啤酒花品种的识别方法

啤酒花品种的识别方法
【专利摘要】本发明涉及利用由品种间不同的至少一个单核苷酸多态性构成的识别标记的用于识别啤酒花品种的方法以及该识别标记的制备方法。本发明还提供用于该识别啤酒花品种的方法中使用的引物或探针及包含该识别标记的区域的核酸。本发明进一步提供检测啤酒花试样中不同品种混入的方法。
【专利说明】啤酒花品种的识别方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用了由品种间不同的至少一个单核苷酸多态性构成的识别标记的 用于识别啤酒花品种的方法以及该识别标记的制备方法。

【背景技术】
[0002] 啤酒花（学名：Humulus lupulus)为属于大麻科的雌雄异株的蔓性（攀援）植物。 雌株具有称为"球花"的像松果形的花的结构，该球花为啤酒的原料。未受精的球花中，有 称为蛇麻素的黄色颗粒，其为啤酒独特的香味、清爽苦味的来源。啤酒花具有赋予啤酒略带 苦味、爽快的香味、提高泡持性、使啤酒的光泽（色泽）良好、抑制杂菌繁殖的作用，是啤酒 酿造中不可缺少的原料之一。
[0003] 啤酒花在以德国、美国为首的捷克、英国、法国、中国、斯洛文尼亚、南非、澳大利 亚、新西兰、日本等国栽培，其栽培品种也多种多样。啤酒花品种中有香型啤酒花和苦型啤 酒花。香型啤酒花为赋予芬芳香味和温和苦味的啤酒花，苦型啤酒花为赋予具有收敛性的 苦味的啤酒花。如此，啤酒花因各品种的香味、味道不同，所以在酿造高品质的啤酒时，筛选 符合目的的啤酒花品种非常重要。而且，为了稳定维持其品质，准确检查所订购的原料啤酒 花是否能正确进货非常重要。至今为止，根据供货商所提供的品质保证书、蛇麻素中所含有 的α酸等成分含量的不同、球花外观上的差异进行确认。但是，在日本，通常是购入将啤酒 花的球花干燥、粉碎、压缩整形制成颗粒状的啤酒花来用于啤酒酿造。因此，很难从球花外 观上的特征来识别品种。此外，从球花中得到的苦味成分、精油成分等的化学成分也易受环 境因素的影响，还有因品种关系而显示近似值的啤酒花等，所以作为识别的指标具有局限 性。
[0004] 另一方面，近年来，开发了一些应用基因工程的品种识别方法。这些方法通过检 测品种间碱基序列的不同，即检测多态性来进行品种识别。啤酒花中，国际公开公报（W0 1997/005281)中公开了以下方法，通过RAPD(随机扩增多态性DNA)法寻找品种间不同的 DNA区域，设计可扩增该区域的引物，通过使用该引物的PCR来扩增多态性区域，通过分析 扩增片段的有无或其大小的差异来识别啤酒花品种，此外，日本特开平11 一 103895公报中 公开了以下方法，通过使用高浓度的氯化锂，从啤酒花中高效提取?纯化适合PCR的基因 组DNA，相对于该基因组DNA使用随机引物、STS (序列标签位点）标记的引物等的引物进行 PCR，扩增可识别啤酒花品种的DNA，通过扩增DNA的有无来判别啤酒花品种，而且，日本特 开2006 - 34142公报中还公开了以下方法，通过使用设计成可扩增包含品种间多态性的微 卫星区域的引物来进行PCR，扩增微卫星DNA，通过分析扩增DNA片段长度的差异来识别品 种。
[0005] 通过利用啤酒花基因组上的多态性来识别啤酒花品种的上述方法虽不受啤酒花 的栽培环境、收获时期或保存方法的影响，为可准确识别啤酒花品种的有效手段，但因这些 方法均需从PCR扩增的有无或大小的差异来进行识别，所以易受酶反应、电泳、凝胶染色等 条件不统一的影响，在再现性上存在问题。即难于区别是因 PCR、染色的不良好而未出现条 带，或还是因为原本就未扩增，所以，具有错误判断结果的危险性。此外，上述方法因是通过 毛细管电泳及激光的DNA片段检测、通过凝胶电泳的试样染色的检测等，所以，即使可特定 作为被测物的啤酒花品种、甚至可推测有无不同品种混入，但还是难于推断或特定混入品 种、分析混入品种的混入比例。而且，由于被测物的劣化、损伤等使DNA发生碎片化时，会降 低分析精度，有错误判断结果的危险性。
[0006] 作为极为有用且容易利用的多态性标记，单核苷酸多态性（以下也称为"SNP"。） 受人注目。SNP(single nucleotide polymorphism)是基于1个碱基的不同的碱基序列的 多态性。因 SNP不受反应条件不统一的影响，所以，无疑似结果，易判断，且SNP数据可转换 为（〇，1)的数字信号来进行信息处理，所以，容易进行样品处理和数据分析的自动化，可使 用庞大的SNP数据进行各种各样的分析。此外，用设计具有各种各样长度的非特异性Tail 的引物等的方法，可一次性进行大量的SNP分析。
[0007] 但是，啤酒花具有二倍体的20条（双链为10对）染色体，基因组大小为约27? 30亿碱基对（2.7?3GB)，非常庞大，与结构基因的关联性尚不明确。因此，还未实施过从 基因组分析的结果中找出可进行多品种识别程度的充分数量的啤酒花品种间SNP的工作， 至今为止，将SNP用作多态性标记的啤酒花品种的识别方法还不为人所知。
[0008] 现有技术文献
[0009] 专利文献
[0010] 专利文献1国际公开公报第W01997/005281号公报
[0011] 专利文献2日本特开平11 一 103895号公报
[0012] 专利文献3日本特开2006 - 34142号公报


【发明内容】

[0013] 本发明提供利用由品种间的单核苷酸多态性组成的识别标记的用于识别啤酒花 品种的方法以及该识别标记的制备方法。
[0014] 强烈希望开发出如下啤酒花品种的识别方法，即在确认订购的原料啤酒花是否为 所订货的品种且是否混入了不同品种时，可不受酶反应、电泳、凝胶染色等的条件不统一的 影响而准确特定品种，检测有无不同品种混入，不仅如此，在不同品种混入时，还可推断或 特定混入品种，可分析其混入比例。
[0015] 本
【发明者】为解决上述课题，对基于DNA分析的啤酒花品种的识别方法进行了深入 研究。对于DNA分析，至今为止已报道了 SSR(简单重复序列）法、RAPD(随机扩增多态性 DNA)法、RFLP(限制性片段长度多态性）法、AFLP(扩增片段长度多态性）法等、基于PCR 扩增产物、其限制性内切酶片段的大小的不同、有无的方法。但是，这些方法大多操作繁杂， 且易受酶反应、电泳、凝胶染色等的条件不统一的影响，再现性令人担心，而且在其他品种 混入时其检测大多较为困难。我们在近年来使用发达的超高速DNA序列分析技术获得大量 的数据，更加广泛且高效地搜索SNP，将这些作为识别标记，开发出了准确且简便地进行啤 酒花品种识别的方法。
[0016] 即方式之一中，本发明可以为以下内容。
[0017] (1) 一种方法，其为啤酒花品种的识别方法，其特征在于，所述方法包含以下工 序：
[0018] ⑴扩增来自被测物啤酒花的DNA中的包含品种识别区域的DNA片段的工序，该品 种识别区域包含由啤酒花品种间不同的至少一个单核苷酸多态性（SNP)构成的识别标记；
[0019] (ii)鉴定上述工序（i)中扩增的DNA片段中的单核苷酸多态性的基因型的工序；
[0020] (iii)将上述工序（ii)所鉴定的被测物啤酒花DNA中的品种识别区域中的单核苷 酸多态性的基因型与已知啤酒花品种DNA所对应的区域中的单核苷酸多态性的基因型进 行对比，分析该区域中的单核苷酸多态性的基因型在被测物啤酒花和已知啤酒花品种之间 为一致或不一致的工序；
[0021] (iv)根据上述工序（iii)的分析结果，特定被测物啤酒花品种的工序。
[0022] (2)根据⑴中所述的方法，其特征在于，工序（ii)如下进行，鉴定工序⑴中扩 增的DNA片段中的品种识别区域的碱基序列，且
[0023] 工序（iii)如下进行，将工序（ii)所鉴定的被测物啤酒花DNA中的品种识别区域 的碱基序列与已知啤酒花品种DNA所对应的区域的碱基序列进行对比，分析该区域中的识 别标记在被测物啤酒花和已知啤酒花品种之间为一致或不一致。
[0024] (3)根据⑴中所述的方法，其特征在于，工序（ii)为如下工序，通过使工序⑴ 中扩增的DNA片段与检测啤酒花品种间不同的单核苷酸多态性的探针及/或引物接触，而 鉴定单核苷酸多态性的基因型。
[0025] (4)根据⑴?⑶中任一项所述的方法，其特征在于，品种识别区域为包含通过 包含以下工序的方法而制备的识别标记的区域：
[0026] (a)使用2个以上不同品种的啤酒花，进行转录组分析的工序；
[0027] (b)基于由上述工序（a)的结果得到的DNA片段的碱基序列，对各品种进行组装的 工序；
[0028] (C)将由上述工序（b)的结果得到的重叠群及/或单拷贝进行品种间对比，进行品 种间不同的单核苷酸多态性（SNP)的搜索的工序；
[0029] (d)根据上述工序（c)的SNP搜索的结果，选择包含SNP的区域，设计用于扩增该 区域的引物的工序；
[0030] (e)通过使用上述工序（d)中设计的引物，以从啤酒花中提取的DNA为模板，确认 上述工序（d)中选择的区域可扩增，确定该碱基序列，从而确定识别区域和可扩增该识别 区域的引物的工序；
[0031] (f)使用上述工序（e)中确定的引物，以从识别对象品种的啤酒花中提取的DNA为 模板扩增识别区域，确定识别区域的碱基序列的工序；及
[0032] (g)将上述工序（f)中确定的识别区域的碱基序列进行品种间对比，确定由用于 识别识别对象品种所必需的SNP的组合构成的识别标记的工序。
[0033] (5)根据⑴?⑶中任一项所述的方法，其特征在于，品种识别区域为包含选自 序列号9、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14及序列号15中的1个以上 的碱基序列的一部分或全部，且还包含图1、图2、图3、图4及图6中特定的单核苷酸多态性 或插入缺失部分的至少一个的区域。
[0034] (6)根据⑴?⑶中任一项所述的方法，其特征在于，品种识别区域为选自包含 序列号9表不的喊基序列的区域、包含序列号10表不的喊基序列的区域、包含序列号11表 不的喊基序列的区域、包含序列号12表不的喊基序列的区域、包含序列号13表不的喊基序 列的区域、包含序列号14表示的碱基序列的区域及包含序列号15表示的碱基序列的区域 中的1个以上的区域。
[0035] (7)根据⑴?⑶中任一项所述的方法，其特征在于，品种识别区域为不仅包含 以下：包含序列号9表不的喊基序列的区域、包含序列号10表不的喊基序列的区域，及包含 序列号11表示的碱基序列的区域的3种区域，且包含以下：序列号12及/或序列号14表 示的碱基序列的一部分或全部，且还包含图4中特定的单核苷酸多态性或插入缺失部分的 至少1个的区域。
[0036] (8)根据⑴?⑶中任一项所述的方法，其特征在于，工序⑴通过使用以下引 物对的PCR反应来进行，为选自序列号1及序列号2的组合、序列号3及序列号4的组合、 序列号5及序列号6的组合及序列号7及序列号8的组合的引物对。
[0037] (9)根据⑴?⑶中任一项所述的方法，其特征在于，工序⑴通过使用以下引 物对的PCR反应来进行：不仅为以下：序列号1及序列号2的组合、序列号3及序列号4的 组合以及序列号5及序列号6的组合的3种引物对，还为序列号7及序列号8的组合的引 物对。
[0038] (10) -种方法，其为由啤酒花品种间不同的单核苷酸多态性的组合构成的识别标 记的制备方法，其特征在于，所述方法包含以下工序：
[0039] (a)使用2个以上不同品种的啤酒花，进行转录组分析的工序；
[0040] (b)基于由上述工序（a)的结果得到的DNA片段的碱基序列，对各品种进行组装的 工序；
[0041] (C)将由上述工序（b)的结果得到的重叠群及/或单拷贝进行品种间对比，进行品 种间不同的单核苷酸多态性（SNP)的搜索的工序；
[0042] (d)根据上述工序（c)的SNP搜索的结果，选择包含SNP的区域，设计用于扩增该 区域的引物的工序；
[0043] (e)通过使用上述工序（d)中设计的引物，以从啤酒花中提取的DNA为模板，确认 上述工序（d)中选择的区域可扩增，确定该碱基序列，从而确定识别区域和可扩增该识别 区域的引物的工序；
[0044] (f)使用上述工序（e)中确定的引物，以从识别对象品种的啤酒花中提取的DNA为 模板扩增识别区域，确定识别区域的碱基序列的工序；及
[0045] (g)将上述工序（f)中确定的识别区域的碱基序列进行品种间对比，确定由用于 识别识别对象品种所必需的SNP的组合构成的识别标记的工序。
[0046] (11) -种核酸，其特征在于，包含通过（10)中所述的方法制备的识别标记的至少 一部分。
[0047] (12) -种核酸，其特征在于，该核酸包含啤酒花的品种识别区域，而且，包含选自 序列号9、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14及序列号15中的1个以上 的碱基序列的一部分或全部，且还包含图1、图2、图3、图4及图6中特定的单核苷酸多态性 或插入缺失部分的至少一个。
[0048] (13) -种引物，其特征在于，设计为可扩增（11)或（12)中所述的核酸。
[0049] (14) 一种引物，其特征在于，由序列号1?8中任一个所记载的碱基序列组成，在 此，该引物用于啤酒花的品种识别。
[0050] (15) -种探针，其特征在于，用于检测通过（10)中所述的方法鉴定的品种识别区 域中的啤酒花品种间不同的单核苷酸多态性。
[0051] (16) -种探针，其特征在于，可在选自序列号9、序列号10、序列号11、序列号12、 序列号13、序列号14及序列号15中的1个以上的碱基序列中，检测图1、图2、图3、图4或 图6中特定的位置中的至少1个单核苷酸多态性或插入缺失位点，且由此检测啤酒花品种 间不同的单核苷酸多态性。
[0052] (17) -种方法，其为检测啤酒花试样中的不同品种混入的方法，所述方法包含以 下工序：
[0053] (i)扩增从被测物啤酒花试样中提取的DNA中的包含品种识别区域的DNA片段的 工序，该品种识别区域包含由啤酒花品种间不同的至少一个单核苷酸多态性（SNP)构成的 识别标记；
[0054] (ii)分析上述工序⑴中扩增的DNA片段中的品种识别区域的碱基序列，得到测 序数据的工序；
[0055] (iii)将上述工序（ii)中得到的测序数据中的构成识别标记的单核苷酸多态性 位点的信息与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息进行对比的工序；及
[0056] (iv)确定啤酒花试样中有无不同品种混入的工序，在此，上述工序（ii)中得到的 测序数据的单核苷酸多态性位点的信息与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息一 致时，判断为无不同品种混入，或上述工序（ii)中得到的测序数据的单核苷酸多态性位点 的信息与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息不一致时，判断为有不同品种混入。
[0057] (18)根据（17)中所述的方法，其特征在于，进一步包含接在工序（iv)后的以下工 序：
[0058] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的测序数据的单核苷酸多态性位点的 信息与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息不一致时，由上述工序（ii)中得到的 测序数据的单核苷酸多态性位点中出现的来自正常品以外的信息特定其碱基的工序；及
[0059] (vi)将上述工序（V)中特定的单核苷酸多态性位点的与正常品不同的碱基与识 别标记对照，从而推断或特定混入品种的工序。
[0060] (19)根据（17)中所述的方法，其特征在于，进一步包含接在工序（iv)后的以下工 序：
[0061] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的测序数据的单核苷酸多态性位点的 信息与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息不一致时，由上述工序（ii)中得到的 测序数据的单核苷酸多态性位点中出现的来自正常品以外的信息特定其碱基，并求出混入 比例的工序；及
[0062] (vi)将上述工序（V)中特定的单核苷酸多态性位点的与正常品不同的碱基与识 别标记对照，从而推断或特定混入品种和其混入比例的工序。
[0063] (20)根据⑴?（9)中任一项所述的方法，其特征在于，工序（iii)中包含有无 19?25碱基的插入序列的分析。
[0064] 通过可利用由品种间的单核苷酸多态性组成的识别标记来识别啤酒花品种，在确 认订购的原料啤酒花是否为所订货的品种且是否混入了不同品种时，可准确特定作为被测 物的啤酒花品种及检测有无不同品种混入。而且不同品种混入时，不仅可分析有无混入，还 可推断或特定混入品种，分析其混入比例
[0065] 此外，使用通过本发明的方法制备的构成识别标记的碱基的信息，可制备用于识 别目标品种的引物、探针，通过使用利用该引物、探针的实时PCR法、新一代测序仪进行分 析，可期待能对不同品种的混入比例进行定量分析。
[0066] 由此，可稳定供给目标高品质的啤酒。此外，即使被测物劣化、损伤时，也可识别品 种。

【专利附图】

【附图说明】
[0067] 图1为表示14品种啤酒花的Al区域中的SNP分析结果的图及碱基的编码表。SNP 的位置表示从Al区域的共有序列（序列号9)的5'侧开始数的SNP的位置。分析后的SNP 为24处。用于分析的14种啤酒花被分为9类型（type)的双体型。
[0068] 图2为表示14品种啤酒花的Bl区域中的SNP分析结果的图。SNP的位置表示从 Bl区域的共有序列（序列号10)的5'侧开始数的SNP的位置。分析后的SNP为10处。用 于分析的14种啤酒花被分为7类型的双体型。有关A、G、C、T以外的碱基的标记参照图1 的编码表。
[0069] 图3为表示14品种啤酒花的Cl区域中的SNP分析结果的图。SNP的位置表示从 Cl区域的共有序列（序列号11)的5'侧开始数的SNP的位置。分析后的SNP为29处，其 中，序列号11的第129?134位的碱基为插入缺失（indel)部分。用于分析的14种啤酒 花被分为3类型的双体型。有关A、G、C、T以外的碱基的标记参照图1的编码表。
[0070] 图4为表不珍珠（Perle)及北酿（Northern Brewer)的Al - 2 - L区域及Al - 2 - R区域中的SNP分析结果的图。SNP的位置表示分别从Al - 2 - L区域的2品种共有 序列（序列号12)及Al - 2 - R区域的2品种共有序列（序列号14)的5'侧开始数的 SNP的位置。对Al - 2 - L区域进行分析后的SNP为21处，其中，序列号12的第186? 194及第399位的碱基为插入缺失（indel)部分。对Al - 2 - R区域进行分析后的SNP 为67处，其中，序列号14的第57?59及第65位的碱基为插入缺失（indel)部分。珍珠 (Perle)及北酿（Northern Brewer)表不不同的双体型。
[0071] 图5为归纳用于品种识别试验的啤酒花品种和识别标记的双体型的表。
[0072] 图6为表示斯拉德克（Slddek)、斯派尔特（Spalter)、珍珠（Perle)、泰特南 (Tettnang)及北酿（Northern Brewer)的 Al - 2 - L 区域及 Al - 2 - R 区域中的 SNP 分 析结果的图。SNP的位置表示分别从Al - 2 - L区域的5品种共有序列（序列号13)及 Al - 2 - R区域的5品种共有序列（序列号15)的5'侧开始数的SNP的位置。对Al - 2 - L区域进行分析后的SNP为23处，其中，序列号13的第12、第183?191及第396位 的碱基为插入缺失（indel)部分。对Al - 2 - R区域进行分析后的SNP为28处，其中，序 列号15的第437位的碱基为插入缺失（indel)部分。表示用于分析的5个品种啤酒花的 Al - 2 - L区域中的各个不同的双体型，在Al - 2 - R区域中被分为4类型的双体型。
[0073] 图7为归纳斯拉德克（Slddek)、斯派尔特（Spalter)、珍珠（Perle)、泰特南 (Tettnang)及北酿（Northern Brewer)的Al - 2 - L区域（序列号13)中识别标记的双 体型的表。
[0074] 图8为表示分析萨兹（Saaz)及普莱米特（Premiant)的混合试样的Al区域碱基 序列的结果的电泳图。Al区域的碱基号根据序列号9中的碱基号。

【具体实施方式】
[0075] 以下具体说明本发明，但本发明不限于这些。本发明涉及利用由品种间不同的至 少一个单核苷酸多态性（SNP)构成的识别标记的用于识别啤酒花品种的方法、该识别标记 的制备方法、检测利用该识别标记的啤酒花试样中不同品种混入的方法、该识别标记、设计 为可扩增具有该识别标记的区域的品种识别引物及用于检测该识别标记的品种识别探针。
[0076] <本发明的概要>
[0077] 本申请涉及如下发明，其特征在于，使用由品种间不同的至少1个SNP构成的识别 标记来识别啤酒花品种。具体而言，提取被测物啤酒花的DNA，分析具有与由SNP组成的识 别标记区域的碱基序列对应的碱基序列中的识别标记所对应位点的碱基是否与识别标记 的碱基一致，为一致时，即将被测物啤酒花品种特定为识别标记的品种。
[0078] < 定义 >
[0079] 本说明书中只要不特别定义，与本发明相关使用的科学用语及技术用语具有本领 域技术人员通常理解的意思。
[0080] 本说明书中，"识别标记"是指用于识别啤酒花品种的指标，由品种间不同的1以上 的单核苷酸多态性构成。为使本发明的识别标记在识别对象品种间不重复，将品种与识别 标记以一一对应的方式来确定，但也可根据作为识别对象的品种的数量、种类来变更构成 识别标记的单核苷酸多态性。例如，需要识别的品种仅为2品种时，使用由1个单核苷酸多 态性构成的识别标记即足够，需要识别的品种为多个的情况下，通过多个单核苷酸多态性 的组合（根据情况为多个识别区域的多个单核苷酸多态性的组合）以不重复的方式来确定 识别标记。识别标记原则上以不重复的方式来确定，但根据识别的目的，也可将识别标记重 复的多个品种（即具有相同识别标记的多个品种）看成1个组，与1个识别标记对应而使 用。
[0081] 本说明书中，"识别区域"是指包含来自啤酒花DNA中的识别标记的区域。识别区 域不限于1个区域，也可为多个区域。而且，识别区域中，有时将品种识别时被测物的DNA 片段进行扩增的核酸区域特别记为"品种识别区域"。品种识别区域也可为与识别区域相同 的区域，还可根据品种识别的目的而另行设定。此外，品种识别区域不限于1个区域，也可 为多个区域。
[0082] <识别标记的制各方法>
[0083] 本申请提供制备用于识别啤酒花品种的识别标记的方法。
[0084] 在方式之一中，本发明的识别标记如下制备，使用2个以上不同品种的啤酒花，进 行转录组分析，选定单核苷酸多态性（SNP)较多存在的区域，设计引物，确定识别区域和可 扩增该识别区域的引物。而后通过从识别对象的品种中提取DNA、使用所述引物、扩增识别 区域、确定碱基序列、进行品种间对比，通过确定由识别对象品种的识别中必需的至少1个 SNP构成的识别标记而来制备。
[0085] 具体而言，制备用于识别啤酒花品种的识别标记的方法也可包含以下工序：
[0086] (a)使用2个以上不同品种的啤酒花，进行转录组分析的工序；
[0087] (b)基于由上述工序（a)的结果得到的DNA片段的碱基序列，对各品种进行组装的 工序；
[0088] (C)将由上述工序（b)的结果得到的重叠群及/或单拷贝进行品种间对比，进行品 种间不同的单核苷酸多态性（SNP)的搜索的工序；
[0089] (d)根据上述工序（c)的SNP搜索的结果，选择包含SNP的区域，设计用于扩增该 区域的引物的工序；
[0090] (e)通过使用上述工序（d)中设计的引物，以从啤酒花中提取的DNA为模板，确认 上述工序（d)中选择的区域可扩增，确定该碱基序列，从而确定识别区域和可扩增该识别 区域的引物的工序；
[0091] (f)使用上述工序（e)中确定的引物，以从识别对象品种的啤酒花中提取的DNA为 模板扩增识别区域，确定识别区域的碱基序列的工序；及
[0092] (g)将上述工序（f)中确定的识别区域的碱基序列进行品种间对比，确定由用于 识别识别对象品种所必需的SNP的组合构成的识别标记的工序。但本发明不限于这些方 法，也可将通常已知的其他方法适当改变使用。
[0093] 对上述工序（a)?（g)如下进行说明。
[0094] (a)彳申用啤酒花分析转录纟的工序
[0095] 为了搜索识别标记中应含有的候选SNP，首先，使用2个以上不同品种的啤酒花， 分别对其进行转录组分析。
[0096] 转录组（transcriptome)是指某些特定状态的组织、细胞中存在的总mRNA(或为 初级转录物、转录产物（transcripts))的总体。
[0097] 以下将本发明中转录组分析的顺序作为一例进行说明，但不特别限定于此。首先， 分别从啤酒花的多个品种的组织中粗提取总RNA，纯化总RNA中的总mRNA (poly (A)+RNA)， 进行以该mRNA为模板的cDNA的合成。因所得到的cDNA文库中表达量多的和少的混合存 在，所以，需校正表达量的不同（均一化），进而进行以大小（size)为基准的纯化。而后，使 用超高速DNA序列分析装置进行cDNA的测序分析。
[0098] 作为提取上述总RNA的啤酒花的组织，适合使用构成芽、叶、茎、球花的各种组织， 但不特别限定于此。此外，从啤酒花植株上采集上述组织时，啤酒花植株的栽培方法、其生 长发育阶段等也无特别限定。而且，作为啤酒花的组织，可为鲜组织，也可为干燥组织，还可 以加工成例如颗粒状。但是，因 RNA易分解，所以，优选立刻使用从啤酒花植株上采集的新 鲜组织，且作为富含RNA的组织，优选使用嫩叶。此外，在采集分析用试样时，优选采取极力 防止RNA分解的措施，努力防止污染。
[0099] 此外，转录组分析中使用的啤酒花品种可使用2品种以上的不同品种，所使用的 品种、数量可根据目的不同来选择。另外，为了检测更大量的SNP，优选使用3品种以上的不 同品种。此外，优选从识别对象品种中选择使用。
[0100] 啤酒花组织中的总RNA的提取?CDNA的测序分析的转录组分析的各步骤可采用 通常采用的方法进行。
[01 01 ] (b)对各品种讲_彳丁组裝的下序
[0102] 基于如上所述各品种中用转录组分析而明确的DNA片段（cDNA)的碱基序列，对各 品种进行序列组装。序列组装是指由短的DNA片段再构建原本的长的碱基序列。例如基于 由工序（a)的结果得到的DNA片段的碱基序列，对是否具有相互重叠的碱基序列进行聚类 分析（Clustering)，寻找聚类后的一系列DNA片段中的重叠部分进行拼接（组装），而得到 一个序列。将如此组装的序列总称为"重叠群（contig) "，此外，将重叠群形成时未附加的 单端（single read)总称为"单拷贝（singlet)"。通过序列组装的重叠群的制备可通过通 常采用的方法进行。
[0103] (c)检测品种间对应的喊某的不同的下序
[0104] 如上所述，基于对各品种进行转录组分析而明确的DNA片段的碱基序列，以相互 重叠的序列部分为基础进行组装而制备重叠群。使用由此得到的重叠群序列及/或单拷贝 序列，检测品种间对应的喊基的不同（在此为SNP)。
[0105] 检测2品种以上品种间对应的碱基的不同时，首先是将其中1品种作为参照序列 (参考序列）来选择。而后，将所选择的品种的重叠群及/或单拷贝（优选为重叠群，更优 选为重叠群及单拷贝）指定为参考序列，以此为基准，将其他品种的单端以是否具有共有 部分的方式分别作图（mapping)。进而，从在分析软件上开发的组装信息中推断出已作图 (mapping)的单端成为构成要素的重叠群。将如此得到的参考序列与其他品种的重叠群及 /或单拷贝进行比对，以检测SNP。另外，因仅1品种的参考序列中有忽略SNP的可能性，所 以，优选将其他品种分别作为参考序列，与上述同样进行作图（mapping)、比对而检测SNP， 将这些结果综合为SNP数据。通过将各种不同品种作为参考序列来检测SNP，可检测更多的 SNP，可选择更适合作为识别标记的SNP。且在检测出本发明中3品种以上的品种间对应的 喊基的不同时，在品种间对应的喊基中，至少任意2品种间不同时，即可视为SNP。在检测品 种间对应的碱基的不同时，可用通常采用的方法进行。上述方法为一例，但不限定于此。作 为其他方法，也可通过使用1品种的重叠群序列进行BLAST搜索，来检测不同。
[0106] (d)诜择含有SNP的区域设计引物的工序
[0107] 如此，由使用重叠群序列及/或单拷贝序列检测SNP的结果，选择可用于识别的 SNP存在的区域。以多个品种的识别为目的时，希望选择SNP大量存在的区域。更具体而 言，可例示从分析的容易度出发，优选纯合子（2倍体的各个双链间碱基序列为一致）中的 SNP存在的区域，且选择单位重叠群中SNP数多的区域，但无特别限定。
[0108] 其后，设计可扩增该区域的引物。引物的设计可通过通常采用的方法进行。
[0109] (e)确定识别区域和可扩增该识别区域的引物的工序
[0110] 因如上所述设计的引物是基于从cDNA文库中制备的重叠群序列或单拷贝序列而 设计的引物，所以，是否良好扩增包含启动子区域、内含子的基因组的DNA还不得而知。因 此，需要使用从啤酒花中提取的基因组DNA来确认扩增。此外，即使在扩增时也要确认插入 缺失（indel)、微卫星的有无、目标SNP的存在，所以，需要进行根据双脱氧测序法（SANGER) 等的碱基序列的确认。因此，使用工序（d)中设计的引物，以啤酒花品种（优选为工序（a) 中使用的啤酒花品种）的颗粒、干燥球花等中提取的基因组DNA为模板，扩增含有SNP的区 域并进行测序。由此，确认能以适当大小进行扩增及与基于所述转录组分析的碱基序列进 行对比可适用于品种识别，以确定可用于识别的区域（识别区域）和可扩增该区域的引物。 由于内含子的存在等无法扩增时，扩增大小、碱基序列中有不合适、不良好时，要进行选择 区域的再探讨、引物的再设计。
[0111] 另外，用于制备识别标记的识别区域不限于1个区域，也可选择多个区域。通过选 择多个区域可识别更多的品种。
[0112] 此外，识别区域中也可包含插入缺失（indel)部分。从广义上讲，单核苷酸多态性 (SNP)中也可包含插入缺失（indel)，本发明中，作为构成识别标记的SNP，也可利用插入缺 失（indel)部分。
[0113] (f)确定识别区域的碱某序列的工序及（g)确定识别对象品种的识别标记的工序
[0114] 使用工序（e)中确定的可扩增识别区域的引物，以从识别对象品种中提取的基因 组DNA为模板分别扩增识别区域。
[0115] 本说明书中，识别对象品种是指作为识别的对象而选择的啤酒花品种，包含2个 以上不同品种。啤酒花只要是被分类为学名Humulus lupulus的植物，无特别限定。例如 可列举以德国、美国、捷克、英国、法国、中国、斯洛文尼亚、南非、澳大利亚、新西兰、日本等 为原产国的啤酒花。
[0116] 作为欧洲原产的啤酒花的例子，可列举萨兹（Saaz)、斯拉德克（Slddek)、普莱米 特（Premiant)、传统（Tradition)、斯派尔特（Spalter)、斯派尔特精选（Spalter Select)、 珍珠（Perle)、泰特南（Tettnang)、金酿（Brewer，s Gold)、北酿（Northern Brewer)、马格 努门（Magnum)、海格立斯（Herkules)、德国努格特（German Nugget)、陶若斯（Taurus)、阿 德米瑞（Admiral)、奥罗拉（Aurora)、赫斯布鲁克（Hersbrucker)、哈拉道默克（Hallertau Merkur)、Hallertau Mittelfrueh、塔格特（Target)等，但不限于这些。
[0117] 作为美国原产的啤酒花的例子，可列举阿玛里洛（Amarillo)、卡斯卡特 (Cascade)、世纪（Centennial)、奇努克（Chinook)、克雷斯特（Cluster)、哥伦布 (Columbus)、水晶（Crystal)、富格尔（Fuggle)、格林纳（Galena)、哥尔丁（Golding)、 Horizon、自由（Liberty)、胡德峰（Mount Hood)、努格特（Nugget)、Santiam、斯特林 (Sterling)、萨米特（Summit)、超级格林纳（Super Galena)、泰特楠捷（Tettnanger)、战斧 (Tomahawk)、乌尔特拉（Ultra)、威廉麦特（Willamette)、宙斯（Zeus)等，但不限于这些。
[0118] 根据识别的目的不同，可自由设定对象品种的种类、数量。例如，可选择与栽培地 邻近的品种等，可根据其各个时期的目的不同而选择对象品种。
[0119] 作为方式之一，识别对象品种为实施例1的表4中所示的以德国及捷克为原产国 的14种啤酒花。
[0120] 对于此种根据目的而选择的识别对象品种，进行扩增DNA片段的测序，确定碱基 序列。
[0121] 对工序（f)中确定的各识别对象品种的识别区域的碱基序列进行比对，提取SNP 部分。为使识别对象品种间不重复，以品种和识别标记为一一对应的方式来组合所提取的 SNP，确定识别标记。
[0122] 在此，上述工序（f)及（g)可根据以下（1)?（11)中所示的顺序进行。
[0123] (1)啤酒花的获得
[0124] 本发明中使用的"DNA"可通过从啤酒花的组织中提取DNA来得到。作为啤酒花的 组织，适合使用构成芽、叶、茎、球花的各种组织，但不特别限定于此。此外，从啤酒花植株上 采集上述组织时，对啤酒花植株的栽培方法、其生长发育阶段等也无特别限定。而且作为啤 酒花的组织，可为鲜组织，也可为干燥组织，此外，也可为例如加工成颗粒状的啤酒花的组 织。
[0125] (2) DNA 的提取
[0126] DNA的提取可使用CTAB(十六烧基三甲基溴化铵：Cetyltrimethyl ammonium bromide)法、市售试剂盒的Qiagen DNeasy Tissue Kit(QIAGEN公司）、IS0PLANT II(日本 基因公司）等本领域技术人员公知的方法提取。从操作性和经济性的方面考虑，优选CTAB 法。
[0127] (3) DNA片段的扩增
[0128] 通过PCR法扩增如上所述提取的DNA。本发明中使用的PCR法无特别限定，不仅包 含公知的PCR法，还包含各种改良方法。以下为其中一例。
[0129] 即除了引物对、模板DNA以外，混合Tris - HCl、KCl、MgCl2、各dNTP、TaqDNA聚合 酶等的试剂类，作为PCR反应液。PCR的1个循环由热变性、退火、通过DNA聚合酶的DNA链 的延伸（合成）反应的3步组成。各步反应各有不同，根据情况需要同一反应温度和反应 时间，这些可通过应扩增的DNA区域的碱基序列、其长度等适当确定。此种操作可使用市售 的基因扩增仪进行。
[0130] 作为本发明中使用的引物，使用所述工序（e)中确定的可扩增识别区域的引物 对。例如可使用本
【发明者】确定的引物对（Al - 3L/A1 - 3R(序列号1及2))、引物对（BI - 1L/B1 - 1R(序列号3及4))、引物对（Cl 一 1L/C1 一 1R(序列号5及6))及/或引物对 (Al - 2 - 1L/A1 - 2 - 1R(序列号 7 及 8))。
[0131] (4)通过PCR的扩增的确认
[0132] 作为PCR结果（PCR产物）的评价方法，使用可鉴定特定DNA片段的任意方法，例如 电泳、凝胶过滤、杂交，确认目的大小的DNA片段进行了扩增。例如，分别确认出使用引物对 (Al - 3L/A1 - 3R(序列号1及2))时，扩增到大小为651碱基长；使用引物对（BI - IL/ Bl - 1R(序列号3及4))时，扩增到大小为729碱基长；使用引物对（Cl 一 1L/C1 一 IR(序 列号5及6))时，扩增到大小为646碱基长；使用引物对（Al - 2 - 1L/A1 - 2 - IR(序列 号7及8))时，扩增到大小为约1500碱基长。
[0133] (5) PCR产物的纯化
[0134] 所扩增的PCR产物因作为循环测序反应的模板使用，所以与剩余的引物等的在反 应中使用的成分分离。该纯化例如可使用市售的QIAquick PCR Purific ation Kit (QIAGEN 公司），根据其产品中附带的实验方法来进行。
[0135] (6)循环测序反应及测序产物的纯化
[0136] 因进行如上所述纯化的PCR产物的测序，所以，以其为模板，进行循环测序反应。 该方法为如下方法，与PCR法类似，使用基因扩增仪，重复进行热变性、退火、通过DNA聚合 酶的DNA链的延伸反应的3步，使用其中任意1种引物，在用各个碱基不同的4种荧光色素 标记的终止子存在下，合成长度不同的各种单链DNA。循环测序的方法例如可使用市售的 BigDye Terminator vl. ICycle Sequencing Kit (Life Technologies) 〇 具体而言，可根据 该试剂盒的日语版实验方法（P. 22 "单链DNA、双链DNA的循环测序"、p. 25 "GeneAmpPCR System9700, 9600, 2700, 2400 中的循环测序"及 ρ· 38 - 40 "旋转柱（和 Spin Plate)中的 纯化法"）实施。且所使用的引物的碱基序列可与通过目的DNA片段的PCR的扩增中使用的 碱基序列相同。即在根据需要用灭菌蒸馏水稀释PCR产物的纯化液后加入规定的物质，制 备循环测序反应液。将其加入PCR用微型离心管中，安装在PCR装置上，进行变性（例如， 96°C、1分钟）后，重复进行例如25次变性（例如，96°C、10秒）、退火（例如，50°C、5秒）、 链延伸（例如，60°C、4分钟）的反应。另外，反应终止后，不立即取出样品时，可降低样品模 块的温度来保持。
[0137] 其后，从上述中得到的反应液中，纯化测序产物、即单链DNA的混合液，制备以 后的用于测序仪的试样。作为该方法的一例，可列举使用CENTRISEP Spin C〇lumn(Life Technologies)的方法，根据附带的实验方法进行操作，得到目的试样。
[0138] (7) DNA片段的测序
[0139] 对于用上述Dye Terminator法得到的测序产物进行测序。作为方法，通常使用电 泳法，作为一例，可列举使用ABI PRISM 310Genetic Analyzer进行电泳，利用标记中使用 的荧光物质在各个碱基中的不同，通过激光荧光检测仪依次确定碱基序列。
[0140] (8)碱基序列的分析
[0141] 分析所确定的碱基序列，得到测序数据。对照分别得到的测序数据，确定正确的碱 基序列。
[0142] (9)碱基序列的比对
[0143] 对如上所述得到的识别对象品种的测序数据进行比对。
[0144] (10)全部识别对象品种的上述碱基序列中保守的碱基除外
[0145] 如此，比对的结果，从上述碱基序列中，将由全部识别对象品种的上述碱基序列中 保守的1个或其以上的碱基形成的位点除外。如此，通过将全部的上述碱基序列中保守的 碱基位点除外，可明确地确认单核苷酸多态性的存在，而且，在之后的工序中，可容易地进 行基于单核苷酸多态性的识别标记的确定。
[0146] 具体而言，从通过比对而得到的数据中，提取全部识别对象品种的碱基序列中碱 基保守的位点。"碱基保守"是指所得到的比对数据的纵列在全部识别对象品种的碱基序列 中均为相同的碱基。将所提取的位点全部除外。将所保守的位点全部除外的理由如下。
[0147] 即对比啤酒花品种的碱基序列时，认为大部分的碱基在全部识别对象品种中共有 存在。但是，本发明的特征在于，着眼于除去与全部识别对象品种共有的部分的单核苷酸多 态性的部分，基于该单核苷酸多态性与品种具有相关性，从而制备识别标记。
[0148] 提取的方法只要是可提取全部识别对象品种的碱基序列中保守的碱基的方法，也 可使用目测、机械操作等的任何方法。
[0149] (11)识别标记的确定
[0150] 使用进行了上述除外后剩余的SNP，确定识别标记。如前所述，为使本发明的识别 标记在识别对象品种间不重复，以一一对应的方式确定品种和识别标记。另外，识别标记每 次均需根据其使用目的、即作为识别对象的品种的数量、种类，而确定构成识别标记的SNP。 例如，仅识别特定的2品种时，可选择1处可进行该2品种识别的SNP来作为识别标记。此 夕卜，需要识别多个品种时，可通过将多处的SNP (根据情况，将多个识别区域的多处的SNP) 组合，确定识别标记，使其在该品种间不重复。
[0151] 例如，将以下实施例1中记载的如表4中所示的14品种啤酒花作为识别对象时， 该14品种中，Al区域（序列号9)中存在的24处SNP可分为9类型，Bl区域（序列号10) 中存在的10处SNP可分为7类型，Cl区域（序列号11)中存在的29处SNP(其中，相当于 序列号11的第129?134位的碱基的6处为插入缺失部分）可分为3类型，通过将这些组 合，可将14品种分为13类型。即对14品种中的12品种，可通过Al区域、Bl区域、Cl区域 中分别存在的SNP，使识别标记和品种一一对应。而且因剩余的1类型适合类似的2品种， 所以，作为识别这些类似的2品种的区域，可通过Al - 2 - L区域（序列号12)中存在的 21处SNP (其中，10处为插入缺失部分）及Al - 2 - R区域（序列号14)中存在的67处 SNP(其中，4处为插入缺失部分）的任一个，使识别标记与2品种对应。如此，在识别上述 的14品种时，可将Al区域的24处SNP、Bl区域的10处SNP、Cl区域的29处SNP (其中，6 处为插入缺失部分）以及Al - 2 - L区域及Al - 2 - R区域中的任意1个的SNP的合计 64处SNP确定为识别标记。此外，例如从上述14品种中选择一些品种作为识别对象时，也 可从上述64处SNP中选择用于识别该识别对象品种所必需的SNP，而确定为识别标记。
[0152] 此外，例如仅将上述类似2品种作为识别对象品种时，可将Al - 2 - L区域及 Al - 2 - R区域中的任一个SNP确定为识别标记。而且，将如以下实施例1中记载的表4 中所示的14品种啤酒花中的斯拉德克（Slddek)、斯派尔特（Spalter)、珍珠（Perle)、泰特 南（Tettnang)及北酿（Northern Brewer)的5品种作为识别对象品种时，可将Al - 2 - L区域（序列号13)中存在的23处SNP(其中，11处为插入缺失部分）确定为识别标记。
[0153] 上述记载中，作为识别对象品种，将实施例1的表4中所示的以德国及捷克为原产 国的14种啤酒花的情况作为例子来进行说明，包含以美国为原产国的品种的更多品种的 识别方式希望参照实施例5。如表20中所示，方框中所包围的22碱基（碱基号64 - 85) 被认定是普莱米特（Premiant)和萨米特（Summit),相对于此，宙斯（Zeus)中不存在其插 入序列。如此，插入序列的有无也可作为品种识别的要素。插入序列的长度无特别限制，例 如为19?25碱基。而且，该插入序列中也确认有SNP (碱基号64位、67位、75位），也可 将插入序列中的SNP作为识别标记。作为进一步的识别要素，该插入序列之后直到碱基号 141的（CA)或（TA)的重复序列的长度也成为识别要素。例如，与普莱米特（Premiant)和 宙斯（Zeus)相比，萨米特（Summit)为12碱基长的结构。
[0154] 此外，如上所述，将表4中所示的14品种啤酒花作为识别对象时，Bl区域（序列号 10) 中存在的10处SNP可分为7类型，包含以美国为原产国的品种（例如格林纳（Galena)) 时，第245?248位的碱基也为SNP，成为识别标记。
[0155] 而且，如上所述，将表4中所示的14品种啤酒花作为识别对象时，Cl区域（序列号 11) 中存在的29处SNP可分为3类型，包含以美国为原产国的品种（例如格林纳（Galena)) 时，第 76 ?80、93、136、138、163、165、245、313、321、373、376、435、438位的碱基也5咿，成为 识别标记。
[0156] 在其他方式中，本发明的识别标记也可使用来自2个以上不同品种啤酒花的基因 组DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA来制备。优选为也可使用来自2个以上不同品种啤酒花的 基因组DNA。
[0157] 在制备用于使用基因组DNA、线粒体DNA或叶绿体DNA识别啤酒花品种的识别标记 时，制备识别标记的方法也可包含以下工序：
[0158] (a-Ι)从2个以上不同品种的啤酒花的组织中提取基因组DNA、线粒体DNA或叶绿 体DNA的工序；
[0159] (a-2)随机切割由上述工序（a-Ι)的结果得到的DNA，筛选适合尺寸的片段的工 序；
[0160] (a-3)确定上述工序（a-2)中得到的DNA片段的碱基序列的工序；
[0161] (b)基于由上述工序（a-3)的结果得到的DNA片段的碱基序列，对各品种进行组装 的工序；
[0162] (C)将由上述工序（b)的结果得到的重叠群及/或单拷贝进行品种间对比，进行品 种间不同的单核苷酸多态性（SNP)的搜索的工序；
[0163] ⑷根据上述工序（c)的SNP搜索的结果，选择包含SNP的识别区域，设计用于扩 增该区域的引物的工序；
[0164] (f)使用上述工序（d)中设计的引物，以从识别对象品种的啤酒花中提取的DNA为 模板扩增识别区域，确定识别区域的碱基序列的工序；及
[0165] (g)将上述工序（f)中确定的识别区域的碱基序列进行品种间对比，确定由用于 识别识别对象品种所必需的SNP的组合构成的识别标记的工序。
[0166] 工序（a-Ι)?（a-3)可通过本领域技术人员已知的方法进行。特别是为了得到大 量的DNA片段，在确定DNA片段的碱基序列时，优选使用超高速DNA序列分析装置。
[0167] 工序（b)?（d)及（f)?（g)可用作为上述记载的方式的通过转录组分析的方法 中说明的方法来进行。
[0168] 此外，通过转录组分析的方法中，基于不含内含子的mRNA搜索翻译区域或5'或3' 非翻译区域的SNP，相对于此，在使用基因组DNA、线粒体DNA或叶绿体DNA的方式中，进行 包含内含子的DNA的全部区域的SNP搜索。由此，使用基因组DNA、线粒体DNA或叶绿体DNA 时，可省略如下工序（e)，相当于在通过转录组分析的识别标记的制备方法中，确认通过用 于扩增含有SNP的区域而设计的引物的该区域的扩增的工序。
[0169] 使用上述转录组的方式及使用基因组DNA(核基因组）、线粒体DNA或叶绿体DNA 的方式中，首先，用以下2步方法制备识别标记，即在开始使用2种以上不同的啤酒花品种 进行SNP搜索而确定识别区域和引物后，使用全部识别对象品种，对比识别区域的碱基序 列，确定适合识别标记的SNP，但也可从最初开始，使用全部识别对象品种进行SNP搜索而 确定识别区域和引物后，对比该识别区域的碱基序列，确定适合识别标记的SNP。即在上述 记载的2个方式中，从开始即使用全部识别对象品种时，不需要确定识别对象品种的识别 区域的喊基序列的工序（f)。
[0170] <啤酒花品种的识别方法>
[0171] 本发明还提供用于识别啤酒花品种的方法。具体而言，啤酒花品种的识别方法还 可包含以下工序：
[0172] ⑴扩增来自被测物啤酒花的DNA中的包含品种识别区域的DNA片段的工序，该品 种识别区域包含由啤酒花品种间不同的至少一个单核苷酸多态性（SNP)构成的识别标记；
[0173] (ii)鉴定上述工序（i)中扩增的DNA片段中的单核苷酸多态性的基因型的工序；
[0174] (iii)将上述工序（ii)所鉴定的被测物啤酒花DNA中的品种识别区域中的单核苷 酸多态性的基因型与已知啤酒花品种DNA所对应的区域中的单核苷酸多态性的基因型进 行对比，分析该区域中的单核苷酸多态性的基因型在被测物啤酒花和已知啤酒花品种之间 为一致或不一致的工序；
[0175] (iv)根据上述工序（iii)的分析结果，特定被测物啤酒花品种的工序。
[0176] 被测物啤酒花只要是被分类为学名Humulus lupulus的植物，无特别限定。例如， 可列举识别标记的制备方法的项目中列举的欧洲原产的啤酒花、美国原产的啤酒花，但不 限于这些。
[0177] 作为方式之一，被测物啤酒花为实施例1的表4中所示的14种啤酒花。
[0178] 对上述的工序（i)?（iv)，如下进行说明。
[0179] (i)扩增何含品种识别区域的DNA片段的工序
[0180] 包含品种识别区域的DNA片段：从需要识别品种的被测物啤酒花中提取基因组 DNA，以其为模板，使用可扩增具有作为基准的识别标记的区域的品种识别引物扩增包含品 种识别区域的DNA片段。基因组DNA的提取及DNA片段的扩增例如可根据上述<识别标记 的制备方法>中的"（f)确定识别区域的碱基序列的工序及（g)确定识别对象品种的识别 标记的工序"的项目中（1)啤酒花的获得?（3)DNA片段的扩增中所记载的方法或按照该方 法来进行。
[0181] 品种识别区域为包含通过上述识别标记的制备方法制备的识别标记的区域。构成 识别标记的单核苷酸多态性存在于多个区域中时，品种识别区域也可为该多个区域。此外， 存在多个构成识别标记的单核苷酸多态性时，品种识别区域可以为存在这些全部的1个区 域，还可以为具有多个存在至少1个单核苷酸多态性的区域。作为具体的品种识别区域，可 列举包含
[0182] 序列号 9(A1 区域）的碱基序列的第 74、77、87、103、116、118、121、125、134、135、 148、192、195、197、199、203、204、226、230、235、306、316、330、532 位；
[0183] 序列号 10(B1 区域）的碱基序列的第 178、204、227、234、370、426、439、547、562、 624 位；
[0184] 序列号 11 (Cl 区域）的碱基序列的第 3、13、17、87、88、129、130、131、132、133、134、 254、331、356、375、380、396、398、399、421、460、474、475、476、477、480、481、500、547 位（第 129?134位为插入缺失（indel)部分）；序列号12 (Al - 2 - L区域）的碱基序列的第34、 101、118、124、164、168、171、186、187、188、189、190、191、192、193、194、392、398、399、459、 502位（第186?194及第399位为插入缺失（indel)部分）；
[0185] 序列号 13 (Al - 2 -L 区域）的碱基序列的第 2、12、31、98、115、121、161、165、168、 183、184、185、186、187、188、189、190、191、389、395、396、456、499位（第12、183?191及第 396位为插入缺失（indel)部分）；
[0186] 序列号 14(A1 - 2 - R区域）的碱基序列的第 1、2、3、5、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、20、21、25、26、27、28、29、30、31、33、35、36、37、38、41、42、43、44、46、47、48、50、51、 56、57、58、59、63、65、68、72、78、79、84、86、88、90、92、118、153、154、191、205、206、226、228、 2 33、254、289、315、 35〇、392、4〇5 位（第 57 ?59 及第 65 位为插入缺失（indel)部分）；
[0187] 序列号 15(A1 - 2 - R 区域）的碱基序列的第 2、6、12、13、18、20、22、24、26、36、 52、87、88、125、139、140、160、162、167、188、223、249、273、284、326、339、421、437位（第437 位的插入缺失（indel)部分）；
[0188] 中记号η所示的单核苷酸多态性或插入缺失（indel)部分的至少一个的区域。
[0189] 在方式之一中，品种识别区域可为包含序列号9 (Al区域）的碱基序列的一部分或 全部且还包含记号η所示的单核苷酸多态性的至少一个的区域，品种识别区域也可为包含 序列号9的碱基序列的区域。或品种识别区域可为包含序列号10 (BI区域）的碱基序列的 一部分或全部且还包含记号η所示的单核苷酸多态性的至少一个的区域，品种识别区域也 可为包含序列号10的碱基序列的区域。或品种识别区域可为包含序列号11 (Cl区域）的 碱基序列的一部分或全部且还包含记号η所示的单核苷酸多态性或插入缺失（indel)部分 的至少一个的区域，品种识别区域也可为包含序列号11的碱基序列的区域。进而，品种识 别区域可为包含序列号12或13 (Al - 2 - L区域）的碱基序列的一部分或全部且还包含 记号η所示的单核苷酸多态性或插入缺失（indel)部分的至少一个的区域，品种识别区域 也可为包含序列号12或13的碱基序列的区域。此外，品种识别区域可为包含序列号14或 15 (Al - 2 - R区域）的碱基序列的一部分或全部且还包含记号η所示的单核苷酸多态性 或插入缺失（indel)部分的至少一个的区域，品种识别区域也可为包含序列号14或15的 喊基序列的区域。
[0190] 在其他方式中，品种识别区域可为选自以下区域的2个以上的区域，为包含序列 号9(A1区域）的碱基序列的一部分或全部且还包含η所示的单核苷酸多态性的至少一个 的区域；为包含序列号10 (BI区域）的碱基序列的一部分或全部且还包含η所示的单核苷 酸多态性的至少一个的区域；为包含序列号11 (Cl区域）的碱基序列的一部分或全部且还 包含η所示的单核苷酸多态性或插入缺失（indel)部分的至少一个的区域；为包含序列号 12或13 (Al - 2 - L区域）的碱基序列的一部分或全部且还包含η所示的单核苷酸多态性 或插入缺失（indel)部分的至少一个的区域；及为包含序列号14或15 (Al - 2 - R区域） 的碱基序列的一部分或全部且还包含η所示的单核苷酸多态性或插入缺失（indel)部分的 至少一个的区域。或品种识别区域可为选自以下区域的2个以上、3个以上、4个以上或5个 全部的区域，包含序列号9(A1区域）的碱基序列的区域、包含序列号10(B1区域）的碱基 序列的区域、包含序列号11 (Cl区域）的碱基序列的区域、包含序列号12或13 (Al - 2 - L区域）的碱基序列的区域及包含序列号14或15 (Al - 2 - R区域）的碱基序列的区域。
[0191] 而且在其他方式中，品种识别区域不仅为选自以下区域的1以上的区域，为包含 序列号9 (Al区域）的碱基序列的一部分或全部且还包含η所示的单核苷酸多态性的至少 一个的区域，为包含序列号10 (BI区域）的碱基序列的一部分或全部且还包含η所示的单 核苷酸多态性的至少一个的区域及为包含序列号11 (Cl区域）的碱基序列的一部分或全部 且还包含η所示的单核苷酸多态性或插入缺失（indel)部分的至少一个的区域，还可为以 下区域，为包含序列号12或13 (Al - 2 - L区域）的碱基序列的一部分或全部且还包含η 所示的单核苷酸多态性或插入缺失（indel)部分的至少一个的区域或为包含序列号14或 15 (Al - 2 - R区域）的碱基序列的一部分或全部且还包含η所示的单核苷酸多态性或插 入缺失（indel)部分的至少一个的区域。或品种识别区域不仅为选自以下的1个以上、优选 为2个以上、进一步优选为3个全部的区域，包含序列号9 (Al区域）的碱基序列的区域，包 含序列号1〇(Β1区域）的碱基序列的区域及包含序列号11(C1区域）的碱基序列的区域， 还可为以下序列，为包含序列号12或13 (Al - 2 - L区域）的碱基序列的一部分或全部且 还包含η所示的单核苷酸多态性或插入缺失（indel)部分的至少一个的区域或为包含序列 号14或15(A1 - 2 - R区域）的碱基序列的一部分或全部且还包含η所示的单核苷酸多 态性或插入缺失（indel)部分的至少一个的区域。或品种识别区域不仅为选自以下的1个 以上、优选为2个以上、进一步优选为3个全部的区域，包含序列号9 (Al区域）的碱基序列 的区域、包含序列号10 (BI区域）的碱基序列的区域及包含序列号11 (Cl区域）的碱基序 列的区域，还可为以下区域，包含序列号12或13(A1 - 2 - L区域）的碱基序列的区域或 包含序列号14或15 (Al - 2 - R区域）的碱基序列的区域。
[0192] 品种识别引物可为制备识别标记时确定的可扩增识别区域的引物，还可为为了可 扩增含有识别标记的区域（品种识别区域）而另行设计的引物。构成识别标记的单核苷酸 多态性存在于多个区域中时，品种识别引物也可为可扩增各个区域的引物。此外，存在多个 构成识别标记的单核苷酸多态性时，品种识别引物可为可扩增存在这些全部的1个区域的 引物，还可为可分别扩增存在至少1个单核苷酸多态性的多个区域的多个引物。
[0193] 作为品种识别引物而可利用的引物中，包含由序列号1?8中记载的碱基序列组 成的引物。工序（i)中用于DNA片段扩增的引物对的例子，可列举选自以下的1个以上的 组合的引物对，由序列号1及2的碱基序列组成的引物的组合、由序列号3及4的碱基序列 组成的引物的组合、由序列号5及6的碱基序列组成的引物的组合以及由序列号7及8的 碱基序列组成的引物的组合。
[0194] 在其他方式中，工序（i)通过使用选自以下组合的1个以上、优选为2个以上、进 一步优选为3个全部的引物对的PCR反应来进行，由序列号1及2的碱基序列组成的引物 的组合、由序列号3及4的碱基序列组成的引物的组合以及由序列号5及6的碱基序列组 成的引物的组合。
[0195] 在另一方式中，工序（i)不仅通过使用以下3个组合的引物对的PCR反应来进行， 由序列号1及2的碱基序列组成的引物的组合、由序列号3及4的碱基序列组成的引物的 组合以及由序列号5及6的碱基序列组成的引物的组合，还通过使用由序列号7及8的碱 基序列组成的引物的组合引物对的PCR反应来进行。
[0196] (ii)鉴定单核苷酸多杰件的某闵型的工序
[0197] 鉴定工序（i)中扩增的DNA片段中的单核苷酸多态性的基因型。
[0198] 在方式之一中，单核苷酸多态性的基因型的鉴定可通过鉴定包含品种识别区域的 DNA片段的碱基序列来进行。碱基序列的分析例如可根据上述<识别标记的制备方法>中 的"（f)确定识别区域的碱基序列的工序及（g)确定识别对象品种的识别标记的工序"的项 目中的（5)PCR产物的纯化?（8)碱基序列的分析中记载的方法或也可按照该方法来进行。
[0199] 在其他方式中，单核苷酸多态性的基因型的鉴定可通过使所扩增的DNA片段与构 成识别标记的检测啤酒花品种间不同的单核苷酸多态性的探针及/或引物接触来进行。检 测单核苷酸多态性的探针及/或引物可根据本领域技术人员公知的方法来设计及制备。使 用如此得到的探针的单核苷酸多态性的基因型的鉴定例如可利用DNA微阵列法等的本领 域技术人员公知的方法进行。此外，使用引物的单核苷酸多态性的基因型的鉴定除了根据 序列分析以外，还可根据SNaPshot (注册商标）法（Life Technologies公司）等，利用使 用如下设计的引物的鉴定方法，根据应检测的单核苷酸多态性，产生长度不同的扩增产物。 而且，使用探针及引物的单核苷酸多态性的基因型的鉴定可利用并用MGB(Minor Groove Binder)探针（Life Technologies公司）和设计为夹着该探针的引物的实时PCR法等。
[0200] (iii)对比、分析品种识别区域中的单核苷酸多杰件的某闵型的工序
[0201] 工序（iii)中，将被测物啤酒花DNA中的品种识别区域中的构成识别标记的单核 苷酸多态性的基因型与已知啤酒花品种DNA所对应的区域中的单核苷酸多态性的基因型 进行对比。且在该对比中，分析构成识别标记的单核苷酸多态性的基因型在被测物啤酒花 和已知啤酒花品种之间为一致或不一致。
[0202] 对比可通过视觉检查、数学计算来进行。或也可使用计算机程序。此外，对比也可 通过将包含品种识别区域的DNA片段的碱基序列与已知啤酒花品种DNA所对应的区域的碱 基序列进行对比来进行。对比可通过通常在被测物的基因上具有的单核苷酸多态性的检验 (SNP分型）中所采用方法来进行。
[0203] 以下，将直接对比碱基序列时的具体的对比方法使用分析用计算机程序的情况进 行例示。即准备包含表示通过上述识别标记的制备方法得到的识别标记的碱基的数据和表 示所述碱基的碱基序列位置的数据的识别标记表，存储到SeqScape (Life Technologies) 等的分析用计算机程序运行的计算机中。所存储的识别标记表可为1个或多个。且将包含 表示从作为被测物的啤酒花中得到的碱基的数据的被测物碱基序列的序列表存储到所述 计算机中。
[0204] 且参照所述识别标记表的表示所述碱基序列位置的数据，将表示被测物碱基序列 的序列表与所述识别标记表之间对应的碱基序列位置上的碱基的数据用所述计算机进行 对比。对比通过将运用所述分析用计算机程序的两组碱基序列进行比对来进行。
[0205] (iv)特定被测物啤酒花品种的工序
[0206] 工序（iv)中，根据工序（iii)的分析结果，特定被测物啤酒花品种。
[0207] 具体而言，分析相当于被测物碱基序列中的识别标记的位点的碱基与所述识别标 记的碱基是否完全一致，完全一致时，被测物特定为所述识别标记的品种。
[0208] 如此，使用本发明的识别标记时，可特定作为被测物的啤酒花品种。使用计算机进 行分析时，预先记录具有与多个品种相关的识别标记的区域的碱基序列，通过将被测物的 碱基序列依次与各品种的碱基序列进行对比？分析，可简便且迅速特定作为被测物的啤酒 花品种。
[0209] 另外，通过将作为识别标记而确定的特定的碱基着色，也可容易地进行上述对比。 即首先，将具有着色的对照碱基（识别标记）的碱基序列与被测物的碱基序列进行比对后， 仅将着色的碱基抽出，制成将两者进行对比的表。由此可容易地识别碱基的种类和存在的 位置是否完全一致，可容易的辨别作为被测物的啤酒花是否为其识别标记的品种。另外，因 该方法可同时分析多个被测物，所以优选。
[0210] <何含识别标记的核酸>
[0211] 本发明还提供如下核酸，其包含通过制备上述识别标记的方法制备的识别标记的 至少一部分。
[0212] 在此，"核酸"是指由2种以上的核苷酸构成的脱氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸 (RNA)。本领域技术人员应理解的是，对于DNA的碱基序列中记载的核酸意指RNA时，可将 DNA的碱基序列的胸腺嘧啶取代为尿嘧啶。此外，核酸可为单链，也可为与互补链杂交的双 链。
[0213] 具体而言，包含识别标记的至少一部分的核酸也可为如下核酸，包含选自以下的 碱基序列的一部分，序列号9 (Al区域）、序列号10 (BI区域）、序列号11 (Cl区域）、序列号 12或13 (Al - 2 - L区域）、序列号14或15 (Al - 2 - R区域），且在该喊基序列中包含记 号η所示的单核苷酸多态性或插入缺失（indel)部分的至少一个。优选为包含识别标记的 至少一部分的核酸也可为包含选自以下碱基序列的核酸，序列号9 (Al区域）、序列号10 (BI 区域）、序列号11 (Cl区域）、序列号12或13 (Al - 2 - L区域）及序列号14或15 (Al - 2 一 R区域）。
[0214] < 引物 >
[0215] 本发明也提供如下引物，其可扩增包含上述识别标记的至少一部分的核酸。
[0216] 引物只要是设计为可扩增包含上述识别标记的至少一部分的核酸的引物，无特别 限定。
[0217] < 探针 >
[0218] 本发明还提供如下探针，其用于检测构成识别标记的单核苷酸多态性。
[0219] 探针为可检测例如选自序列号9 (Al区域）、序列号10 (BI区域）、序列号11 (Cl区 域）、序列号12或13 (Al - 2 - L区域）及序列号14或15 (Al - 2 - R区域）的碱基序列 中η所示的单核苷酸多态性或插入缺失（indel)部分的至少一个。
[0220] <检测不同品种混入的方法>
[0221] 在担心不同品种混入时，利用本发明的识别标记，例如可用以下所述的方法检测 不同品种混入。
[0222] 其为检测啤酒花试样中的不同品种混入的方法，所述方法包含以下工序：
[0223] ⑴扩增从被测物啤酒花试样中提取的DNA中的包含品种识别区域的DNA片段的 工序，该品种识别区域包含由啤酒花品种间不同的至少一个单核苷酸多态性（SNP)构成的 识别标记；
[0224] (ii)分析上述工序⑴中扩增的DNA片段中的品种识别区域的碱基序列，得到测 序数据的工序；
[0225] (iii)将上述工序（ii)中得到的测序数据中的构成识别标记的单核苷酸多态性 位点的信息与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息进行对比的工序；及
[0226] (iv)确定啤酒花试样中有无不同品种混入的工序，在此，上述工序（ii)中得到的 测序数据的单核苷酸多态性位点的信息与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息一 致时，判断为无不同品种混入，或上述工序（ii)中得到的测序数据的单核苷酸多态性位点 的信息与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息不一致时，判断为有不同品种混入。
[0227] 而且，通过在（iv)之后继续进行以下的工序，可进行混入品种的推断或特定。即 包含
[0228] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的测序数据的单核苷酸多态性位点的 信息与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息不一致时，由上述工序（ii)中得到的 测序数据的单核苷酸多态性位点中出现的来自正常品以外的信息特定其碱基的工序；及
[0229] (Vi)将上述工序（V)中特定的单核苷酸多态性位点的与正常品不同的碱基与识 别标记对照，从而推断或特定混入品种的工序。
[0230] 此外，通过进一步在（iv)之后继续进行以下的工序，可分析混入比例。即包含
[0231] (V)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的测序数据的单核苷酸多态性位点的 信息与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息不一致时，由上述工序（ii)中得到的 测序数据的单核苷酸多态性位点中出现的来自正常品以外的信息特定其碱基，并求出混入 比例的工序；及
[0232] (Vi)将上述工序（V)中特定的单核苷酸多态性位点的与正常品不同的碱基与识 别标记对照，从而推断或特定混入品种和其混入比例的工序。
[0233] 在此，测序数据的单核苷酸多态性位点的信息是指例如由测序的结果得到的单核 苷酸多态性位点的形状、数值，具体而言，可列举由测序的结果得到的单核苷酸多态性位点 的电泳图（测序的时得到的表示各碱基的颜色分开的波形），将扩增片段克隆到大肠杆菌 等中，对所得到的多个克隆进行测序，通过对这些序列进行对比而得到的单核苷酸多态性 位点上的碱基的含有比率等。
[0234] 此外，此处的正常品是指为单一品种，指已确立构成识别标记的单核苷酸多态性 位点的信息的啤酒花品种。根据情况，所谓正常品的记载也有时指包含已确立构成识别标 记的单核苷酸多态性位点的信息的仅单一品种的试样。
[0235] 使用电泳图检测不同品种混入时，由于在作为被测物的啤酒花试样的电泳图中重 叠出现与正常品的波形不同的其他波形，所以，可确认不同品种的存在。且通过由单核苷酸 多态性位点上出现的与正常品不同的波形特定其碱基，与识别标记对照，从而可推断或特 定混入品种。只要各识别标记（SNP)中的其品种上特征性的碱基完全被确认，即可特定混 入品种。而且，通过将这些波形的重叠状况、高度等与另外实施的预先已知混入比例的其他 品种混合品的分析结果进行对比，可求出不同品种大约的混入比例。
[0236] 此外，在使用将扩增片段克隆到大肠杆菌等中而得到的多个克隆的测序数据时， 通过将其多个克隆的序列进行比对，求出各单核苷酸多态性位点的碱基的含有比率，可检 测不同品种的混入。即如未混入不同品种，则所有位点均与正常品的碱基为同样碱基的含 有比率应为100*%，在不同品种混入时，与正常品的喊基同样的喊基不为100*%，可看出其 他的碱基的含有比率。如此，通过将与正常品的碱基不同的碱基与识别标记对照，可特定混 入品种，求出含有比率。但是，在大肠杆菌上克隆的方法因需要分析大量的克隆，所以，会产 生需要大量劳力和时间的操作。
[0237] 作为求出各单核苷酸多态性位点的碱基的含有比率的其他方法，通过将包含作为 被测物的啤酒花试样的品种识别区域的DNA片段使用具有下一步骤中必需的附加序列的 特异性引物进行扩增，并将其用新一代测序仪大量测序，将这些进行比对，求出各单核苷酸 多态性位点的碱基的含有比率，从而可更准确地进行混入品种的特定和求出混入比率。
[0238] 此外，还具有将引物在马上进行多态性（SNP)分析之前进行设定，对仅使一碱基 伸长而掺入的碱基的种类进行多态性分型的方法。例如，称为SNaPshot (注册商标）法 (Life Technologies公司）的方法。此外，还有可使用MGB(Minor Groove Binder)探针 (Life Technologies公司），用实时PCR法对不同品种进行定量分析的方法。
[0239] 实施例
[0240] 以下，通过实施例进一步具体说明本发明。但本发明不限于这些实施例。
[0241] 实施例1识别标记的制各
[0242] (a)转录纟目分析
[0243] 为了得到啤酒花品种识别技术开发中必需的品种间DNA多态性区域，认为需要使 用新一代测序仪得到大量的测序数据，从其中广泛搜索SNP (检测人基因组时的SNP的频率 认为是 1 个/100 - 300 喊基；http://www.eubios.info/hmba ck.htm)。因此，本
【发明者】着 眼于转录组。转录组分析与以全部基因组为对象时相比，以大约1/100左右的数据处理即 可实现，因而可控制交货期、成本。而且虽然与全基因组相比可以说为少数，然而在我们的 计算中，可利用1万5千个SNP数据。因此，设想得到了多品种识别所必需的SNP，利用本方 法，实施品种间的SNP分析。
[0244] (1)试样的采集?保管
[0245] 从下一项表4中记载的识别对象品种中选择3品种（从方便上，记为品种A、B、C)， 采集该品种的啤酒花鲜叶。即用以下所示的方法进行采样·保管。
[0246] a.组织一尽可能采集嫩叶（小、黄绿色、柔软）。但表面上附着白色异物的叶除外。
[0247] b.方法一为了防止RNAse的附着，用带上手术用手套的手采集叶。采集的同时，在 防止RNA分解用的试剂中浸渍。
[0248] C.保管一常温下，至少1星期左右RNA为稳定，但到进行转录组分析及SNP序列分 析的期间，尽可能放入冰箱内保管。
[0249] (2)转录鉬分析
[0250] 对于如上所述采集的试样，委托Eurofins公司进行转录组分析。具体而言， 进行了总RNA的提取、mRNA的纯化、cDNA文库的构建、表达量的差的均一化、大小调整 (500?700bp)、GS FLX测序仪用的cDNA文库的制备、通过使用"Titanium Chemistry"的 Roche/454Genome Sequencer FLX 进行测序。
[0251] (b)纟目裝（重叠群的制各）
[0252] 使用转录组数据的SNP分析
[0253] 使用通过上述转录组分析而得到的测序数据，委托Eurofins公司进行重叠群的制 备。具体而言，基于各啤酒花品种的DNA片段的碱基序列，进行聚类和组装。其结果，从各 品种中得到合计为约42000?45000种的重叠群（cDNA的一部分）的碱基序列。其中，具 有IOOObp以上的长度的重叠群为约4500?6700个。
[0254]【表1】
[0255]

【权利要求】
1. 一种方法，其为啤酒花品种的识别方法，其特征在于，所述方法包含以下工序： (i) 扩增来自被测物啤酒花的DNA中的包含品种识别区域的DNA片段的工序，该品种识 别区域包含由啤酒花品种间不同的至少一个单核苷酸多态性即SNP构成的识别标记； (ii) 鉴定上述工序（i)中扩增的DNA片段中的单核苷酸多态性的基因型的工序； (iii) 将上述工序（ii)所鉴定的被测物啤酒花DNA中的品种识别区域中的单核苷酸多 态性的基因型与已知啤酒花品种DNA所对应的区域中的单核苷酸多态性的基因型进行对 t匕，分析该区域中的单核苷酸多态性的基因型在被测物啤酒花和已知啤酒花品种之间为一 致或不一致的工序； (iv) 根据上述工序（iii)的分析结果，特定被测物啤酒花品种的工序。
2. 根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，工序（ii)如下进行，鉴定工序（i)中扩 增的DNA片段中的品种识别区域的碱基序列，且 工序（iii)如下进行，将工序（ii)所鉴定的被测物啤酒花DNA中的品种识别区域的碱 基序列与已知啤酒花品种DNA所对应的区域的碱基序列进行对比，分析该区域中的识别标 记在被测物啤酒花和已知啤酒花品种之间为一致或不一致。
3. 根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，工序（ii)为如下工序，通过使工序（i) 中扩增的DNA片段与检测啤酒花品种间不同的单核苷酸多态性的探针及/或引物接触，而 鉴定单核苷酸多态性的基因型。
4. 根据权利要求1?3中任一项所述的方法，其特征在于，品种识别区域为包含通过包 含以下工序的方法而制备的识别标记的区域： (a) 使用2个以上不同品种的啤酒花，进行转录组分析的工序； (b) 基于由上述工序（a)的结果得到的DNA片段的碱基序列，对各品种进行组装的工 序； (c) 将由上述工序（b)的结果得到的重叠群及/或单拷贝进行品种间对比，进行品种间 不同的单核苷酸多态性即SNP的搜索的工序； (d) 根据上述工序（c)的SNP搜索的结果，选择包含SNP的区域，设计用于扩增该区域 的引物的工序； (e) 通过使用上述工序（d)中设计的引物，以从啤酒花中提取的DNA为模板，确认上述 工序（d)中选择的区域可扩增，确定该碱基序列，从而确定识别区域和可扩增该识别区域 的引物的工序； (f) 使用上述工序（e)中确定的引物，以从识别对象品种的啤酒花中提取的DNA为模板 扩增识别区域，确定识别区域的碱基序列的工序；及 (g) 将上述工序（f)中确定的识别区域的碱基序列进行品种间对比，确定由用于识别 识别对象品种所必需的SNP的组合构成的识别标记的工序。
5. 根据权利要求1?3中任一项所述的方法，其特征在于，品种识别区域为包含选自序 列号9、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14及序列号15中的1个以上的 碱基序列的一部分或全部，且还包含图1、图2、图3、图4及图6中特定的单核苷酸多态性或 插入缺失部分的至少一个的区域。
6. 根据权利要求1?3中任一项所述的方法，其特征在于，品种识别区域为选自包含序 列号9表不的喊基序列的区域、包含序列号10表不的喊基序列的区域、包含序列号11表不 的喊基序列的区域、包含序列号12表不的喊基序列的区域、包含序列号13表不的喊基序列 的区域、包含序列号14表不的喊基序列的区域及包含序列号15表不的喊基序列的区域中 的1个以上的区域。
7. 根据权利要求1?3中任一项所述的方法，其特征在于，品种识别区域为不仅包含以 下：包含序列号9表不的喊基序列的区域、包含序列号10表不的喊基序列的区域及包含序 列号11表示的碱基序列的区域的3种区域，且包含以下：序列号12及/或序列号14表示 的碱基序列的一部分或全部，且还包含图4中特定的单核苷酸多态性或插入缺失部分的至 少1个的区域。
8. 根据权利要求1?3中任一项所述的方法，其特征在于，工序（i)通过使用以下引物 对的PCR反应来进行，为选自序列号1及序列号2的组合、序列号3及序列号4的组合、序 列号5及序列号6的组合及序列号7及序列号8的组合的引物对。
9. 根据权利要求1?3中任一项所述的方法，其特征在于，工序（i)通过使用以下引物 对的PCR反应来进行：不仅为以下：序列号1及序列号2的组合、序列号3及序列号4的组 合以及序列号5及序列号6的组合的3种引物对，还为序列号7及序列号8的组合的引物 对。
10. -种方法，其为由啤酒花品种间不同的单核苷酸多态性的组合构成的识别标记的 制备方法，其特征在于，所述方法包含以下工序： (a) 使用2个以上不同品种的啤酒花，进行转录组分析的工序； (b) 基于由上述工序（a)的结果得到的DNA片段的碱基序列，对各品种进行组装的工 序； (c) 将由上述工序（b)的结果得到的重叠群及/或单拷贝进行品种间对比，进行品种间 不同的单核苷酸多态性即SNP的搜索的工序； (d) 根据上述工序（c)的SNP搜索的结果，选择包含SNP的区域，设计用于扩增该区域 的引物的工序； (e) 通过使用上述工序（d)中设计的引物，以从啤酒花中提取的DNA为模板，确认上述 工序（d)中选择的区域可扩增，确定该碱基序列，从而确定识别区域和可扩增该识别区域 的引物的工序； (f) 使用上述工序（e)中确定的引物，以从识别对象品种的啤酒花中提取的DNA为模板 扩增识别区域，确定识别区域的碱基序列的工序；及 (g) 将上述工序（f)中确定的识别区域的碱基序列进行品种间对比，确定由用于识别 识别对象品种所必需的SNP的组合构成的识别标记的工序。
11. 一种核酸，其特征在于，包含通过权利要求10中所述的方法制备的识别标记的至 少一部分。
12. -种核酸，其特征在于，该核酸包含啤酒花的品种识别区域，而且，包含选自序列号 9、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14及序列号15中的1个以上的碱基 序列的一部分或全部，且还包含图1、图2、图3、图4及图6中特定的单核苷酸多态性或插入 缺失部分的至少一个。
13. -种引物，其特征在于，设计为可扩增权利要求11或12中所述的核酸。
14. 一种引物，其特征在于，由序列号1?8中任一个所记载的碱基序列组成，在此，该 引物用于啤酒花的品种识别。
15. -种探针，其特征在于，用于检测通过权利要求10中所述的方法鉴定的品种识别 区域中的啤酒花品种间不同的单核苷酸多态性。
16. -种探针，其特征在于，可在选自序列号9、序列号10、序列号11、序列号12、序列号 13、序列号14及序列号15中的1个以上的碱基序列中，检测图1、图2、图3、图4或图6中 特定的位置中的至少1个单核苷酸多态性或插入缺失位点，且由此检测啤酒花品种间不同 的单核苷酸多态性。
17. -种方法，其为检测啤酒花试样中的不同品种混入的方法，所述方法包含以下工 序： (i) 扩增从被测物啤酒花试样中提取的DNA中的包含品种识别区域的DNA片段的工序， 该品种识别区域包含由啤酒花品种间不同的至少一个单核苷酸多态性即SNP构成的识别 标记； (ii) 分析上述工序⑴中扩增的DNA片段中的品种识别区域的碱基序列，得到测序数 据的工序； (iii) 将上述工序（ii)中得到的测序数据中的构成识别标记的单核苷酸多态性位点 的信息与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息进行对比的工序；及 (iv) 确定啤酒花试样中有无不同品种混入的工序，在此，上述工序（ii)中得到的测序 数据的单核苷酸多态性位点的信息与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息一致时， 判断为无不同品种混入，或上述工序（ii)中得到的测序数据的单核苷酸多态性位点的信 息与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息不一致时，判断为有不同品种混入。
18. 根据权利要求17中所述的方法，其特征在于，进一步包含接在工序（iv)后的以下 工序： (v) 上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的测序数据的单核苷酸多态性位点的信息 与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息不一致时，由上述工序（ii)中得到的测序 数据的单核苷酸多态性位点中出现的来自正常品以外的信息特定其碱基的工序；及 (vi) 将上述工序（v)中特定的单核苷酸多态性位点的与正常品不同的碱基与识别标 记对照，从而推断或特定混入品种的工序。
19. 根据权利要求17中所述的方法，其特征在于，进一步包含接在工序（iv)后的以下 工序： (v)上述工序（iv)中，上述工序（ii)中得到的测序数据的单核苷酸多态性位点的信息 与正常品所对应的单核苷酸多态性位点的信息不一致时，由上述工序（ii)中得到的测序 数据的单核苷酸多态性位点中出现的来自正常品以外的信息特定其碱基，并求出混入比例 的工序；及 (Vi)将上述工序（V)中特定的单核苷酸多态性位点的与正常品不同的碱基与识别标 记对照，从而推断或特定混入品种和其混入比例的工序。
20. 根据权利要求1?9中任一项所述的方法，其特征在于，工序（iii)中包含有无 19?25碱基的插入序列的分析。
【文档编号】C12Q1/68GK104350151SQ201380029975
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年6月7日 优先权日:2012年6月7日
【发明者】山内启正, 古久保进 申请人:三得利控股株式会社