专利名称：修饰天然sod酶液的方法、后处理修饰的sod酶液及肉豆蔻酸-sod冻干粉的制作方法
技术领域：
本发明涉及生化领域，具体涉及一种修饰天然SOD酶液的方法、后处理修饰的SOD酶液及制备肉豆蘧酸-SOD冻干粉。
背景技术：
自由基学说是在生命科学领域中，越来越被人们广泛接受的关于生命体衰老理论的学说，该学说认为自由基是造成生命体老化及诸多疾病的重要原因。据估计80%左右的老化性、退行性疾病都与自由基有关，其中包括癌症、老年痴呆症、帕金森氏症、皮肤色素沉积、白内障、心脏病等，所以清除自由基对维持健康体魄和保持年轻体态至关重要。而SOD是专一的自 由基清除剂。SOD是一种广泛存在于动物、植物和微生物中，具有催化超氧阴离子自由基发生歧化反应的生物酶，其催化的歧化反应式如下:.02 +.02 +2HH—> H202+02SOD能清除人体细胞内的超氧阴离子自由基(生物垃圾)，因而被誉为人体的生物垃圾清道夫，而自由基过多则导致80多种疾病，因此人体适时适量补充S0D，就能预防甚至治疗因自由基过多而导致的多种疾病，具有抗氧化、抗辐射、抗癌变、消炎等功能，用于治疗或辅助治疗心脑血管疾病、自身免疫性疾病、血液再灌注损伤、慢性炎症和癌症等，而且可用于日常的抗衰老保健，防治老年性疾病和慢性病等。据报道，SOD的修饰方法已有多种，如袁勤生用右旋糖酐对SOD的化学修饰(生物化学与生物物理学报[J]，1986 ；18(2):308)和陈吉祥、袁勤生用β _环糊精对SOD的化学修饰(中国医药工业杂志[J]，1998 ；29(2):59-61)及尹亮用聚乙二醇修饰SOD(生物技术[J]，2003:8)。右旋糖酐、β -环糊精和聚乙二醇等大分子化合物做为修饰剂，使修饰后的SOD分子量大幅度增加，达到300 400kd，静脉注射时易引起血管堵塞，而且修饰时SOD酶活性损失闻达40%左右。也有学者用月桂酸等小分子修饰剂来修饰SOD的，如邹国林的《月桂酸修饰SOD的制备及其稳定性研究》(武汉大学学报(自然科学版)[J]，1998 ；44(4):49(81))和阎家麒的《月桂酸修饰SOD的制备及性质研究》(生物化学与生物物理进展[J]，1994 ；21⑵:154-157)，还有邹国林的《硬脂酸修饰SOD的制备及其性质》(生物化学杂志[J]，1996 ；12(1):64-67)等。阎家麒的修饰方法，需要把月桂酸活化，而活化是一个复杂的化学反应过程，反应不完全容易导致氯化亚砜、吡啶等化学试剂的残留，影响产品的安全性。邹国林的修饰方法，把月桂酰氯一次性地加入到SOD酶液中，会导致SOD酶液的pH值急剧下降和月桂酰氯局部浓度过高，造成SOD的活性损失达20%左右，而且反应过程剧烈而不易控制，从而不适于规模化生产。
发明内容
针对上述不足之处，本发明的目的之一是提供一种修饰天然SOD酶液的方法，该修饰天然SOD酶液的方法使天然SOD的修饰反应活性损失仅在5%左右，且能降低成本。技术方案是:一种修饰天然SOD酶液的方法，所述天然SOD酶液修饰采用的修饰剂为肉豆蘧酰氯。作为优选，所述天然SOD酶液是采用以下步骤制取的:将酶活性为6.0X IO3 1.2X104U/mg蛋白的天然SOD冻干粉，溶解于pH9.0，
0.05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液中。作为优选，所述天然SOD冻干粉为60 200克。作为优选，所述肉豆蘧酰氯为45 150ml，肉豆蘧酰氯浓度为95% -99%。作为优选，所述天然SOD酶液修饰是通过以下步骤完成的:天然SOD酶液倒入带夹套的反应釜中，搅拌，加热至36 45°C并保持恒温；然后滴加肉豆蘧酰氯，同时滴加2 mol/L碱溶液，使酶液的pH值始终维持在9.0左右；恒温反应I小时，其中肉豆蘧酰氯在前30分钟左右滴加完毕；碱溶液的滴加贯穿整个反应过程以维持酶液PH值的稳定；修饰反应完毕后，迅速倒出酶液并冷却至4°C，得到修饰的SOD酶液。所述碱溶液可以是氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液以及其它碱性溶液之一，也可以是它们中两种或两种以上的混合液。优选2mo I/L的氢氧化钠溶液。作为优选，所述肉豆蘧酰氯和碱溶液滴加是连续缓慢滴加的。本发明的目的之二是提供一种后处理上述修饰的SOD酶液的方法。技术方案是:一种后处理修饰的SOD酶液的方法，所述后处理包括以下步骤:修饰SOD酶液冷却后，边搅拌边加入2倍体积的冷丙酮，静置30分钟后离心，收集沉淀，用适量的纯净水溶解，再离心去除沉淀，以除去未反应的肉豆蘧酰氯，收集上清液，超滤浓缩后冷冻干燥，得到肉豆蘧酸-SOD冻干粉。本发明的目的之三是提供一种肉豆蘧酸-SOD冻干粉。 技术方案是:一种肉豆蘧酸-SOD冻干粉，所述肉豆蘧酸-SOD冻干粉是采用上述方法制备的。发明的原理:肉豆蘧酰氯在弱碱性条件下，作用于SOD分子表面的非活性部位的赖氨酸，并与赖氨酸的ε -NH2共价结合,即发生Schotten-Baumann反应,形成一种酰化S0D,增强了 SOD的刚性构象，酰化所产生的空间障碍和静电斥力，阻挡了蛋白水解酶和其他制剂对SOD的进攻，使稳定SOD分子构象的次级键得到保护，SOD的稳定性大幅提闻。本发明直接用高纯度肉豆蘧酰氯做修饰剂，而省去了肉豆蘧酸的活化反应步骤。因肉豆蘧酸与氯化亚砜反应生成肉豆蘧酰氯，往往反应不完全，容易导致氯化亚砜、吡啶等化学试剂的残留，影响了产品的安全性；其次，减少了活化反应这一步骤，节约了设备投入和人力成本，共计节约了 3%左右的生产成本。更重要的是，肉豆蘧酰氯是连续缓慢滴加到SOD酶液中发生Schotten-Baumann反应，加入约需要30分钟左右的时间；滴加肉豆蘧酰氯的同时，连续缓慢滴加2mol/L的碱溶液，使酶液的PH值始终稳定在9.0左右，这样，SOD酶液的pH值波动不大，反应过程温和而容易控制，从而适于规模化生产；并且SOD活性损失少，整个修饰工艺，SOD的活性损失在5%左右，不会造成肉豆蘧酰氯一次性加入后，SOD酶液的pH值急剧下降导致SOD活性损失大的现象。
有益效果是:1、直接用肉豆蘧酰氯做修饰剂，省去了活化反应步骤，不仅避免了化学试剂的残留，保证了产品的安全性，而且节约了设备投入和人力成本，共计节约了 3%左右的生产成本。2、肉豆蘧酰氯和碱溶液的连续缓慢滴加方法，改变了修饰反应的过程和环境，使SOD酶液的pH值波动不大，反应过程温和而容易控制，从而适于规模化生产；并且SOD的修饰反应活性损失在5%左右，而以前的修饰方法，SOD活性损失在20%左右，比较下来，减少了 15%左右的活性损失。
具体实施方式
下面将参照实施例具体阐明本发明。实施例1.
将酶活性为8.73 X 103U/mg蛋白的天然SOD冻干粉(成都养泰和生物科技有限公司生产)60克，溶解于3500ml的pH9.0,0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中，得天然SOD酶液。将天然SOD酶液倒入带夹套的IOL玻璃反应釜中，开动搅拌装置，夹套热水循环加热至38°C，并保持恒温；然后连续缓慢滴加56ml肉豆蘧酰氯，同时连续缓慢滴加2mol/L的NaOH液，使酶液的pH值始终维持在9.0左右，恒温反应I小时，其中肉豆蘧酰氯在前30分钟左右滴加完毕；而NaOH液的滴加贯穿整个反应过程,但滴加速度逐渐减慢。修饰反应完毕后，迅速倒出SOD酶液，用热交换器冷却至室温，然后放置到冰柜中进一步冷却至4°C，得到修饰的SOD酶液。修饰的SOD酶液冷却后，边搅拌边加入2倍体积的-18°C的冷丙酮，静置30分钟后离心，收集沉淀，用适量的纯净水溶解，再离心去除沉淀，以除去未反应的肉豆蘧酰氯，收集上清液，超滤浓缩后冷冻干燥，得到56.8克、活性为8.31 X 103U/mg蛋白的肉豆蘧酸-SOD冻干粉。实施例2.
将酶活性为1.03 X 104U/mg蛋白的天然SOD冻干粉(成都养泰和生物科技有限公司生产)100克，溶解于7000ml的pH9.0,0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中。天然SOD酶液倒入带夹套的IOL玻璃反应釜中，开动搅拌装置，夹套热水循环加热至42°C，并保持恒温；然后连续缓慢滴加94ml肉豆蘧酰氯，同时连续缓慢滴加2mol/L的KOH液，使酶液的pH值始终维持在9.0左右，恒温反应I小时，其中肉豆蘧酰氯在前30分钟左右滴加完毕；而KOH液的滴加贯穿整个反应过程，但滴加速度逐渐减慢。修饰反应完毕后，迅速倒出SOD酶液，用热交换器冷却至室温，然后放置到冰柜中进一步冷却至4°C，得到修饰的SOD酶液。修饰SOD酶液冷却后，边搅拌边加入2倍体积的_18°C的冷丙酮，静置30分钟后离心，收集沉淀，用适量的纯净水溶解，再离心去除沉淀，以除去未反应的肉豆蘧酰氯，收集上清液，超滤浓缩后冷冻干燥，得到95.8克、活性为9.75X 103U/mg蛋白的肉豆蘧酸-SOD冻干粉。对比实验I采用文献武汉大学学报(自然科学版)[J]，1998 ；44(4):49(81))的方法，将酶活性为8.73 X 103U/mg蛋白的天然SOD冻干粉30克，溶于pH9.0,0.lmol/L的NaCO3缓冲液2000ml中，然后倒入反应釜中，搅拌中加入28ml月桂酰氯，同时加入lmol/L的NaOH液来维持PH值，然后立即升温至42°C，并搅拌I小时，再迅速降温至室温，加入3倍体积的-18°C的冷丙酮，经离心收集沉淀物并将其溶于适量蒸馏水中，离心后取上清液，透析后冻干，得到月桂酸-SOD冻干粉。同样按上述文献的方法，将酶活性为1.03 X 104U/mg蛋白的天然SOD冻干粉30克，溶于pH9.0，0.lmol/L的NaCO3缓冲液2500ml中，然后倒入反应釜中，搅拌中加入30ml月桂酰氯，同时加入lmol/L的NaOH液来维持pH值，然后立即升温至42°C，并搅拌I小时，再迅速降温至室温，加入3倍体积的_18°C的冷丙酮，经离心收集沉淀物并将其溶于适量蒸馏水中，离心后取上清液，透析后冻干，得到月桂酸-SOD冻干粉。实施例1和2与对比实验1，均按GB/T 5009.171-2003的第一法，检测SOD冻干粉
的酶活性，检测结果见下表。
权利要求
1.一种修饰天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述天然SOD酶液修饰采用的修饰剂为肉豆蘧酰氯。
2.根据权利要求1所述的修饰天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述天然SOD酶液是采用以下步骤制取的: 将酶活性为6.0 X IO3 1.2 X 104U/mg蛋白的天然SOD冻干粉，溶解于pH9.0,0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中。
3.根据权利要求2所述的修饰天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述天然SOD冻干粉为60 200克。
4.根据权利要求1或2所述的修饰天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述肉豆蘧酰氯为45 150ml，肉豆蘧酰氯浓度为95% 99%。
5.一种制备权利要求1、2或3所述的修饰天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述天然SOD酶液修饰是通过以下步骤完成的: 天然SOD酶液倒入带夹套的反应釜中，搅拌，加热至36 45°C并保持恒温；然后滴加肉豆蘧酰氯，同时滴加2mol/L碱溶液，使酶液的pH值始终维持在9.0左右；恒温反应I小时，其中肉豆蘧酰氯在前30分钟左右滴加完毕；碱溶液的滴加贯穿整个反应过程以维持酶液PH值的稳定；修饰反应完毕后，迅速倒出酶液并冷却至4°C，得到修饰的SOD酶液。
6.根据权利要求5所述的修饰天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述肉豆蘧酰氯和碱溶液滴加是连续缓慢滴加的。
7.一种制备权利要求4所述的修饰天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述天然SOD酶液修饰是通过以下步骤完成的: 天然SOD酶液倒入带夹套的反应釜中，搅拌，加热至36 45°C并保持恒温；然后滴加肉豆蘧酰氯，同时滴加2mol/L碱溶液，使酶液的pH值始终维持在9.0左右；恒温反应I小时，其中肉豆蘧酰氯在前30分钟左右滴加完毕；碱溶液的滴加贯穿整个反应过程以维持酶液PH值的稳定；修饰反应完毕后，迅速倒出酶液并冷却至4°C，得到修饰的SOD酶液。
8.根据权利要求7所述的修饰天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述肉豆蘧酰氯和碱溶液滴加是连续缓慢滴加的。
9.一种后处理上述任一权利要求所述的修饰的SOD酶液的方法，其特征在于:所述后处理包括以下步骤: 修饰SOD酶液冷却后，边搅拌边加入2倍体积的冷丙酮，静置30分钟后离心，收集沉淀，用适量的纯净水溶解，再离心去除沉淀，以除去未反应的肉豆蘧酰氯，收集上清液，超滤浓缩后冷冻干燥，得到肉豆蘧酸-SOD冻干粉。
10.一种肉豆蘧酸-SOD冻干粉，其特征在于:所述肉豆蘧酸-SOD冻干粉是采用上述任一权利要求制备的。
全文摘要
本发明公开了一种修饰天然SOD酶液的方法、后处理修饰的SOD酶液及制备肉豆蔻酸-SOD冻干粉，属于生化领域，所述天然SOD酶液修饰采用的修饰剂为肉豆蔻酰氯。本发明保护的修饰天然SOD酶液的方法直接用肉豆蔻酰氯做修饰剂，省去了活化反应步骤，不仅避免了化学试剂的残留，保证了产品的安全性，而且节约了设备和人力成本，共计可节约3％左右的生产成本。SOD的修饰反应活性损失在5％左右，而以前的修饰方法，SOD活性损失在20％左右，比较下来，减少了15％左右的活性损失。肉豆蔻酸-SOD冻干粉应用于化妆品、保健食品和药品等领域。
文档编号C12N9/02GK103215247SQ20131014821
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者莫宏春 申请人:莫宏春