专利名称：一种用维生素d受体基因遗传多态性预测优秀冰雪运动员身高的分子生物学方法
技术领域：
本发明涉及一种预测优秀冰雪运动员身高的分子生物学方法。适合于优秀冰雪运动员在基因水平上的早期选材，属于体育科学与分子生物学交叉的学科领域。
背景技术：
随着现代竞技运动的迅速发展和选材育材的科学化进程，运动员的身体形态特征对运动成绩的影响逐渐受到重视。身高是评价体格发育的重要项目，也是反映骨骼系统增长的常用指标。身高作为发育水平的一个重要的生理参数，已成为了广大教练员选拔青少年运动员和预测项目身高要求的一项重要身体形态指标之一。现代竞技体育运动中许多项目对运动员身高都有特殊的高度要求，譬如体操、跳水、技巧项目的矮身材要求，双人或多人项目的同身高同长 度要求，尤其在冰雪运动项目中，最适身高的运动员占据得天独厚的优势。虽然最理想的身高条件并非是运动员获取优异成绩的唯一保证，但它却是运动项目选项、潜质运动员接受训练的一个起点和基础，其后效作用在竞技比赛中决不可低估。因此，青少年运动员身高的选拔和预测，就成为运动员科学选材工作中对优秀体育后备人才筛选的重要研究课题。实践证明，原有的选材的方法和手段极大地促进了我国体育事业发展，发现和培养了大批优秀体育人才。目前，运动员身高的预测方法主要包括依父母身高来预测子女未来成年身高、依少儿当年或动态身高年增长值来预测未来成年身高、依少儿肢体骨发育长度来预测未来身高、依判断发育程度水平来预测未来身高等几类方法。这几类身高的预测方法主要从人体身高的外在表现性状出发，通过数理统计方法来预测身高。然而，很多遗传因素会限制或阻碍运动成绩的提高，其中遗传度越高的指标，限制后天运动水平再提高的程度越明显。凭经验选材、形态观察、竞赛淘汰等方法已远远落后于运动员科学选材的发展要求。国际高水平的体育科研已经进入分子研究领域，并推动竞技运动水平不断提高，运动员科学选材领域已出现了利用基因选材的理念。明确基因和运动能力的密切关系，进而从基因水平选材，将成为未来运动员选材的主导方向之一。近年来，生命科学尤其是分子生物学和人体运动科学取得了突破性发展，为运动员的选材提供了理论基础。从分子水平上探讨身高的发展和变化规律引起广大遗传学家、教练员和选材工作者的关注。基因作为决定人体组织结构和功能性状的基本单位，基因选材的技术和方法自然也就在运动员选材领域应运而生。维生素D受体基因(vitamin D receptor gene,VDR gene)的等位基因多态性与骨密度、骨转换、肠道钙吸收存在一定关联，且与人骨生理参数正常变异相关，是骨代谢的遗传标记。VDR基因编码产物维生素D3受体蛋白为细胞内多肽，属类固醇类激素，能与特定物质结合后作用于靶细胞核，发挥调节成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞分化、增生的生物学作用，从而影响骨钙化、骨骼生长。对VDR基因多态性与疾病、骨代谢、生长发育相关性的研究一直是学者的关注热点。维生素D受体基因定位于12ql3.14。全长45kb，由9个外显子和8个内含子组成。目前报导VDR基因多态性与4个单核苷酸多态性(Singles NucleotidePolymorphism, SNP)位点有关，分别是Bsm 1、Taq 1、Apa I和Fok I，依次位于VDR基因的第8内含子、第9外显子和转录起始位点。目前对VDR基因多态性研究主要集中在Bsm 1、Apa I和Fok I三个SNP位点上，在相应的多态性位点上有相应的碱基替换(T — C、A — C、T — C)。当Bsm I和Fok I存在单碱基替换(T — C)时，该单核苷酸多态性位点变异恰好成为限制性内切酶Bsm I和FokI的酶切位点；当Apa I存在单碱基替换(A — C)时，该单核苷酸多态性位点变异恰好成为限制性内切酶Apa I的酶切位点。研究Bsm 1、Apa I和Fok I三个SNP位点多态性特征对优秀冰雪运动员的身高较其他多态性位点有更重要的意义，通过研究不同位点基因型的频率可以从基因水平上预测优秀冰雪运动员的身高。
发明内容
本发明提供了一种在分子生物学水平上预测优秀冰雪运动员身高的方法。本发明从分子生物学水平上预测了优秀冰雪运动员的最适身高，通过与身高密切相关的位点基因多态性，即VDR基因Bsm 1、Apa I和Fok I多态性位点的基因型概率来预测优秀冰雪运动员的最适身高。
具体实施例方式
下面以优秀冰雪运动员VDR基因的单核苷酸多态性为例来详细说明本发明的具体实施。实施例:检测优秀冰雪运动员VDR基因的单核苷酸多态性选取10名优秀冰雪运动员，每名外周静脉取血5ml，于抗凝管中备用(抗凝管编号为01-10，设为10个重复)，设为实验组；选取10名普通人进行外周静脉取血，每名5ml，于抗凝管中备用(抗凝管编号为10-20，设为10个重复)，设为对照组。VDR基因Bsm 1、Apa I和Fok I三个SNP多态性检测，具体方法如下:(I)外周血DNA提取将实验组和对照组的外周血样用中量血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，DP332)获得DNA标本，_20°C保存。(2) PCR 反应利用Primer5.0软件设计符合研究需要的引物序列。含BsmI多态性位点PCR扩增的引物序列为 Pl:5’ -ATAAGGAAATACCTACITTGCTGGITT-3’ P2:5’ -TAGGTGCTCAATAAATTGTTGCTAAG-3’。扩增参数为95°C预变性5min ;95°C变性60s ;53°C复性60s ;72°C延伸90s，重复35个循环；72°C延伸IOmin。含ApaI多态性位点PCR扩增的引物序列为P1: 5 ’ -ACCTAGGTCTGGATCCT-AAATGCAC-3，P2:5’-GITAGGTTGGACAGGAGAGAGAATG-3’。PCR 反应条件为 95°C预变性 5min ；95°C变性45s ;55°C复性45s ;72°C延伸90s，重复35个循环；72°C延伸IOmin0含FOKI多态性位点PCR扩增的引物序列为P1:5 ’ -AGCTGGCCCTGGCAC-3 ’，P2:5’-ATGGAAACACCTTGC-3’。PCR 反应条件为 95°C预变性 5min ;95°C变性 45s ;55°C复性 45s ；72°C延伸90s,重复35个循环；72°C延伸IOmin0
特异性扩增产物的片段分别约580bp、630bp和265bp。PCR扩增产物4°C保存，并在2%的琼脂糖凝胶上电泳确证。(3)酶切反应及基因多态性将PCR产物进行酶切。酶切反应在EP管中进行，20 ill酶切体系:BSA0.2 iil，10XNE缓冲液2 iil，内切酶0.5 iil，PCR产物15 yl，37°C反应4h。2%琼脂糖凝胶电泳。检测结果酶切产物呈现出三种状态，即未切开、部分切开及全部切开，可说明该基因的三个SNP位点各存在着三种基因型，BsmI和FOKI多态性位点三种基因型为C/C、C/T和T/T ；ApaI多态性位点三种基因型为C/C、C/A和A/A。(4)测序:随机选取3种基因型PCR产物各4份进行序列测定，结果用0miga2.0软件与Genbank中VDR基因序列比较。测序结果显示，VDR基因第8内含子的+283位点上存在T — C碱基突变，因此，相应位点即BsmI SNP位点存在C/C、C/T和T/T三种基因型；VDR基因第9外显子的-46位点上存在C — A碱基突变，因此，相应位点即ApaI SNP位点存在C/C、C/A和A/A三种基因型；VDR基因第429bp位点上存在T — C碱基突变，因此，相应位点即FOKI SNP位点存在C/C、C/T和T/T三种基因型。(5)计算优秀冰雪运动员VDR基因Bsm 1、Apa I和Fok I多态性位点三种相应基因型概率。BsmI多态性位点三种基因型C/C、C/T和T/T的概率分别为89.62%,8.49%,1.89% ；F0KI多态性位点三种基因型C/C、C/T和T/T的概率分别为36.96%,46.96%,16.08% ；ApaI多态性位点三种基因型C/C、C/A和A/A的概率分别为60.38%,30.38%,8.96%。通过比较实验组和对照组VDR基因的三个SNP位点遗传多态性，即VDR基因Bsm
1、Apa I和Fo k I三个SNP位点的基因型频率分布特征来预测优秀冰雪运动员的身高。
权利要求
1.一种通过检测维生素D受体基因遗传多态性预测优秀冰雪运动员的身高的分子生物学方法。
2.依据权利要求I所述的分子生物学方法，其特征在于对维生素D受体基因BsmI、Apa I 和 Fok I 三个单核苷酸多态性(Singles Nucleotide Polymorphism, SNP)位点上的遗传多态性进行检测，即通过检测相应位点基因型概率特征来预测优秀冰雪运动员的最适身高。
3.依据权利要求2所述，BsmI多态性位点三种基因型C/C、C/T和T/T的概率分别为89. 62%,8. 49%,1.89% ；F0KI多态性位点三种基因型C/C、C/T和T/T的概率分别为.36. 96%,46. 96%,16. 08% ；ApaI多态性位点三种基因型C/C、C/A和A/A的概率分别为.60. 38%,30. 38%,8. 96%。
全文摘要
本发明公开了一种预测优秀冰雪运动员身高的分子生物学方法。通过检测维生素D受体基因遗传多态性，即对维生素D受体基因Bsm I、Apa I和Fok I三个单核苷酸多态性位点的基因型进行命名并检测相应基因型的概率来预测优秀冰雪运动员的最适身高。结果显示，BsmI多态性位点三种基因型C/C、C/T和T/T的概率分别为89.62％、8.49％、1.89％；FOKI多态性位点三种基因型C/C、C/T和T/T的概率分别为36.96%、46.96%、16.08%；ApaI多态性位点三种基因型C/C、C/A和A/A的概率分别为60.38%、30.38%、8.96%。本发明为建立该项目运动员潜能的早期预测、评定、选材和育材的科学体系打下坚实的理论和技术基础，提升选材的成功率，突破一次性选材的理论和技术难关。
文档编号C12Q1/68GK103255211SQ201310108108
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月1日 优先权日2013年4月1日
发明者赵玉华, 朱志强, 刘冬, 崔鹏, 裴沛, 关伟军 申请人:哈尔滨体育学院