一种适用马铃薯品种“川芋10号”转基因方法
【专利摘要】本发明提供一种适用马铃薯品种“川芋10号”转基因方法，该方法的特征在于第一天充分培养农杆菌，第二天按一定比例稀释菌液继续培养待OD600=0.3时取出，5000rpm离心3min，弃上清，加入液体MS重悬菌体。在超净工作台中将试管薯放在被少量无菌水浸湿的滤纸上，切成1-2mm厚的薄片（顶端和底部舍去），转移试管薯切片至重悬菌体中浸染5min左右。然后将薯片移至无菌滤纸上吸干水分，接着将薯片平放入共培养基上，在24℃黑暗中共培养2d。共培养后，放入含500mg/L Cef+500mg/L Carb的无菌水中清洗3～4遍，吸干水分后转入芽筛选培养基中。每隔12d左右换1次新鲜的芽筛选培养基。30d之后可见从薯肉中长出的芽，待芽长到2～3cm左右时，剪下接入生根筛选培养基中进行生根。
【专利说明】—种适用马铃薯品种“川芋10号”转基因方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程【技术领域】，特别涉及一种适用马铃薯品种“川芋10号”转基因方法。
【背景技术】
[0002]马铃薯(5b7a/w? tuberosum L.)是世界上继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物，具有产量高、营养丰富、可食用加工等特点。由于马铃薯普通栽培种是同源四倍体，遗传组成的复杂性及遗传背景的狭窄性是制约马铃薯育种发展的主要因素，因此，利用转基因技术进行马铃薯的遗传改良具有重要的意义。王清等通过研究发现通过转基因技术在马铃薯中沉默PPO能降低块茎的褐化，同时可以降低块茎中酚物质的含量。汤莉等通过研究发现转铜锌超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化物酶基因的马铃薯提高了对氧化和盐胁迫的耐性，为培育抗逆性强的马铃薯品种奠定了重要基础。目前进行马铃薯转基因工作的前提是建立高效的转基因体系，本发明的目的在于提供一种适用马铃薯品种“川芋10号”转基因方法，该方法能高效的将外源基因转入马铃薯品种“川芋10号”中。
【发明内容】
[0003]剪取试管苗带1-2叶片茎段插入诱薯培养基中(9株/瓶)，接种好的试管苗在温度为(18±2) °C，光照强度2000 lx、每天8h光/16h暗条件下培养6-8周左右后收获试管薯。诱薯培养基的配方是MS+8%蔗糖+0.8%琼脂+5mg/L CCC +0.5mg/L活性碳，PH值调至 5.8-6.0。
[0004]5mL液体LB中(含50 mg/L卡纳霉素和50 mg/L利福平)，200rpm 28°C培养过夜。第二天按1:200的比例稀释菌液于新鲜的液体LB中，继续培养待0D600=0.Γθ.3时取出备用。
[0005]在超净工作台中将试管薯放在被少量无菌水浸湿的滤纸上，在其上将试管薯块切成l_2mm厚的薄片(顶端和底部舍去)，并转移至水中备用，以防止材料发生栓化。
[0006]取制备好的菌液,5000 rpm离心3min,弃上清,加入液体MS重悬菌体用于浸染。室温下，转移试管薯切片至重悬菌体中浸染5左右。其间不断摇动以利于充分接触。
[0007]侵染结束后将薯片移至无菌滤纸上吸干水分。然后将薯片平放入共培养基上，在24°C，黑暗中共培养2d。共培养基配方是MS+3%蔗糖+0.8%琼脂，PH值调至5.8-6.0。
[0008]共培养后,放入含500 mg/L Cef+500 mg/L Carb的无菌水中清洗3?4遍,吸干水分后转入芽筛选培养基中。芽筛选培养基配方为MS+3%蔗糖+0.8%琼脂+2.5mg/L 6-BA+0.25mg/L IAA +0.25mg/L 2，4_D + 500 mg/L Cef + 500 mg/L Carb，PH值调至 5.8-6.0。
[0009]每隔12d左右换I次新鲜的芽筛选培养基。在最初I个月中，去除从块茎薄片边缘再生的芽。因为这些最初的芽大部分都是从芽眼长出而不是再生的转基因芽，基本为假阳性。30d之后可将从薯肉上长出的芽，待芽长到2?3cm左右时，剪下接入生根筛选培养基中。
[0010]生根培养基的配方是 MS+3%蔗糖+0.8%琼脂+0.25mg/L IAA +500 mg/L Cef+500mg/L Carb最终获得马铃薯转基因植株。通过PCR检测，得到转基因株系的阳性率达到80%以上。
【权利要求】
1.将挑取含有目的基因的农杆菌单菌落接种至5mL液体LB中(含50mg/L卡纳霉素和50 mg/L利福平)，200rpm 28°C培养过夜，二天按1:200的比例稀释菌液于新鲜的液体LB中，继续培养待0D600=0.1-0.3时取出备用。
2.在超净工作台中将试管薯放在被少量无菌水浸湿的滤纸上，在其上将试管薯块切成l-2mm厚的薄片(顶端和底部舍去)，并转移至水中备用，以防止材料发生栓化。
3.取制备好的菌液，5000rpm离心3min，弃上清，加入液体MS重悬菌体用于浸染，室温下，转移试管薯切片至重悬菌体中浸染5min左右，其间不断摇动以利于充分接触。
4.侵染结束后将薯片移至无菌滤纸上吸干水分，然后将薯片平放入共培养基上，在24°C，黑暗中共培养2d，共培养基配方是MS+3%蔗糖+0.8%琼脂，PH值调至5.8-6.0。
5.共培养后,放入含500mg/L Cef+500 mg/L Carb的无菌水中清洗3_4遍,吸干水分后转入芽筛选培养基中，芽筛选培养基配方为MS+3%蔗糖+0.8%琼脂+2.5mg/L 6-BA+0.25mg/L IAA +0.25mg/L 2，4_D + 500 mg/L Cef + 500 mg/L Carb，PH 值调至5.8~6.00
6.每隔12d左右换I次新鲜的芽筛选培养基，在最初一段时间，去除从块茎薄片边缘再生的芽，30d之后可将从薯肉上长出的芽，待芽长到2-3cm左右时，剪下接入生根筛选培养基中。
7.生根培养基的配方是MS+3%蔗糖+0.8%琼脂+0.25mg/L IAA +500 mg/L Cef+500mg/L Carb最终获得马铃薯转基因植株，通过PCR检测，得到转基因株系的阳性率达到80%以上。
【文档编号】C12N15/82GK104293825SQ201310303556
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月19日 优先权日:2013年7月19日
【发明者】李立芹, 王西瑶, 鲁黎明, 倪苏, 刘帆, 杨先泉, 曾富春, 彭茂林 申请人:四川农业大学