR 反应同实施例1。4) PCR反应结果检测取5 μ I PCR产物使用质量体积比1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR结果进行检测，在凝胶成像系统上观察PCR产物扩增片段的大小和有无(图2Α和B)。由图2Α可知使用该方法可以带到100%的扩增效率，目的条带非常清晰，PCR产物含量高；图2Β可知使用传统方法个别重复扩增不出条带，有些扩增出条带，但PCR目的片段含量少，所以条带亮度弱。结果显示本发明所用的制备线虫DNA模板的方法相比上述B组的传统方法在PCR扩增结果上有很大的进步和显著的优势。实施例3植物寄生线虫内转录间隔区(ITS)的PCR扩增ITS序列是内转录间隔区，不表达，包含内转录间隔区ITS1、ITS2和中间的5.8S基因，是目前植物线虫分子鉴定的重要分子标记。( I)研究材料I)线虫种群腐烂莖线虫(Ditylenchus destructor)、香蕉穿孔线虫(Radopholussimilis)、短体线虫(Pratylenchus sp.)、短锥线虫(Brachydorus sp.)、矮化线虫(Tylenchorhynchus sp.)、螺旋线虫(Helicotylenchus sp.)、南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、小环线虫(Criconernella sp.)、盘小环线虫(Discocrionemella sp.)、松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi )、剑针线虫(Xiphidorus sp.)、毛刺线虫(Trichodorussp.)、针属线虫(Paratylenchus sp.)、肾状线虫(Rotylenchulus sp.)及小杆目线虫(Rhabditida),这些种群除腐烂莖线虫、香蕉穿孔线虫、松材线虫和南方根结线虫为华南农业大学植物线虫研究室保存种群,其余分离自华南农业大学树木园根际土壤中。2)引物ITS扩增反应通用引物如文献[Ferris VR, Ferris JM, andFaghihiJ. 1993. Variation in spacer ribosomal DNA in some cyst-forming speciesof plantparasitic nematodes. Fundamental and Applied Nemato 141ogy 16:177—184;VrainTCj Wakarchuk DAj Levesque AC，Hamilton R1. 1992.1ntraspecific rDNArestrictionfragment length polymorphism in the Xiphinema americanum group.FundamentalandAppliedNematology 15:563-573·]所不，具体如下上游引物5’-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3’下游引物5，-TITCACTCGCCGTTACTAAGG-3，；
(2)试验方法I)植物线虫的分离使用胡萝卜愈伤组织培养的腐烂茎线虫和香蕉穿孔线虫，以及使用真菌培养的松材线虫，直接在培养皿内加无菌水，然后可以获得大量不同虫态的虫体。南方根结线虫的获得同实施例1。其它土壤内线虫使用贝曼漏斗法进行分离[谢辉.2005.植物线虫分类学(第二版)·北京高等教育出版社，P 38-40] ο2)线虫样品的洗涤在无菌的载玻片上滴上几滴无菌去离子水，将上述步骤I)中获得的线虫虫体和线虫卵，用线虫挑针挑入无菌去离子水中进行清洗；3) PCR模板制备 长于1. 5mm的剑针线虫(Xiphidorus sp.)虫体挑入装有12 μ I三蒸水的PCR管中进行刺破外，其它线虫的方法同实施例1。4) PCR 反应反应体系同实施例1。反应程序除退火温度为55°C外，其它同实施例1。5) PCR反应结果检测取5 μ I PCR产物使用质量体积比1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR结果进行检测，在凝胶成像系统上观察PCR产物扩增片段的大小和有无(图3)。由图3可知，用此方法可以扩增出所有种群线虫的目的条带，条带浓度高。实施例4植物寄生线虫28S基因D2-D3扩展区的PCR扩增植物线虫28S D2-D3扩增区序列是变异比较快的区间，但种内保守，是用来研究植物线虫分子进化的重要分子标记。(I)材料I)线虫种群:丝尾线虫(Filenchussp.)、腐烂莖线虫(Ditylenchus destructor)、起绒草莖线虫(D. dipsaci)香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、短体线虫(Pratylenchussp.)、矮化线虫(Tylenchorhynchus sp.)、螺旋线虫(Helicotylenchus sp.)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、盘小环线虫(Discocrionemella sp.)、剑针线虫(Xiphidorussp.)、针属线虫(Paratylenchus sp.)、肾状线虫(Rotylenchulus sp.)，种群来源获得同实施例3。2)引物使用扩增D2D3的通用引物如文献[Kaplan DT, ThomasWK, FrisseLM,SarahJL, Stanton JM,Speijer PR, Marin DH, Opperman CH.2000.Phylogenetic analysis of geographically diverse Radopholus similis viaDNAsequence reveals a monomorphic motif. Journal ofNematology 32(2):134-142]所示上游引物5’ -ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3 ’下游引物5’ -TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3 ’ ；(2)试验方法I)植物线虫的分离同实施例3。
2)线虫样品的洗涤同实施例1。3) PCR模板制备同实施例1。4) PCR 反应反应体系同实施例3。5) PCR反应结果检测取5 μ I PCR产物使用质量体积比1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR结果进行检测，在凝胶成像系统上观察PCR产物扩增片段的大小和有无(图4)。由图4可知，用此方法可以扩增出所有种群线虫的目的条带，条带浓度高。实施例5植物寄生线虫细胞色素氧化酶基因Co I区间的扩增植物线虫细胞色素氧化酶基因Co I区间序列也是保守，是用来研究植物线虫分子进化的重要分子标记。(I)材料I)线虫种群起绒草莖线虫(Ditylenchusdipsaci)、短体线虫(Pratylenchus sp·)、矮化线虫(Tylenchorhynchus sp.)、肾状线虫(Rotylenchulus sp.)、松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)和水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi),其中短体线虫、矮化线虫和肾状线虫是分离自华南农业大学树木园根际土壤，其它为华南农业大学植物线虫研究室保存种
群。 2)引物使用扩增细胞色素氧化酶CO I基因保守区间的通用引物(Kanzaki&Futai, 2002)上游引物5，-CCTACTATGATTGGTGGTTTTGGTAATTG-3，下游引物5’-GTAGCAGCAGTAAAATAAGCACG-3’ ；(2)试验方法I)植物线虫的分离水稻干尖线虫也为胡萝卜组织培养保存的种群，分离方法同实施例3。其它线虫种群的分离同实施例3。2)线虫样品的洗涤同实施例1。3) PCR模板制备同实施例1。4) PCR 反应反应体系同实施例3。5) PCR反应结果检测取5 μ I PCR产物使用质量体积比1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR结果进行检测，在凝胶成像系统上观察PCR产物扩增片段的大小和有无(图5)。由图5可知，用此方法可以扩增出这些种群线虫的目的条带，条带浓度高。实施例6PCR产物的限制性酶切分析
PCR产物是否纯，是否含有不利于后续分子生物学试验操作的试剂，使用限制性酶进行酶切分析是一个手段，另外，限制性酶切分析也是检测条带多样性的一种工具，用途较广。(I)试验材料来自实施例1 3中的PCR产物。限制性酶Hinf I和Alu I (Takara,大连宝生物工程有限公司)。(2)试验方法限制性酶切分析体系·配制20 μ I的酶切体系取PCR产物10 μ 1，分别加入限制性酶Hinf I和Alu I各1μ 1，加入相应酶Buffer H和Buffer L各2 μ 1，其余用超纯水补足。配好的酶切体系在C-1000PCR仪中进行，设置程序为37°C lh，然后用95°C 5min。(3)酶切结果分析酶切完的体系，取5 μ I反应产物，在质量体积比2%的琼脂糖凝胶电泳上进行电泳，在凝胶成像系统上观察PCR产物扩增片段的大小(图6)。由于选择的两种酶都是植物线虫目的片段限制性酶切分析中常用的酶，很多酶切结果已经报道分析过。由图6可知，所有目的PCR片段都可以很好的进行酶切，酶切条带位置说明酶切位点被准确识别。以上实施例的结果说明，以单条线虫虫体或单个线虫虫卵能有效扩增得到线虫的基因序列，而且扩增得到的基因序列能进行酶切。因此，本发明所提供的发明能应用于线虫的种类的鉴定。以上实施例为本发明较佳的实施方式，用于解释本发明的技术方案，但不对本发明做任何形式上的限制，在其他未背离本发明实质的前提下所作的任何改变例如修饰、替代、组合、简化等方式均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于包含以下步骤 (1)植物线虫样品的洗涤在无菌的载玻片上滴无菌去离子水，用线虫挑针挑入单条线虫或单个虫卵； (2)PCR模板制备将三蒸水滴到PCR管内壁上，挑入步骤(I)洗涤过的单条线虫或单个虫卵，用无菌昆虫针在体视显微镜下扎破线虫虫体或虫卵，把线虫裂解液甩入管底，该线虫裂解液作为PCR模板直接使用或者放入_80°C超低温冰箱中保存备用； (3)PCR反应选取线虫的保守区域设计引物，以步骤(2)制备的PCR模板为模板，进行PCR ； (4)鉴定将得到的PCR产物进行分析，从而确定线虫的种类。
2.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤(2)中所述的三蒸水的量根据线虫大小而定，对于线形虫态的线虫虫体或虫卵，虫体短于1. 5mm的线虫和虫卵三蒸水用量为6 ii 1，虫体长于1. 5mm的线虫三蒸水用量为12ul ;对于膨大成球形、梨形等较大的非线形虫态的虫体，三蒸水用量为24 yl。
3.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤(2)中所述的三蒸水滴到PCR管内壁距管Icm的位置。
4.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤(2)中所述的昆虫针为不锈钢昆虫针I号。
5.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤(2)中所述的无菌昆虫针是指将昆虫针用无水酒精浸泡，然后在酒精灯火焰灼烧处理。
6.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤(2)中所述的线虫裂解液为扎破的线虫虫体或虫卵得到的线虫裂解物和三蒸水的混合液。
7.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤(3)中所述的保守区域为线粒体细胞色素氧化酶基因II与LrRNA基因序列、内转录间隔区ITS序列、28S D2-D3扩增区序列和植物线虫细胞色素氧化酶基因Co I区间序列中的一种或至少两种。
8.权利要求7所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于 所述的线粒体细胞色素氧化酶基因II与LrRNA基因序列的引物如下上游引物 #C2F3 :5’ -GGTCAATGITCAGAAAITTGTGG-3’下游引物 #1108 :5’ -TACCTTTGACCAATCACGCT-3’ ； 所述的内转录间隔区ITS序列的引物如下上游引物5 ’ -CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3 ’ 下游引物5’ -TITCACTCGCCGTTACTAAGG-3’ ； 所述的28S D2-D3扩增区序列的引物如下 上游引物5 ’ -ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3， 下游引物5’ -TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’ ；所述的植物线虫细胞色素氧化酶基因Co I区间序列的引物如下 上游引物5 ’ -CCTACTATGATTGGTGGTTTTGGTAATTG-3， 下游引物5’ -GTAGCAGCAGTAAAATAAGCACG-3’。
9.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤(3)中所述的PCR反应的反应条件如下94°C 3min预变性；98°C变性lOsec，52°C 55°C退火30sec，68°C延伸lmin，35个循环；然后68°C再延伸lOmin。
10.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于步骤(4)中所述的分析包括电泳分析、酶切分析以及测序分析。
全文摘要
本发明公开了一种用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，属于分子生物学检测鉴定技术领域。在分子生物学实验中由于线虫个体小，在提取单条线虫DNA模板的过程中存在容易混入其它试剂污染或者将单条线虫切断处理过程中易发生材料损失严重。本发明包含了一步直接在PCR管中简单刺破线虫虫体或虫卵的操作，不需要进行把线虫裂解液从其它载体转移到PCR管中，这样保证了线虫及其裂解物的存在，即DNA模板的存在，模板制备效率高。本发明对目前在植物寄生线虫鉴定研究等多个方面的分子诊断标记进行了PCR验证和部分进一步的酶切实验验证，效果显著。本发明还首次公布了用单个线虫虫卵作为模板进行植物寄生线虫的鉴定。
文档编号C12Q1/68GK103014157SQ20121051823
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者徐春玲, 谢辉, 赵传波, 丁莎, 张建峰 申请人:华南农业大学