青花菜品种台绿1号杂交种的快速鉴定方法
【专利摘要】本发明提供了一种能够快速、准确、高效地对青花菜品种‘台绿1号’杂交种进行分子鉴定的方法，取待测样品提取基因组DNA后进行PCR扩增，PCR引物为：5’-TCTCTCTCTCTCTCTCN-3’，PCR扩增产物进行凝胶电泳成像分析，以同时扩增出约800bp和约600bp的条带，判断待测样品为‘台绿1号’杂交种单株；并可计算待测样本遗传纯度（杂交种遗传纯度=真杂交种株数÷待测样品株数×100%）。本发明使用的ISSR引物TNISSR15鉴定青花菜‘台绿1号’杂交种纯度的准确性高，与田间鉴定结果相符度达99%，结果可靠；鉴定在10天以内即可完成，避免了田间种植鉴定的繁琐程序，节约了劳动力和土地资源，鉴定成本降低；能在制种当年确定种子遗传纯度，便于种子定级与收购，提高了鉴定效率。
【专利说明】青花菜品种台绿1号杂交种的快速鉴定方法
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种青花菜品种‘台绿I号’杂交种的快速鉴定方法。
(二)【背景技术】
[0002]青花菜(Brassica oleracea var.1talica),又名绿花菜、西兰花等,是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种。其食用部分是带有花蕾群的肥嫩花茎，营养丰富，风味独特，而且具有抗癌和抗氧化功效，深受广大消费者的喜爱。近年来我国青花菜栽培面积逐年增加，对优势青花菜品种的需求也不断加大，利用杂种优势生产青花菜F1杂交种已经成为一种趋势。但是，在杂交种制种过程中母本自交，人们操作过程的相互传粉，鸟类、蜜蜂等造成的串粉都会形成假杂种，再加上青花菜杂交种种粒小且品种之间差异小，在收获、脱粒、加工、贮藏、包装、销售的过程中也容易造成混杂。目前育种者主要依靠常规大田种植对青花菜杂交种进行鉴定，但其周期长且费工、占地，易受季节限制，对当年生产的杂交种纯度难以确定，对因环境条件影响所引起的变异与本品种遗传所产生的变异区分较困难，不适应当前生产的需要。植物品种之间的差异归根结底是基因的差异，利用现代分子生物学手段从遗传基础上鉴定杂交种的真伪更加符合市场需求。
[0003]ISSR (Inter-simple sequence repeats)是一种可在没有任何分子生物学研究基础的情况下开展的新型DNA分子标记技术，它利用生物基因组中广泛存在的简单重复序列SSR (Simple Sequence Repeat)设计引物,通过PCR方法扩增基因组中两个相距较近、方向相反的SSR序列之间的区段，所获得的多个条带通过琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳得以分辨，无需预先克隆和测序。与SSR相比，ISSR在不同物种之间的通用性更强且引物开发更加容易，与RAH)相比，稳定性更高，是一种操作简单、成本低廉的检测手段，目前研究者已经利用ISSR进行水稻、黄瓜等多种作物的杂交种纯度鉴定，但是将ISSR应用于青花菜杂交种遗传纯度鉴定的却未见报道。
[0004]台绿1号’【浙(非)审蔬2011004】是台州市农科院利用材料‘Br60-2-2-l_2’和‘Β19-10-1-2-配组育成的中晚熟品种，该品种生长势较强，侧枝较少，花球高圆且紧实，球面圆整，蕾粒中细均匀，花球外观商品性好，采收期长，适宜于可做保鲜和速冻加工，适合在台州、宁波及萧山等青花菜重要产区种植，具有较好的推广前景。为保证‘台绿I号’的种子纯度，规范青花菜杂交种种子产业，保证农业用种质量，建立一套准确、快速、高效、低成本、易推广的青花菜杂交种遗传鉴定体系具有重要意义。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提出一种能够快速、准确、高效地对青花菜品种‘台绿I号’杂交种进行分子鉴定的方法，从而大大提高青花菜商品种的鉴定效率。
[0006]本发明采用的技术方案是: [0007]青花菜品种‘台绿I号’杂交种的快速鉴定方法，所述方法包括:
[0008](I)待测青花菜样品的基因组DNA的提取；可采用CTAB简易[0009]提取法快速提取青花菜幼苗基因组DNA ；
[0010](2) PCR 扩增；
[0011]扩增引物(TNISSR15)序列如下:
[0012]5， -TCTCTCTCTCTCTCTCN-3，；
[0013]PCR反应体系每15 μ L组成如下:待测样品基因组DNAlOng，10 μ M引物0.85 μ L，25mM Mg2+0.6 μ L, IOmM dNTP0.3 μ L，5U.μ L-1Taq DNA 聚合酶 0.15 μ L，10 X buffer 1.5 μ L,无菌重蒸水补齐至15 μ L ;
[0014]PCR反应条件如下:94°C预变性4min，94°C变性0.5min，51°C退火lmin，72°C延伸2min，35 个循环，72°C延伸 10min，4°C保存；
[0015](3)结果分析:取PCR产物与含8% (v/v) GelRad核酸染料的loading Buffer混合后上样于2% (w/v)琼脂糖凝胶上，电泳分离后进行凝胶成像，以同时扩增出约SOObp和约600bp的条带，判断待测样品为‘台绿I号’杂交种单株；否则不属于台绿I号’杂交种。
[0016]所述方法可进一步包括杂交种纯度计算步骤:根据步骤(3)检测结果计算待测青花菜样品的杂交种遗传纯度，所述杂交种遗传纯度=真杂交种株数+待测样品株数 X 100%O
[0017]具体的，所述步骤(1)方法如下:
[0018]①苗期取青花菜的幼嫩叶片0.2~0.5g，剪成小块，装入离心管中，同时每只离心管加入I粒不锈钢钢珠，盖好离心管盖后放入装有液氮的泡沫盒中静置10~15min，倒出液氮，快速用力摇晃泡沫盒5~IOmin ；
[0019]②打开离心管盖倒出钢珠，向离心管中加入CTAB裂解液，65±2°C水浴20~30min,所述 CTAB 裂解液组成如下:CTAB2% (w/v), EDTA20mmol/L, NaCl1.4mol/L,Tris50mmol/L, pH8.0 ；
[0020]③步骤②所得液体加入等体积的氯仿:异戊醇体积比24:1的混合液，轻轻摇晃后离心；
[0021]④取上清，加入2/3体积的预冷异丙醇(即预冷异丙醇体积为上清体积的2/3)，混匀，-20°C冰箱静置120min，离心；
[0022]⑤弃上清，取沉淀DNA用70% (v/v)乙醇洗涤，干燥后加入ddH20-20°C保存备用。[0023]采用本发明引物在母本材料中能够扩增出一条约800bp的特异标记，在父本材料中能扩增出一条约600bp的父本特异标记。只有同时具有父母本特异性条带的单株才为真正的‘台绿I号’杂交种单株，缺少其中的任意一条带记为假杂种。并可根据电泳结果分别确定真杂交种与假杂交种单株数量，计算待测杂交种的遗传纯度。
[0024]本发明的有益效果主要体现在:
[0025](I)本发明使用的ISSR引物TNISSR15鉴定青花菜‘台绿I号’杂交种纯度的准确性高，与田间鉴定结果相符度达99%，结果可靠；鉴定在10天以内即可完成，避免了田间种植鉴定的繁琐程序，节约了劳动力和土地资源，鉴定成本降低；能在制种当年确定杂交种遗传纯度，便于种子定级与收购，提高了鉴定效率。
[0026](2)本发明对DNA提取、凝胶电泳等试剂使用与实验操作都做了相应的简化处理，降低了整个操作的繁琐性。比如，在基因组DNA提取过程中，采用钢珠-液氮磨样法在短时间之内即达到研磨的效果，节约了人力、物力和时间，更适合大规模批量样本的处理。在电泳阶段，采用将GelRad核酸染料与Loading Buffer混合后再加入样品中，与常用的将核酸染料加入凝胶中或者电泳结束后利用含有核酸燃料的缓冲液浸泡等方法相比，GelRad核酸燃料使用量降低了 35%以上，节约了成本。本发明步骤简单，适合在‘台绿一号’的制种、繁种、经销企业推广中应用。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为利用引物TNISSR15扩增的‘台绿I号’亲本、杂交一代及假杂种的琼脂糖凝胶电泳图；
[0028]其中，M为marker, I为父本,2为母本;3_16为‘台绿I号’杂交一代，17-24为人为混入其中的其它青花菜材料。
[0029]图2为以2013年大田制种并随机混入少量假杂种的‘台绿I号’杂交种为待测样品杂交种鉴定的部分样品琼脂糖凝胶电泳图；
[0030]其中，M为marker，23为母本，24为父本；1_22、25_48为待测样品。
(五)【具体实施方式】
[0031]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0032]实施例1:
[0033]以‘台绿I号’亲本、杂交种以及假杂交种为材料用以证明本发明方法及其专用引物鉴定青花菜‘台绿I号’真假杂交种的可行性。
[0034](I)人为混入假杂种的‘台绿I号’样品幼苗基因组DNA的提取。其中青花菜‘台绿I号’父本和母本各一份，‘台绿I号’杂交种子14份，其它随机混杂种子8份，依次单株编号，采用CTAB简易提取法快速提取青花菜幼苗基因组DNA，具体步骤如下:
[0035]①苗期取幼嫩叶片0.2g，剪成小块，装入2mL离心管中，同时每只离心管加入I粒不锈钢钢珠(直径约0.5cm)，盖好离心管盖后放入装有液氮的泡沫盒中静置lOmin，倒出液氮，快速用力摇晃泡沫盒5min ；
[0036]②打开离心管盖倒出钢珠，向离心管中加入600 μ L CTAB裂解液，65°C水浴30min ；CTAB 裂解液组成如下:CTAB2% (w/v)，EDTA20mmol/L，NaCll.4mol/L, Tris50mmol/L, pH8.0 ；
[0037]③加入等体积 氯仿:异戊醇(24:1)轻轻摇晃数次，12000rpm离心10min ；
[0038]④取上清，加入2/3体积预冷异丙醇，混匀，_20°C冰箱静置120min，12000rpm离心IOmin ；
[0039]⑤弃上清，沉淀出的DNA用70%乙醇洗涤两次，干燥后加入ddH20-20°C保存备用。
[0040](2) PCR 引物 TNISSRl5:5，-TCTCTCTCTCTCTCTCN-3，。
[0041]PCR扩增的体系、成分及反应程序。PCR扩增反应总体系为15 μ L，体系成分为:基因组 DNAlOng，10 μ M 引物 0.85 μ L，25mM Mg2+0.6 μ L, IOmM dNTP0.3 μ L，5U.μ L-1Taq DNA 聚合酶0.15yL，lOXbufferl.5 μ L，无菌重蒸水补齐至15 μ L。
[0042]扩增程序为:94°C预变性4min，94°C变性 0.5min，51°C退火 lmin，72°C延伸 2min，35个循环，72°C延伸10min，4°C保存。
[0043](3)扩增产物的检测。取8 μ L PCR扩增产物与 1.5 μ L loading Buffer(含8%GelRad核酸染料)上样于2%琼脂糖凝胶上电泳分离，在恒定电压IOOV下电泳50min ;凝胶成像系统观察结果并拍照，检测PCR结果。
[0044]对电泳结果进行分析，结果见图1。利用引物TNISSR15在母本材料中能够产生出一条约800bp的特异条带,在父本材料中能产生一条约600bp的父本特异标记条带。14份青花菜‘台绿I号’杂交种材料均能同时扩增出与父母本特异性条带相同的条带，确定为‘台绿I号’杂交种。而混入的8份材料则不能同时扩增出父母本特异性条带，确定为假杂交种。
[0045]实施例2:
[0046]以台州农科院西兰花育种基地2013年大田制种并随机混入少量假杂种的‘台绿I号’杂交种为待测样品，随机编号，采用常规田间种植鉴定法和本发明方法分别鉴定青花菜‘台绿I号’杂交种纯度，比较两种方法的鉴定结果，进一步考察本发明方法的可行性、可靠性与时效性。
[0047]待测样品共210份，对其单株编号，进行常规田间种植鉴定和本发明方法鉴定。
[0048](I)田间种植鉴定法:2013年8月3将210份待测样品按编号顺序依次播种，9月3日移栽于大田,全生育期观察植株性状,确定真杂交种株数，根据公式“杂交种纯度=真杂交种株数+210X 100%”计算待测样品遗传纯度。
[0049](2)本发明鉴定法:待测样品基因组提取及检测方法同实例I。根据检测结果确定真杂交种株数，根据公式“杂交种遗传纯度=真杂交种株数+210 X 100%”计算待测样品遗传纯度。 [0050](3)结果显示(图2为部分样品检测结果)，利用常规田间鉴定法确定210株待测样品中共有32株假杂交种，杂交种纯度为84.8% ;根据本发明结果得知210份材料中共存在33份假杂种，杂交种遗传纯度为84.2% ;两种方法鉴定结果相符度达99.3%，基本一致。采用田间鉴定从播种到鉴定需要5~6个月时间，而本发明方法从播种到鉴定只需10天；田间种植鉴定成本包括劳动力、农药、化肥、用地等是本发明方法的所需费用的五倍以上。由此可见，本发明方法在杂交种鉴定的可行性、可靠性与时效性方面都具有明显优势，适合在‘台绿一号’的制种、繁种、经销企业推广应用。
【权利要求】
1.青花菜品种‘台绿I号’杂交种的快速鉴定方法，所述方法包括: (1)待测青花采样品的基因组DNA的提取； (2)PCR 扩增； 扩增引物序列如下:5’ -TCTCTCTCTCTCTCTCN-3’ ； PCR反应体系每15 μ L组成如下:待测样品基因组DNAlOng，10 μ M引物0.85 μ L，25mMMg2+0.6 μ L，IOmM dNTP0.3 μ L，5U.μ L-1Taq DNA 聚合酶 0.15 μ L，10 X buffer 1.5 μ L,无菌重蒸水补齐至15 μ L ; PCR反应条件如下:94°C预变性4min，94°C变性0.5min，51°C退火lmin，72°C延伸2min，35 个循环，72°C延伸 10min，4°C保存； (3)结果分析:取PCR产物与含8%GelRad核酸染料的LoadingBuffer混合后上样于2%琼脂糖凝胶上，电泳分离后进行凝胶成像，以同时扩增出约SOObp和约600bp的条带，判断待测样品为‘台绿I号’杂交种单株；否则不属于台绿I号’杂交种。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法进一步包括:根据鉴定结果计算待测青花菜样品的杂交种遗传纯度，所述杂交种遗传纯度=真杂交种株数+待测样品株数 X 100%O
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)方法如下: ①苗期取青花菜的幼嫩 叶片0.2~0.5g，剪成小块，装入离心管中，同时每只离心管加入I粒不锈钢钢珠，盖好离心管盖后放入装有液氮的泡沫盒中静置10~15min，倒出液氮，快速用力摇晃泡沫盒5~IOmin ； ②打开离心管盖倒出钢珠，向离心管中加入CTAB裂解液，65±2°C水浴20~30min，所述 CTAB 裂解液组成如下:CTAB2%，EDTA20mmol/L，NaCl1.4mol/L, Tris50mmol/L, pH8.0 ； ③加入等体积的氯仿:异戊醇体积比24:1的混合液，轻轻摇晃后离心； ④取上清，加入2/3体积的预冷异丙醇，混匀，_20°C冰箱静置120min，离心； ⑤弃上清，取沉淀DNA用70%乙醇洗涤，干燥后加入ddH20-20°C保存备用。
【文档编号】C12Q1/68GK103993073SQ201410151956
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】张志仙, 何道根, 朱长志, 檀国印 申请人:台州市农业科学研究院