一种用于防治韭菜迟眼蕈蚊的球孢白僵菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于生物防治领域的用于防治韭菜迟眼蕈蚊的球孢白僵菌(Beauveria?bassiana)菌株Lu71，该菌株已于2014年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.9252。本发明还公开了含有球孢白僵菌菌株Lu71的杀虫剂。本发明球孢白僵菌Lu71对韭菜迟眼蕈蚊毒力高，专一性强，杀虫效果好；其次，本发明属于生物防治方法，对环境无污染，对其他天敌无害，还可以替代或降低农药使用量，不存在环境污染问题。
【专利说明】一种用于防治韭菜迟眼蕈蚊的球孢白僵菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物防治【技术领域】，具体地说涉及一种用于防治韭菜迟眼蕈蚊的球孢白僵菌；以及该球孢白僵菌在防治韭菜迟眼蕈蚊上的应用。
【背景技术】
[0002]韭菜迟眼蕈蚊(Bradysia odoriphaga)，又名韭蛆，属双翅目，眼蕈蚊科，是葱蒜类蔬菜的主要害虫之一，在全国各地均有分布。韭菜迟眼蕈蚊以幼虫聚集在韭菜地下部的鳞茎和柔嫩的茎部为害。初孵幼虫先为害韭菜叶鞘基部和鳞茎的上端。春、秋两季主要为害韭菜的幼茎引起腐烂，使韭叶枯黄而死。夏季幼虫向下活动蛀入鳞茎，重者鳞茎腐烂，整墩韭菜死亡。对于韭菜迟眼蕈蚊的防治方法有物理防治(糖醋液、臭氧等)和化学防治。由于物理防治存在操作繁琐、防治效果受环境影响较大等缺点，生产上主要采用农药灌根等化学方法进行防治，但是由于韭蛆繁殖快、隐蔽性强、防治难度大，导致菜农不规范或过量、甚至违规使用禁限用高毒农药进行防治，造成环境污染、农药残留、危害人类健康问题。而生物防治由于具有见效快、专一性强、没有环境污染、以及不存在产生抗药性问题、且控制害虫持续时间长等优点，越来越引起人们重视。
[0003]球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种广谱性的昆虫病原真菌，能侵染 15 个目、149 个科的 700 多种昆虫(St Leger R J 等.Fungal as BiocontrolAgents, 2001。Blake R 等.Biol Control.2002.31(4):746-752。Felipet 等.FloridaEntomo1.2004.87(4): 533-536)，具有致病性强、不伤害其它天敌和有益生物、对人畜无毒、无残留等特点，同时球孢白僵菌具有易生产、耐储存、持效期长、使用简便等优点，因而具有广泛的应用前景。球孢白僵菌已在多种农林害虫生物防治中取得了明显成效，如利用白僵菌防治玉米螟(Pyrausta nubilalis)(徐庆丰等.昆虫学报.1973年02期)、马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus Walker)(王成树等.中国生物防治.1999年I期)、挤赠(Scarabaeoid)(徐庆丰等.中国生物防治.1997年I期)、茶小绿叶蝶(Empoasca pirisugaMatumura)(刘明炎.茶叶.2006年第3期)、韭菜迟眼蕈蚊(崔元英.农业灾害研究.2012年第I期)等已取得了较好的效果。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于提供一种用于防治韭菜迟眼蕈蚊的新的球孢白僵菌。
[0005]本发明第二目的在于提供一种杀虫剂。
[0006]本发明第三目的在于提供上述球孢白僵菌在防治蔬菜害虫上的用途。
[0007]实现本发明的技术方案如下:
[0008]本发明一种球抱白僵菌(Beauveria bassiana)菌株Lu71,该菌株已于2014年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.9252。
[0009]一种杀虫剂，所述的的杀虫剂含有上述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株Lu71。
[0010]上述杀虫剂，其剂型为分生孢子悬浮液，简称为孢悬液。
[0011]所述的分生孢子悬浮液中其分生孢子浓度为IX IO7~IX IO9个孢子/ml。
[0012]所述的分生孢子悬浮液的制备方法，包括将孢子粉按比例与含有0.05% (v/v)吐温80的水溶液混合均匀，制成孢子悬浮液。所述的孢子粉按照通常的方法制备即可。
[0013]上述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Lu71在防治蔬菜害虫上的应用。
[0014]所述的蔬菜害虫是指双翅目害虫。
[0015]所述的双翅目害虫是指眼蕈蚊科害虫。
[0016]所述的眼蕈蚊科害虫是指韭菜迟眼蕈蚊(Bradysia odoriphaga)。
[0017]本发明实施方法，在韭蛆发生初期，将Lu71孢子悬浮液直接兑水稀释成IX IO7~I X IO9个孢子/ml，用普通农用喷雾器喷洒于韭菜根部；喷洒间隔5-7天，连续喷药3次，以达到持续控害的效果。
[0018]本发明球孢白僵菌菌株Lu71的采集和筛选过程，以及形态鉴定分类:本发明球孢白僵菌菌株Lu71是河北 省农林科学院植物保护研究所于2013年6月在河北邢台韭菜田采集的土样中离得到的。具体过程如下:2013年6月在河北邢台韭菜田中距表层3-15cm处采集耕作土壤30g左右，装入灭菌样品袋中，记录采集地点及时间；取l_2g 土样放入装有灭菌水50mL和玻璃珠的三角瓶中，在摇床上振荡30min，将土粒打碎，然后静置2h ;将静置后的处理液，分别吸取200yL至SDAY平板培养基(其组成成分及其比例为:蛋白胨10g，酵母10g，葡萄糖40g，琼脂15g，蒸馏水1000mL,自然pH)上，涂布均匀，25 土 TC恒温光照(14L: 10D)培养5d;观察挑取具有疑似白僵菌菌落的平皿，继续观察培养至产孢，将疑似白僵菌菌落在SDAY平皿中划线培养，观察发现菌落初期白色茸状，产孢时乳白色，孢子层厚且均匀，中心至边缘呈丘状凸起，具同心纹；菌丝具分枝分隔，透明、光滑，有时成簇生长；产孢细胞浓密簇生于短而膨大的柄细胞上，产孢细胞上部“之”字形，顶端渐变细长；分生孢子为近球形，单细胞，孢子大小为1.1-2.2X1.5-2.7 μ m。这些特征与《真菌鉴定手册》(魏景超编著.上海科学技术出版社.1979年)中描述的球孢白僵菌属形态特征基本一致，初步判定该菌株属于球孢白僵菌(Beauveria bassiana),命名为Lu71。将分离到的球孢白僵菌至SDAY平皿中均匀涂布，25± I°C恒温光照(14L: 10D)培养至产孢，将孢子粉刮取至灭菌冷冻瓶中，用无菌水稀释，冷冻干燥，研磨后_20°C保存。将所得球孢白僵菌分生孢子配制成IO8孢子/ml孢子悬浮液，对韭菜迟眼蕈蚊2龄幼虫进行生物测定，结果(见图1)显示球孢白僵菌菌株Lu71对韭菜迟眼蕈蚊2龄幼虫具有较高杀虫活性，3d校正死亡率达到72%。
[0019]Lu71的分子分类鉴定:
[0020]按照如下方法进行:利用Lu71的菌丝体提取DNA，然后以所提取的DNA为模板，以真菌ITS区通用引物ITS-4和ITS-5(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)为引物进行PCR扩增，扩增所得产物为Lu71的ITS序列；所述的ITS-4和ITS-5引物序列如下:
[0021]ITS-4:5/ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' , (SEQ ID No:1),
[0022]ITS-5:5/ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' ， (SEQ ID No:2)；
[0023]PCR扩增的反应体系(50 μ L)为:无菌水40 μ L，DNA模板I μ L，10XPCRBuffer5 μ L, Taq DNA 聚合酶(5U/L) 0.5 μ L，10mmol/mL dNTPl μ L，10mmol/mLITS-41.5μ L, lOmmol/L ITS-51.5μ L0 PCR 反应条件:95 °C 4min，94 °C lmin,54°C lmin,72°C 2min，35个循环；72°C延伸2min。取PCR产物3 μ L，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，然后送交北京华大基因进行测序，测序结果见SEQ ID No:3。将测序所得SEQ ID No:3所示的核苷酸序列于Genbank数据库中进行同源性BLAST比对，结果(见图2)与Lu71菌株ITS序列最大同源性为99%以上的菌株是球孢白僵菌，说明Lu71在分类上属于球孢白僵菌(Beauveria bassiana);同时对比结果显示Lu71的ITS序列与任何其他球孢白僵菌菌株的ITS序列都不相同，说明Lu71为一种新的球孢白僵菌菌株。
[0024]本发明具有的有益效果:本发明球孢白僵菌Lu71对韭菜迟眼蕈蚊毒力极高，专一性强，杀虫效果好；其次，本发明属于生物防治方法，对环境无污染，对其他天敌无害，还可以替代或降低农药使用量，属于环境友好型；此外，本发明含有球孢白僵菌Lu71的杀虫剂生产方法简单，使用方法简单。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为被球孢白僵菌菌株Lu71感染的韭菜迟眼蕈蚊幼虫照片。
[0026]图2为本发明球孢白僵菌菌株Lu71分子分类鉴定系统发育树。
【具体实施方式】
[0027]实施例1、球孢白僵菌菌株Lu71孢子悬浮液的制备
[0028]按照如下方法进行:
[0029]将球抱白僵菌(Beauveria bassiana)菌株Lu71 (已于2014年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.9252)接种于SDAY平板培养基(SDAY平板培养基的组成成分及其重量比为:蛋白胨10g，酵母10g，葡萄糖40g，琼脂15g，蒸馏水1000mL,自然pH)上，在25± 1°C恒温光照(14L: 10D)培养IOd至产孢。用接种环刮取分生孢子至体积百分比为0.05% (v/v)无菌吐温80 (分析纯生化试剂)水溶液中，经磁力搅拌器搅拌30min，获得纯孢子悬浮液，经血球计数板计数孢子浓度为5X IO8孢子/ml，用蒸馏水梯度稀释至浓度为I X 105、1X 106、1X 107、1X 108、5 X IO8孢子/ml的孢子悬浮液。
[0030]实施例2:本发明球孢白僵菌菌株Lu71对韭菜迟眼蕈蚊的杀虫药效试验
[0031]将灭菌平皿倒入含1.5%琼脂的灭菌水溶液3_，上铺双层滤纸保湿，将韭菜剪成IOmm韭菜段，浸泡在实施例1制备的浓度分别为1X105、1X106、1X107、1X108、5X108孢子/mL的Lu71孢子悬浮液中lOmin，取出放置在上述平皿中，接种实验室人工饲养的大小一致、健康活泼的韭菜迟眼蕈蚊二龄幼虫，置于25°C、光周期14h:10h(L:D)条件下饲养，将新鲜韭菜叶饲喂韭菜迟眼蕈蚊幼虫。每处理韭菜迟眼蕈蚊幼虫30头，设3次重复，以0.05%(V/V)吐温-80水悬液处理作为对照，对照自然死亡率在5%内且无僵虫视为有效实验。施药后定期调查死亡虫数，并及时更换新鲜韭菜叶以确保韭菜迟眼蕈蚊幼虫食物供给充沛，数据统计分析应用SPSS18.0软件进行数据处理。
[0032] 结果(见表1)显示球孢白僵菌Lu71浓度为I X IO7孢子/mL的孢子悬浮液对韭菜迟眼蕈蚊2龄幼虫4、6天的校正死亡率分别为60.03%和87.84%;浓度为I X IO8孢子/mL的孢子悬浮液对韭菜迟眼蕈蚊2龄幼虫2、4、6天的校正死亡率分别为34.43%,73.34%,96.73%。说明Lu71对韭菜迟眼蕈蚊2龄期的幼虫有很高的杀虫活性。[0033]表1本发明球孢白僵菌Lu71对韭菜迟眼蕈蚊2龄幼虫的毒力试验结果
[0034]
【权利要求】
1.一种球抱白僵菌(Beauveria bassiana)菌株Lu71,该菌株已于2014年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.9252。
2.一种杀虫剂，其特征在于所述的的杀虫剂含有权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株 Lu71。
3.按照权利要求2所述的杀虫剂，其特征在于其剂型为分生孢子悬浮液。
4.按照权利要求2所述的杀虫剂，其特征在于所述的分生孢子悬浮液中其分生孢子浓度为I X IO7~I X IO9个孢子/ml。
5.权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)Lu71在防治蔬菜害虫上的应用。
6.按照权利要求 5所述的应用，其特征在于所述的蔬菜害虫是指双翅目害虫。
7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于所述的双翅目害虫是指眼蕈蚊科害虫。
8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于所述的眼蕈蚊科害虫是指韭菜迟眼蕈蚊(Bradysia odoriphaga)。
【文档编号】C12N1/14GK103981108SQ201410244148
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】宋健, 曹伟平, 杜立新, 王金耀, 冯书亮 申请人:河北省农林科学院植物保护研究所