专利名称：真菌Glarea lozoyensis及其在调控微生物代谢物纽莫康定B<sub>0</sub>中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型微生物及其应用,尤其涉及一种真菌Glarea lozoyensis及其通过调控微生物代谢获得纽莫康定Btl的应用。
背景技术：
棘白菌素又称棘球白素，是一类新型抗真菌药，属于乙酰六环类，对人体的毒性低，是一种水溶性的脂肽，主要用于治疗念珠菌食道炎或口咽炎、侵入性曲霉菌病及其他抗真菌药治疗无效或不能耐受者，对卡氏肺孢菌也有作用，通过抑制真菌细胞壁重要组成成分β (1，3)-D-葡萄糖的合成而发挥抗真菌作用。卡泊芬净(Caspofungin)是第一个批准上市的棘白菌素类抗真菌药。对于治疗持续发热及中性粒细胞较少患者，卡泊芬净作为经验性治疗，其安全性、生存率及有效率均较高，耐受性更好，治疗真菌感染和念珠菌败血症也有效，能杀灭正在生长的烟曲霉细胞。卡泊芬净是由纽莫康定B。(Pneumocandin B。)经过结构修饰后得到。其中纽莫康定Btl是真菌(Glarea lozoyensis)的微生物代谢产物,可以通过调控真菌(Glarealozoyensis)的微生物代谢也即发酵产生，经提取纯化后再经过多步反应合成得到卡泊芬净。一般的纽莫康定Btl产生菌，生产能力不稳定，产量较低，发酵副产物较多，杂质也较多，导致后提取工艺较为复杂，大大地增加了后续的提纯难度，并且难以获得高纯度的最终产物，从而难以更好地进行产业化生产。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种发酵单位高、能稳定生产、产量高且副产物少的纽莫康定Btl产生菌。本发明的另一目的是提供该菌株在制备纽莫康定Btl中的应用，以及具体的发酵制备方法。本发明的目的是通过下列技术方案实现的:一种真菌 FM2006071，分类命名为 Glarea lozoyensis FM2006071，由中国典型培养物保藏中心保藏(简称CCTCC)，保藏号为:CCTCC NO:M2012475，保藏日期为:2012年11月23日。所述的保藏号为CCTCC NO:M2012475的菌株是从福建省福州筛选得到的。所述的保藏号为CCTCC NO:M2012475的菌株的菌落特征:菌落近圆形，边缘白色，不规则扇形，菌落直径7.5-17.8mm，菌落隆起，中心形成纽结或陷落成坑，中间无分泌物和可溶性色素产生。根据微生物形态学及国外相关资料的描述，结合保藏号为CCTCC NO:M2012475的菌株的各种培养特征，该保藏号 为CCTCC NO:M2012475的菌株属于真菌属，定名为Glarealozoyensis FIM2006071。
所述的保藏号为CCTCC NO:M2012475的菌株可应用于发酵制备纽莫康定Btltl该制备方法包括下列步骤:a.菌株采用保藏编号为CCTCC NO:M2012475的菌株；b.将按常规方法制备的30%甘油菌丝冷冻管按摇瓶种子培养基体积的3-5%的接种量接入摇瓶种子培养基，220-260rpm,培养2_3天，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液按种子罐培养基体积0.1-0.2%的接种量接种于种子罐，120-200 rpm，培养3-4天，得罐种子液；将罐种子液按发酵体积的5-15%的接种量接种于发酵罐培养基，150-200 rpm,发酵培养9_12天，收集发酵液；其中培养温度均为22-26°C。其中所述的摇瓶种子培养基各组分在培养基中的比例为:每IOOmL培养基中，碳源l_8g,氮源2-8g,无机盐0-2.5g,其余为水；种子罐培养基各组分在培养基中的比例为:每IOOmL培养基中，碳源2_8g，氮源l_7g，无机盐0-2.5g，其余为水；
发酵培养基各组分在培养基中的比例为:每IOOmL培养基中，碳源8_16g,氮源l-5g,无机盐Ο-lg,氨基酸0-2g,其余为水。其中所述的培养基各组分在培养基中比例，优选为:摇瓶种子培养基各组分的比例为:每IOOmL培养基中,碳源2_4g,氮源4_6g,无机盐l_2g，其余为水；种子罐培养基各组分的比例为:每IOOmL培养基中，碳源4_6g，氮源3_5g，无机盐
0.5-1.5g，其余为水；发酵培养基各组分的比例为:每IOOmL培养基中，碳源10_14g，氮源2_4g，无机盐
0.3-0.5g，氨基酸0.5-1.5g，其余为水。其中所述的碳源选自土豆淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉、麦芽糊精、土豆糊精，甘油、葡萄糖、麦芽糖、土豆汁、土豆浸出粉、甘露醇中的一种或几种；所述的氮源选自黄豆饼粉、生豆粉、豆柏、玉米浆、玉米浆粉、蚕蛹水解液、尿素、硫酸铵、酵母粉、酵母浸出粉、棉籽粉、蚕蛹粉中的一种或几种;无机盐为 K2HPO4' MnSO4.4H20、NaCl、Fe (NH4)2(SO4)2.6H20、NaNO3> KNO3> MgSO4.7H20、FeSO4.7H20、KH2PO4 中的一种或几种；氨基酸为 L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-酪氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸中的一种或几种。其中所述的培养基优选为:碳源为葡萄糖、甘露醇中的一种或几种；氮源为酵母浸出粉、玉米浆粉、酵母粉、棉籽粉、生豆粉中的一种或几种；无机盐为KH2P04、K2HPO4,MnSO4.4H20、FeSO4.7H20中的一种或几种；氨基酸为L-脯氨酸、L-苏氨酸中的一种或几种。本发明所述的保藏号为CCTCC NO:M2012475的菌株是目前分离到的一种天然高单位的纽莫康定Btl的产生菌，发酵性能优良，可用于大规模生产。发酵过程是纽莫康定Btl生产的重要环节，其发酵水平与工艺优劣直接相关，本发明提供的发酵工艺经过摇瓶和10吨发酵罐中进行试验，其生产能力稳定。经检测，用本发明提供的菌种及发酵培养方法制备的纽莫康定Btl的发酵单位可高达300(^g/mL左右或以上，从而为后续的工业化生产提供了良好的基础。同时本发明的发酵副产物相对较少，并降低了后提取的难度，从而有利于高品质的卡泊芬净的获得，在应用于工业化生产上具有优势。
菌株保藏情况:保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2012475，分类命名为真菌 FM2006071 (Glarea lozoyensis FIM2006071 )0 保藏日期为2012年11月23日。
具体实施例方式下面结合具体实施例为本发明进行进一步的描述，但不能将方案中所涉及的方法及技术参数理解为对本发明的限制。实施例1:保藏号为CCTCC NO:M2012475的菌株的培养及生理生化特征和碳源利用情况1、保藏号为CCTCC NO:M2012475的菌株培养的形态学特征将保藏号为CCTCC N0:M2012475的菌株接种于酵母麦芽提取物琼脂培养基(YME)、土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)、沙氏琼脂培养基(SMA)等用于观察形态特征的培养基中，23°C培养3周，观察并进行描述。菌落在YME琼脂培养基上23°C培养，生长局限，3周直径11.7-15.4mm ;菌落近圆形，边缘不规则扇形；菌落隆起，中心形成纽结或陷落成坑；质地绒状兼绳状；菌落表面形成放射性的皱纹；菌丝颜色灰红色至淡粉红色，反面颜色淡褐色；无分泌物和可溶性色素产生。菌落在PDA培养基上23°C培养，菌落圆形边缘稍不规则，菌落较厚中心隆起，有不规则放射性皱纹；菌落生长较慢，3周直径7.5-17.8mm,质地绒状兼绳状。菌落最初时黄白色，粉白色，随着菌龄增长形成深色的菌落，中心呈淡褐色，有白色边缘；反面颜色初时黄白色，随培养时间延长深褐色。无分泌物和可溶性色素产生。菌落在SMA培养基上培养特征类似在PDA培养基上。生长局限，3周直径
11.2-15mm ;菌落近圆形，边缘不规则；菌落隆起，中心形成纽结；质地绒状兼绳状；菌落表面形成放射性的皱纹；菌丝颜色淡粉红色至粉白色，反面颜色黄白色；无分泌物和可溶性色素产生。2、保藏号为CCTCC NO:M2012475的菌株生理生化培养特征菌株FIM2006071不能降解纤维素。六种培养基双pH培养特征列在表I中。表I六种培养基pH4和pH7培养特征
权利要求
1.一种真菌(Glarea lozoyensis) FIM2006071,由中国典型培养物保藏中心保藏,保藏号为CCTCC NO:M2012475，保藏日期为:2012年11月23日。
2.按权利要求1所述的保藏号为CCTCCNO:M2012475的菌株在发酵制备纽莫康定B。中的应用。
3.用权利要求1所述的保藏号为CCTCCNO:M2012475的菌株发酵制备纽莫康定B。的方法，其特征在于包括下列步骤: a，发酵菌株采用保藏编号为CCTCC NO:M2012475的菌株； b，将按常规方法制备的30%甘油菌丝冷冻管按摇瓶种子培养基体积的3-5%的接种量接入摇瓶种子培养基，220-260rpm，培养2_3天，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液按种子罐培养基体积0.1-0.2%的接种量接种于种子罐，120-200 rpm，培养3-4天，得罐种子液；将罐种子液按发酵体积的5-15%的接种量接种于发酵罐培养基，150-200rpm,发酵培养9_12天，收集发酵液；其中培养温度均为22-26°C。
4.按权利要求3所述的发酵制备方法，其特征是: 摇瓶种子培养基各组分在培养基中的比例为:每IOOmL培养基中，碳源l_8g，氮源2_8g，无机盐0-2.5g，其余为水； 种子罐培养基各组分在培养 基中的比例为:每IOOmL培养基中，碳源2-8g，氮源l_7g，无机盐0-2.5g，其余为水； 发酵罐培养基各组分在培养基中的比例为:每IOOmL培养基中,碳源8-16g,氮源l_5g,无机盐Ο-lg,氨基酸0-2g,其余为水。
5.按权利要求4所述的发酵制备方法,培养基各组分在培养基中的优选比例为: 摇瓶种子培养基各组分的比例为:每IOOmL培养基中，碳源2-4g，氮源4-6g，无机盐l-2g，其余为水； 种子罐培养基各组分的比例为:每IOOmL培养基中，碳源4-6g,氮源3-5 g,无机盐0.5-1.5g，其余为水； 发酵罐培养基各组分的比例为:每IOOmL培养基中，碳源10-14g，氮源2_4g，无机盐0.3-0.5g，氨基酸0.5-1.5g，其余为水。
6.按权利要求4或5所述的制备方法，其中所述的培养基各组分为:碳源选自土豆淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉、麦芽糊精、土豆糊精，甘油、葡萄糖、麦芽糖、土豆汁、土豆浸出粉、甘露醇中的一种或几种；氮源选自黄豆饼粉、生豆粉、豆柏、玉米浆、玉米浆粉、蚕蛹水解液、尿素、硫酸铵、酵母粉、酵母浸出粉、棉籽粉、蚕蛹粉中的一种或几种；无机盐选自K2HPO4, MnSO4.4H20、NaCl、Fe (NH4) 2 (SO4) 2.6H20、NaNO3> KNO3> MgSO4.7H20、FeSO4.7H20、KH2PO4中的一种或几种；氨基酸选自L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-酪氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸中的一种或几种。
7.按权利要求6所述的制备方法，其中所述的培养基优选为:碳源为葡萄糖、甘露醇中的一种或几种；氮源为酵母浸出粉、玉米浆粉、酵母粉、棉籽粉、生豆粉中的一种或几种；无机盐为KH2PO4、K2HPO4、MnSO4 *4H20,FeSO4.7Η20中的一种或几种；氨基酸为L-脯氨酸、L-苏氨酸中的一种或几种。
全文摘要
本发明公开了一种真菌(Glarea lozoyensis) FIM2006071，该菌株由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NOM2012475，保藏日期为2012年11月23日。本发明还公开了通过调控其微生物代谢来获得高单位的卡泊芬净中间体纽莫康定B0。本发明提供的发酵菌株性能优良，生产能力稳定，发酵单位高且发酵副产物相对较少，降低了后提取难度，有利于得到高品质的卡泊芬净，适宜于工业化大生产。
文档编号C12P21/04GK103087928SQ20131003289
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者朱健, 陈晓霞, 王蓓, 许永锋, 吴娟, 严咪咪 申请人:杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司