赖氨酸、纤维素酶的发酵及包被饲料的制作方法
【专利摘要】本发明涉及赖氨酸、纤维素酶的发酵及包被饲料，提供了发酵制备L-赖氨酸制品的方法，其包括发酵产生L-赖氨酸发酵液，可以与可发酵获得的耐高温脱水的纤维素酶混合，高温干燥后用脂肪包被。另外，本发明还提供了所述方法生产的产品以及耐高温脱水的纤维素酶等。
【专利说明】赖氨酸、纤维素酶的发酵及包被饲料
【技术领域】
[0001]本发明属于氨基酸的发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵制备L-赖氨酸制品的方法，其包括发酵产生L-赖氨酸发酵液，该发酵液可以与可发酵获得的耐高温脱水的纤维素酶混合，高温干燥后用脂肪包被。另外，本发明还提供了所述方法生产的产品以及耐高温脱水的纤维素酶等。
【背景技术】
[0002]纤维素酶能够有效降解含纤维素的物质(如，饲料)，因此在饲料中添加纤维素酶能够增强饲料的吸收利用率，从而节约饲养成本。例如，中国专利96196760.9公开了反刍动物饲料的酶添加物，其包含纤维素酶。
[0003]L-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工业中。当前，L-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。
[0004]然而，当赖氨酸作为饲料的时候，由于其属于小分子营养物质，很快就能释放到动物体内，尤其在大量摄取时，影响了动物吸收利用的效率。通常解决的方法是少量多次地喂食动物，但是这将增加动物饲养的工作量。因此，本发明提出了直接用赖氨酸发酵培养液制备包被的赖氨酸制品的方法，可以有效减缓赖氨酸在动物体内释放的速度。
[0005]常规地，包被的赖氨酸制品可以和含纤维素酶的酶添加剂在喂饲时一起混合入动物饲料中。这样使用中比较麻烦，而且容易混合不均匀，相应利用率降低。
[0006]本发明人设想，在制备包被的赖氨酸制品的过程中将纤维素酶与赖氨酸发酵培养液直接混合，可以混合地很均匀，然后进行包被，然而却发现受制于包被中要经历的高温以及干燥过程，常规的酶活性将极大地削弱，甚至完全丧失。令人意外地，本发明人发现了一株耐热且耐旱的霉菌菌株，经过艰苦深入细致的研究，其中分离的纤维素酶经历高温干燥后仍旧能够保持高纤维素酶活性，因此适于在其中方便地使用，减少了喂饲时使用的麻烦。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵制备L-赖氨酸制品的方法，其包括发酵产生L-赖氨酸发酵液，该发酵液可以与可发酵获得的耐高温脱水的纤维素酶混合，高温干燥后用脂肪包被。另外，本发明还提供了所述方法生产的产品以及其中所用的物质等。
[0008]具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵制备L-赖氨酸制品的方法，包括，发酵产生L-赖氨酸发酵液，该发酵液可以与耐高温脱水的纤维素酶混合，经高温干燥后收集的颗粒用脂肪包被。因此，本发明第一方面的方法发酵制备的L-赖氨酸制品分两层，外层包裹内层，其中外层是脂肪，而内层含有L-赖氨酸和耐高温脱水的纤维素酶。该L-赖氨酸制品能够减缓赖氨酸在动物体内释放的速度，而且能够具有纤维素酶活性。该制品优选是饲料添加剂。
[0009]更具体地，在第一方面，本发明提供了发酵制备L-赖氨酸制品的方法，其包括: (1)在发酵条件下培养导入了编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸的产L-赖氨酸的菌，获得发酵液，过滤后保留滤液；
(2)在发酵条件下培养导入了编码耐高温脱水的纤维素酶的多核苷酸的分泌表达菌，过滤后保留上清液；
(3)混合步骤(I)获得的滤液和步骤(2)获得的上清液，得到混合液；
(4)对步骤(3)获得的混合液高温喷雾干燥，并任选进行筛分和/或破碎，收集颗粒；和
(5)将步骤(4)收集的颗粒用脂肪包被。
[0010]脂肪包被颗粒可以通过流化制粒包衣机将熔化的脂肪喷涂在颗粒表面上来实现，因此优选脂肪是室温状态下为固态而熔点略高于室温(如，45-80°C，优选50-65°C)的脂肪。优选在本发明第一方面的方法中，脂肪优选是分馏棕榈脂肪，更优选是百佳能(BergaFat)，其可以通过商业途径方便地获取。在本发明的【具体实施方式】中，包被所用的脂肪是百佳能HTL316。
[0011]本发明人发现，脂肪层包被(喷涂)得越厚，制备得到的L-赖氨酸制品的抗降解能力越强。优选在本发明第一方面的方法中，在步骤(5)中，步骤(4)获得的颗粒和脂肪的重量比为2?8:8?2，优选为3?7:7?3，更优选为5?6.5:5?3.5。
[0012]在步骤(4)中，对于其中干燥得到的粒径分布不均匀，可以进行筛分，收集一定粒径范围的颗粒；和/或对于干燥和/或筛分得到的粒径较大的颗粒，可以进行粉碎，然后继续进行筛分，收集一定粒径范围的颗粒。优选在本发明第一方面的方法中，收集的颗粒的粒径小于0.8mm,优选小于0.5mm。大于0.5mm的颗粒。另外优选在本发明第一方面的方法中，高温喷雾干燥可以在流化床干燥机内进行。为了使最终颗粒的形状更为均匀，流化床干燥机内尾气温度不宜过高，通常不高于100°C，优选不高于85°C，更优选保持在80±3°C。因此，优选在本发明第一方面的方法中，步骤(4)中，高温为60-100°C，优选为65-90°C，更优选为75-85。。。
[0013]赖氨酸作为小分子化合物，高温脱水干燥对其不会产生过多不利影响；而纤维素酶作为大分子蛋白质，经高温和/或脱水，有可能使其降解和/或变性，从而导致其酶活性的显著降低或丧失，无法起到相应作用。因此本发明可以采用了耐高温脱水的纤维素酶，其中高温为60-100°C，优选为65-90°C，更优选为75-85°C。
[0014]优选在作为饲料添加剂使用时，由于纤维素酶的需要量少于赖氨酸的，因此本发明第一方面的方法发酵制备的L-赖氨酸制品中优选赖氨酸含量高，而同时纤维素酶含量低，可以低至满足饲料所需纤维素酶的活性。优选在本发明第一方面的方法中，步骤(I)获得的滤液和步骤(2)获得的上清液的体积比为10:0.01-10，优选为10:0.1-5，更优选为10:0.5?2。
[0015]多核苷酸可以通过各种本领域技术人员所熟知的方式被导入菌中，使该菌表达所述多核苷酸编码的酶，如吡啶核苷酸转氢酶和/或纤维素酶。所述多核苷酸可以直接被导入，例如利用微粒体、基因枪等导入细胞；也可以间接被导入，例如可以通过构建在质粒载体上导入细胞。导入的所述多核苷酸可以整合在细胞的基因组上表达，也可以游离表达。优选本发明第一方面的方法中，编码酶的多核苷酸可以利用穿梭质粒导入菌中，如编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸可以利用大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒导入产L-赖氨酸的菌(如棒状杆菌)中，又如编码纤维素酶的多核苷酸可以利用大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒导入分泌表达菌(如毕氏酵母)中。
[0016]吡啶核苷酸转氢酶是吡啶核苷酸转氢酶是野生型吡啶核苷酸转氢酶或其变体。野生型吡啶核苷酸转氢酶是本领域技术人员所知晓的，其包括α亚基和β亚基，其中α亚基和β亚基的序列分别如NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)蛋白和基因登录号NP416120.1和AAC74674.1所示。优选的变体可以是中国专利201110065683.5所公开的吡啶核苷酸转氢酶变体，在实际生产中增加了赖氨酸的产量(也可参见中国专利201110151495.4)，其包括α亚基变体和β亚基变体，其中α亚基变体相对于野生型α亚基在Μ102、L127或Q322的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换是M102L、L127R和Q322K ； β亚基变体相对于野生型β亚基在Α398或D400的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换是A398S和D400H。在本发明的【具体实施方式】中，采用吡啶核苷酸转氢酶变体，其是由如SEQ ID Νο:5所示的核苷酸序列编码的。
[0017]本发明第一方面的方法中，耐高温脱水的纤维素酶优选是本发明人令人意外地发现的菌株产生的纤维素酶，该纤维素酶与现有已知的纤维素酶同源性很低，而且具有耐高温脱水的优势，经证实即使被高温蒸发干燥后，仍旧能保留90%以上的酶活性，从而使得本发明第一方面的方法能够得以顺利实施。优选本发明第一方面的方法中，耐高温脱水的纤维素酶的氨基酸序列:
(1)如SEQ ID Νο:2 所示;或
(2)是对SEQID No:2缺失、添加和/或取代一个或几个(优选不超过7个，更优选不超过5个，如不超过3个)氨基酸残基而获得的保留SEQ ID Νο:2活性的序列。本领域技术人员通过重组DNA技术，能够制备出经缺失、添加和/或取代氨基酸残基而获得的变体蛋白。在本发明的【具体实施方式】中，纤维素酶是由如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列编码的。
[0018]在步骤(2)中，过滤除去菌体而保留上清液，其中优选使用0.22 μ m滤膜进行过滤。上清液可以提纯和/或浓缩，也可以直接用于本发明第一方面的方法中，优选是后者。
[0019]优选本发明第一方面的方法中，在步骤(2)中，上清液的纤维素酶活性不小于1000IU/L，优选不小于5000IU/L，更优选不小于8000IU/L，例如不小于12000IU/L。本发明的耐高温脱水的纤维素酶经高温脱水干燥，仍旧能基本保留原酶活性。优选的步骤(2)中的在发酵条件下培养的方法包括:
(i)将分泌表达耐高温脱水的纤维素酶的菌(如，酵母菌)接入液体培养基中，于28-33 °C 培养至 0D600 达到 3.0-8.0 ；
(ii )将步骤(i )获得的培养液以3-7%(体积)的接种量接种于液体培养基中，于28-33°C培养20-28小时；
(iii)将甲醇以0.3-0.7% (体积)的接入量加入步骤(ii)获得的培养液中，诱导培养3-8天，期间每24小时补加0.3-0.7% (体积)接入量的甲醇，通气控制溶氧大于20%，并控制 pH 为 5.8-6.4。
[0020]在本文中，接种量或接入量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以体积百分比表示的时候，指的是菌体培养液(接入的菌液)或接入的其他液体体积相对于被接入的培养基体积的百分比量。
[0021]其中，液体培养基是能使分泌表达耐高温脱水的纤维素酶的菌(如，酵母菌)生长的液体培养剂。步骤(i)和步骤(ii)中的液体培养基可以是相同的，也可以使不同，优选是相同的，如可以是BMGY液体培养基，其配方为IOOmM磷酸钾缓冲液(pH6.0)中，含1% (重量)酵母提取物、2% (重量)蛋白胨,酵母含氮碱基1.34% (重量)，生物素4*10-5% (重量)，葡萄糖2% (重量)，甘油1% (体积)。
[0022]在步骤(I)中，过滤除去菌体而保留滤液，其中优选使用超滤膜进行过滤。滤液可以提纯和/或浓缩，也可以直接用于本发明第一方面的方法中，优选是后者。
[0023]优选本发明第一方面的方法中，在步骤(I)中，滤液中L-赖氨酸的含量高于50g/L，优选高于70g/L，更优选高于90g/L。这可以利用许多现有技术来实现，包括菌种的改良和/或发酵流程的改良。示例性的步骤(I)中的在发酵条件下培养的方法包括:
Ca)将产L-赖氨酸的菌接入第一发酵罐于31-38°C培养10-20小时；
(b)将步骤(a)获得的培养液以3-7%(体积)的接种量接种于第二发酵罐，于36-40°C培养3-8小时；
(c)向第二发酵罐持续流加糖，其中糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.2-0.35% (重量)，进行10-18小时；
Cd)向第二发酵罐持续流加 糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.3-0.5%(重量),而且氮源的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.1-0.25%(重量)，进行30-65小时，优选50-55小时。
[0024]在本文中，“第一”和“第二”在修饰发酵罐的时候，是为了区分所修饰的发酵罐，SP第一发酵罐和第二发酵罐是不同的。其中，优选第一发酵罐中的培养基配方为:每18立方米培养基中含，葡萄糖500-750公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米浆400-600公斤，KH2PO430-80 公斤，MgSO4.7Η20 3-15 公斤，FeSO4.7Η20 0.1-1 公斤，MnSO4.7Η20 0.1-1 公斤，生物素5-30克，和叶酸3-10克，和/或，优选第二发酵罐的培养基配方为:每315立方米培养基中含，葡萄糖10000-15000公斤，甘蔗糖蜜50-3000公斤，玉米浆10000-15000公斤，KH2PO4700-1200 公斤，MgSO4.7Η20 5-220 公斤，FeSO4.7Η20 5-25 公斤，MnSO4.7Η20 5-220 公斤，生物素150-300克，和叶酸50-120克。
[0025]步骤(C)和(d)的部分培养条件(如，温度，pH等)与步骤(b)的可以相同，也可以不同。步骤(b)中，不进行流加操作；而在步骤(c)和(d)中，pH维持在6.5至7.8之间，这可以简单地通过流加碱或酸来实现。
[0026]在本文中，流加量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以重量百分比表示的时候，指的是加入物质的重量占被加入物质(如，培养液)的重量的百分比量。优选步骤(c)和(d)中的糖是葡萄糖。在步骤(c)中，葡萄糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.2-0.35% (重量)，优选为0.27-0.33% (重量)。在步骤(d)中，葡萄糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.3-0.5% (重量)，优选为0.42-0.48% (重量)。
[0027]优选步骤(d)中的氮源是无机氮源，优选是硫酸氨或氯化铵，如硫酸氨。在步骤(d)中，硫酸氨的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.1-0.25% (重量)，优选为
0.17-0.23% (重量)。
[0028]在第二方面，本发明提供了 L-赖氨酸制品(如，饲料添加剂)，其包括用脂肪包裹的颗粒，其中颗粒包含L-赖氨酸和耐高温脱水的纤维素酶，优选耐高温脱水的纤维素酶是本发明人令人意外地发现的菌株产生的纤维素酶。优选在本发明第二方面的制品是由本发明第一方面的方法发酵制备的。[0029]在第三方面，本发明提供了耐高温脱水的纤维素酶或其编码基因、其载体、菌种。具体而言，本发明:
在第I方面提供了耐高温脱水的纤维素酶，其氨基酸序列:
(1)如SEQ ID No:2 所示;或
(2)是对SEQID No:2缺失、添加和/或取代一个或几个(优选不超过7个，更优选不超过5个，如不超过3个)氨基酸残基而获得的保留SEQ ID No:2活性的序列。
[0030]在第II方面提供了编码第I方面的纤维素酶的基因，优选其核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示。
[0031]在第III方面提供了包含第II方面的基因的载体。
[0032]在第IV方面提供了菌种，尤其是分泌表达菌(如，酵母)，其包含第II方面的基因，或用第III方面的载体转化或者转染。
[0033]在第V方面提供了发酵生产纤维素酶的方法，其包括在发酵条件下培养第IV方面的菌种，从培养物中分离出第I方面的纤维素酶。
[0034]在第VI方面提供了第I方面的纤维素酶在制备饲料或饲料添加剂中的用途。
[0035]本发明具有以下有益效果:本发明的制品安全可靠，可有效降低动物体内赖氨酸的释放速度，具有纤维素酶活性，可以进一步提高饲料的利用率；本发明的纤维素酶具有耐高温脱水的优势。
[0036]为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
[0037]另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复而明确记载过一样。
[0038]
【具体实施方式】
[0039]以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。
[0040]实施例1耐热且耐失水的纤维素酶基因的表达构建体的制备
根据我们发现的菌株，委托中国科学院微生物研究所，进行序列分析，发现了新的纤维素酶基因，其核苷酸序列如序列表的SEQ ID No:l所示，所编码的纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。然后，根据《分子克隆实验指南》以及所用商品化试剂的操作指南构建分泌表达的酵母，简而言之，即将编码该纤维素酶的基因用正向引物如序列表的SEQ ID No:3所示(引入了 EcoR I内切酶位点)、反向引物如序列表的SEQ ID No:4所示(引入了 Not I内切酶位点)扩增后用EcoR I和Not I双酶切，并与经这两个内切酶酶切的pPIC3.5质粒(可购自Invitrogen公司)用T4 DNA连接酶进行连接，转化入大肠杆菌DH5 α中。挑出阳性克隆，抽提出其中的质粒，经测序验证正确后，将阳性质粒用Sal I酶切线性化后，通过电转化法转化入毕氏酵母GS115株，在含G418的平板上挑出阳性酵母转化株，寄回。[0041]实施例2耐热且耐失水的纤维素酶的发酵制备及活性测定
将实施例1获得的阳性酵母转化株接种到50ml BMGY液体培养基(IOOmM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，其中含1%酵母提取物、2%蛋白胨，酵母含氮碱基1.34%，生物素4*10_5%，葡萄糖2%，甘油1%)中，于30°C、200rpm培养至0D600达到5.0。
[0042]将上述培养物转接到IL BMGY液体培养基中，于30°C、200rpm培养24小时，加入5ml甲醇,然后继续于30°C、200rpm培养6天,期间每24小时补加5ml甲醇,通气控制溶氧(DO)大于20%，并控制pH为6.0 (用氨水调节)。培养完成后，用0.22 μ m滤膜过滤并保留上清液，该上清液经SDS-PAGE检测其中富含纤维素酶对应的蛋白质，由此发酵得到纤维素酶上清液。
[0043]取新鲜的上清液，分成三份，一份冷藏加盐酸调节pH至4.8待用(A)，一份冷冻干燥至固体后用柠檬酸缓冲液(PH4.8)重新溶解(B)，一份于80°C烘箱中蒸发干燥至固体后用柠檬酸缓冲液(PH4.8)重新溶解(C);对照采用3万U/g规格的市售纤维素酶(可购自湖北兴银河化工有限公司)，用柠檬酸缓冲液(PH4.8)溶解后分成三份，一份冷藏待用(CA)，另两份分别冷冻干燥(CB)和80°C烘箱蒸发干燥(CC)，然后重溶于柠檬酸缓冲液(pH4.8)。分别测定这些纤维素酶活性，换算成原单位体积上清液或单位重量的酶活，计算由于高温脱水造成的酶活损失率，结果如表I所示，表明相对于市售产品几乎丧失了酶活的情况，本发明的纤维素酶耐高温脱水，即便经过高温脱水，仍旧能够保留93%左右的活性，基本保留原酶活功能。
[0044]表I本发明和市售的纤维素酶的高温脱水酶活损失率
【权利要求】
1.发酵制备L-赖氨酸制品的方法，包括，发酵产生L-赖氨酸发酵液，该发酵液与耐高温脱水的纤维素酶混合，经高温干燥后收集的颗粒用脂肪包被。
2.权利要求1所述的方法，其包括: (1)在发酵条件下培养导入了编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸的产L-赖氨酸的菌，获得发酵液，过滤后保留滤液； (2)在发酵条件下培养导入了编码耐高温脱水的纤维素酶的多核苷酸的分泌表达菌，过滤后保留上清液； (3)混合步骤(I)获得的滤液和步骤(2)获得的上清液，得到混合液； (4)对步骤(3)获得的混合液高温喷雾干燥，并任选进行筛分和/或破碎，收集颗粒；和 (5)将步骤(4)收集的颗粒用脂肪包被。
3.权利要求1或2所述的方法，其中收集的颗粒和脂肪的重量比为2-8:8-2，优选为3-7:7-3，更优选为5-6.5:5-3.5 ;和/或，脂肪是分馏棕榈脂肪，更优选是百佳能，最优选是百佳能HTL316 ;和/或，高温为60-100°C，优选为65_90°C，更优选为75_85°C ;和/或，收集的颗粒的粒径小于0.8mm,优选小于0.5mm。
4.权利要求2所述的方法，其中步骤(3)中，步骤(I)获得的滤液和步骤(2)获得的上清液的体积比为10:0.01-10，优选为10:0.1-5，更优选为10:0.5?2。
5.权利要求1或2所述的方法，其中耐高温脱水的纤维素酶的氨基酸序列: (1)如SEQ ID No:2 所示;或 (2)是对SEQID No:2缺失、添加和/或取代一个或几个(优选不超过7个，更优选不超过5个，如不超过3个)氨基酸残基而获得的保留SEQ ID No:2活性的序列。
6.权利要求2所述的方法，其中步骤(I)中，滤液中L-赖氨酸的含量高于50g/L，优选高于70g/L,更优选高于90g/L。
7.权利要求1或2所述的方法，其中制品是饲料添加剂。
8.制品，优选是饲料添加剂，其包括用脂肪包裹的颗粒，其中颗粒包含L-赖氨酸和耐高温脱水的纤维素酶，优选其是由权利要求1-8之任一所述的方法制备的。
9.耐高温脱水的纤维素酶，其氨基酸序列: (1)如SEQ ID No:2 所示;或 (2)是对SEQID No:2缺失、添加和/或取代一个或几个(优选不超过7个，更优选不超过5个，如不超过3个)氨基酸残基而获得的保留SEQ ID No:2活性的序列。
10.本发明的第I1、II1、IV、V或VI方面。
【文档编号】C12N9/42GK103444983SQ201310403722
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年6月7日 优先权日:2012年6月7日
【发明者】马吉银, 陈崇安, 孟刚, 曹洪, 程耀东, 刘鑫 申请人:宁夏伊品生物科技股份有限公司