专利名称：一种牦牛精子体外获能的方法
技术领域：
本发明属牦牛繁殖领域，涉及牦牛胚胎生物技术，具体涉及一种牦牛精子体外获能的方法。
背景技术：
牦牛是分布于青藏高原及毗邻地区特有的牛种资源。牦牛的繁殖具有明显的季节性，牦牛发情具有普通牛的一般特征，但不如普通牛种明显。但特殊的自然生态环境条件，使牦牛形成了晚熟、繁殖力低的生态生理特性。随着现代生物技术的发展，胚胎生物技术逐步应用于牦牛科学研究，但由于重复性差、结果不稳定，致使牦牛胚胎生物技术在牦牛生产上还未有效开展。尤其是牦牛体外受精技术，普遍存在的问题是受精卵的卵裂率和囊胚体外发育率结果不稳定，体外受精的总成功率偏低。而牦牛精子的体外获能是体外受精技术的关键环节，因此极有必要针对牦牛生态生理特性与繁殖特征，研制出一种牦牛精子体外获能的方法，完善牦牛胚胎体外生产技术方案，加速生物技术在牦牛繁育中的应用，从而提高牦牛繁殖效率，全面发挥优良牦牛的繁殖特性。
发明内容
为了降低精子解冻过程中的损伤，提高有效获能精子数，解决上述技术问题，本发明针对牦牛冷冻精液与精子特点，提供一种简便、合理的牦牛精子体外获能的方法，结果准确，易于操作，可用于牦牛胚胎体外生产及相关科学研究中，并为牦牛胚胎生物技术发展提供参考。其技术方案如下:
一种牦牛精子体外获能的方法，包括如下步骤:(I)从液氮罐中取出冷冻精液细管，空气中停留6s，然后投入37°C 38°C的恒温水浴锅中，待其融化1/2时取出；(2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分，再迅速用酒精棉球搽拭一次，置于超净工作台内使其完全溶解；(3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理；(4)将步骤(3)处理的精子，移入受精液中，精卵共培养，进行体外受精，检测精子获能效果；(5)受精16 18h后，用早期胚胎培养液把受精卵洗涤3 5遍，转移至早期胚胎培养液中，48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。进一步优选，所述步骤(3)上浮法步骤为:向溶解后的精液中加入ImL精子获能液，混匀后分装于4个小塑料离心管中，38.50C CO2培养箱上浮lh，然后将4个离心管中的上清液小心收集到I个IOmL离心管中，约0.6 0.8mL, 700 800g离心洗漆2次,8 IOmin/次；洗漆后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成2X IO7 4X IO7个/mL, 38.5°C预孵获能处理25 30min，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、1.0mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由IOOmM氯化钠、3.1mM氯化钾、2.1mM氯化钙、04mM氯化镁、0.29mM磷酸二氢钠、21.6mM乳酸钠、IOmM H印es、25mM碳酸氢钠及抗生素组成；所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素；所述CO2培养箱中:C02含量5%、温度38.5°C、湿度饱和。进一步优选，所述步骤(4)体外受精步骤为:将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤3 5遍，放入预孵2h的50 μ L受精液微滴中，每滴15 20枚；每微滴受精液加入25 50 μ L获能后的精子悬液，使精子的最终浓度为I X IO6个/mL，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、0.09mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由114mM氯化钠、3.2mM氯化钾、
2.0mM氯化钙、0.5mM氯化镁、0.4mM磷酸二氢钠、25mM碳酸氢钠、IOmM乳酸钠及抗生素组成；所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素；所述CO2培养箱中:C02含量5%、温度38.5 °C、湿度饱和。进一步优选，所述步骤(5)中，早期胚胎培养液为基础液M199添加10%胎牛血清及抗生素；所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素；培养条件为CO2含量5%、温度38.5 °C、湿度饱和。本发明的有益效果:本发明解冻的牦牛冷冻精液精子活力> 0.35，获能后精子活力> 0.7，受精用精子密度I X IO6 2X IO6个/mL，受精用精子畸形率< 15 %，成熟卵母细胞受精后卵裂率^ 60%。本发明用于牦牛冷冻精液精子体外获能技术与方法全面，操作方便，测定结果准确，易于牦牛胚胎体外生产使用。本发明用于牦牛冷冻精液精子体外获能技术与方法全面，操作方便，测定结果准确，易于牦牛胚胎体外生产使用。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。实施例1解冻I支牦牛冷冻精液进行体外获能处理。(I)从液氮罐中取出I支牦牛冷冻精液细管，空气中停留6s，然后投入37°C 38°C的恒温水浴锅中，待其融化1/2时取出。(2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分，再迅速用酒精棉球搽拭一次，置于超净工作台内使其完全溶解。(3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理；上浮法步骤为:向溶解后的精液中加入ImL精子获能液，混匀后分装于4个小塑料离心管中，38.5°C CO2培养箱上浮lh，然后将4个离心管中的上清液小心收集到I个IOmL离心管中，约0.6 0.8mL，700g离心洗涤2次，IOmin/次；洗漆后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成2X IO7 4X IO7个/mL，38.5°C预孵获能处理25min，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mL BSA、1.0mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由IOOmM氯化钠、3.1mM氯化钾、2.1mM氯化钙、0.4mM氯化镁、0.29mM磷酸二氢钠、21.6mM乳酸钠、IOmM H印es、25mM碳酸氢钠及抗生素组成；所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素；所述CO2培养箱中:C02含量5%、温度38.5°C、湿度饱和。
(4)将步骤(3)处理的精子，移入受精液中，精卵共培养，进行体外受精，检测精子获能效果；体外受精步骤为:将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤3 5遍，放入预孵2h的50 μ L受:精液微滴中，每滴20枚；每微滴受:精液加入50 μ L获能后的精子悬液，使精子的最终浓度力I X IO6个/mL，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、0.09mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由114mM氯化钠、3.2mM氯化钾、2.0mM氯化钙、0.5mM氯化镁、0.4mM磷酸二氢钠、25mM碳酸氢钠、IOmM乳酸钠及抗生素组成；所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素；所述CO2培养箱中:C02含量5%、温度38.5°C、湿度饱和。(5)受精18h后，用早期胚胎培养液把受精卵洗涤3 5遍，转移至早期胚胎培养液中，48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。早期胚胎培养液为基础液M199添加10%胎牛血清及抗生素；所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素；培养条件为CO2含量5%、温度38.5 °C、湿度饱和。
实施例2解冻2支牦牛冷冻精液进行体外获能处理。(I)从液氮罐中取出2支牦牛冷冻精液细管，空气中停留6s，然后投入37°C 38°C的恒温水浴锅中，待其融化1/2时取出。(2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分，再迅速用酒精棉球搽拭一次，置于超净工作台内使其完全溶解。(3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理；上浮法步骤为:向溶解后的精液中加入1.5mL精子获能液，混匀后分装于6个小塑料离心管中，38.5°C CO2培养箱上浮lh，然后将6个离心管中的上清液小心收集到I个15mL离心管中，约0.8 1.2mL,800g离心洗涤2次，8min/次；洗漆后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成2X IO7 4X IO7个/mL，38.5°C预孵获能处理30min，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mL BSA、1.0mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由IOOmM氯化钠、3.1mM氯化钾、2.1mM氯化钙、0.4mM氯化镁、0.29mM磷酸二氢钠、21.6mM乳酸钠、IOmM H印es、25mM碳酸氢钠及抗生素组成；所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素；所述CO2培养箱中:C02含量5%、温度38.5°C、湿度饱和。(4)将步骤(3)处理的精子，移入受精液中，精卵共培养，进行体外受精，检测精子获能效果；体外受精步骤为:将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤3 5遍，放入预孵2h的50 μ L受精液微滴中，每孔20枚卵母细胞；每微滴加入25 μ L获能后的精子悬液，使精子的最终浓度为I X IO6个/mL，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、0.09mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由114mM氯化钠、3.2mM氯化钾、2.0mM氯化钙、0.5mM氯化镁、0.4mM磷酸二氢钠、25mM碳酸氢钠、IOmM乳酸钠及抗生素组成:所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素；所述CO2培养箱中:C02含量5%、温度38.50C、湿度饱和。(5)受精16h后，用早期胚胎培养液把受精卵洗涤3 5遍，转移至早期胚胎培养液中，48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。早期胚胎培养液为基础液M199添加10%胎牛血清及抗生素；所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素；培养条件为CO2含量5%、温度38.5 °C、湿度饱和。实施例3200枚牦牛卵母细胞体外受精用冷冻精液体外获能处理。
(I)从液氮罐中取出2支牦牛冷冻精液细管，空气中停留6s，然后投入37°C 38°C的恒温水浴锅中，待其融化1/2时取出。(2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分，再迅速用酒精棉球搽拭一次，置于超净工作台内使其完全溶解。(3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理；上浮法步骤为:向溶解后的精液中加入1.5mL精子获能液，混匀后分装于6个小塑料离心管中，38.5°C CO2培养箱上浮lh，然后将6个离心管中的上清液小心收集到I个15mL离心管中，约0.8 1.2mL, 700 800g离心洗涤2次，8 IOmin/次；洗涤后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成2X IO7 4X IO7个/mL，38.5°C预孵获能处理30min，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mL BSA、1.0mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由IOOmM氯化钠、3.1mM氯化钾、2.1mM氯化钙、0.4mM氯化镁、0.29mM磷酸二氢钠、21.6mM乳酸钠、IOmM H印es、25mM碳酸氢钠及抗生素组成；所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素 ；所述CO2培养箱中:C02含量5%、温度38.5 °C、湿度饱和。(4)将步骤(3)处理的精子，移入受精液中，精卵共培养，进行体外受精，检测精子获能效果；体外受精步骤为:将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤3 5遍，放入预孵2h的600 μ L四孔培养板受精液中，每孔50枚卵母细胞；每孔受精液加入100 200 μ L获能后的精子悬液，使精子的最终浓度为IX IO6个/mL，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、0.09mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由114mM氯化钠、3.2mM氯化钾、2.0mM氯化钙、0.5mM氯化镁、0.4mM磷酸二氢钠、25mM碳酸氢钠、IOmM乳酸钠及抗生素组成；所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素；所述CO2培养箱中:C02含量5%、温度38.5°C、湿度饱和。(5)受精16h后，用早期胚胎培养液把受精卵洗涤3 5遍，转移至早期胚胎培养液中，48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。早期胚胎培养液为基础液M199添加10%胎牛血清及抗生素；所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素；培养条件为CO2含量5%、温度38.5 °C、湿度饱和。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，通过技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种牦牛精子体外获能的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)从液氮罐中取出冷冻精液细管，空气中停留6S，然后投入37°C 38°C的恒温水浴锅中，待其融化1/2时取出； (2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分，再迅速用酒精棉球搽拭一次，置于超净工作台内使其完全溶解； (3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理； (4)将步骤(3)处理的精子，移入受精液中，精卵共培养，进行体外授精，检测精子获能效果； (5)受精16 18h后，用早期胚胎培养液把受精卵洗涤3 5遍，转移至早期胚胎培养液中，48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)上浮法步骤为:向溶解后的精液中加入ImL精子获能液，混匀后分装于4个小塑料离心管中，38.5°C CO2培养箱上浮lh，然后将4个离心管中的上清液小心收集到I个IOmL离心管中，约0.6 0.8mL, 700 800g离心洗洚2次,8 IOmin/次；洗漆后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成2X IO7 4X IO7个/mL，38.5°C预孵获能处理25 30min，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mL BSA、1.0mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由IOOmM氯化钠、3.1mM氯化钾、2.1mM氯化钙、0.4mM氯化镁、0.29mM磷酸二氢钠、21.6mM乳酸钠、IOmM H印es、25mM碳酸氢钠及抗生素组成；所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素；所述CO2培养箱中:C02含量5%、温度38.5°C、湿度饱和。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)体外受精步骤为:将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤3 5遍，放入预孵2h的50 μ L受精液微滴中，每滴15 20枚；每微滴受精液加入50 μ L获能后的精子悬液，使精子的最终浓度为I X IO6个/mL，所述获能液由TALP基础液添加6mg/mL BSA、0.09mM丙酮酸钠组成；所述TALP基础液由114mM氯化钠、3.2mM氯化钾、2.0mM氯化钙、0.5mM氯化镁、0.4mM磷酸二氢钠、25mM碳酸氢钠、IOmM乳酸钠及抗生素组成；所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素；所述0)2培养箱中:C02含量5%、温度38.5°C、湿度饱和。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，早期胚胎培养液为基础液M199添加10%胎牛血清及抗生素；所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素；培养条件为CO2含量5%、温度38.5°C、湿度饱和。
全文摘要
本发明公开了一种牦牛精子体外获能的方法，主要包括牦牛冷冻精液解冻方法、精子体外获能液及获能方法、精子体外受精液及获能效果评估方法。并提供了牦牛精子体外获能的具体条件，确保牦牛精子体外获能的质量和效率。本发明技术与方法全面，操作方便，测定结果准确，可完全用于牦牛精子体外获能或胚胎体外生产，能够有效提高牦牛的繁殖效率。
文档编号C12Q1/02GK103173406SQ20131013412
公开日2013年6月26日 申请日期2013年4月18日 优先权日2013年4月18日
发明者郭宪, 丁学智, 阎萍, 梁春年, 王宏博 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所