口腔癌致病基因bpifb2及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及口腔癌致病相关基因BPIFB2及其应用。本发明通过对口腔癌组织、癌旁组织及正常组织提取RNA，转录组深度测序分析，筛选到一个口腔癌致病相关基因BPIFB2，并采用RT-PCR方法分析筛选到的BPIFB2在口腔癌患病病人的肿瘤组织、癌旁组织表达情况，结果显示筛选得到的BPIFB2与口腔癌具有很好的相关性，可用于制备口腔癌辅助诊断或者预后制剂。本发明还公布了一种检测口腔癌组织中BPIFB2表达水平的荧光定量PCR试剂盒及其使用方法，所述试剂盒能灵敏、快速、定量、准确、稳定的检测口腔癌组织中BPIFB2表达水平，具有良好的应用前景。
【专利说明】口腔癌致病基因BPIFB2及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程【技术领域】，具体地，本发明涉及通过高通量转录组测序分析 筛选出口腔癌致病基因 BPIFB2及所述致病基因在制备口腔癌辅助诊断或者预后制剂中的 应用。
【背景技术】
[0002] 口腔癌（Oral Squarmous Cell Carcinomas,0SCC)是人体常见的肿瘤之一，尤其是 在发展中国家印度、斯里兰卡、巴西等其发病率可以达到全部肿瘤的25%。近年来口腔癌 的发病率在欧美等发达国家有明显的上升趋势，特别是发病年龄趋向年轻化。口腔鳞癌不 仅发病率高，且恶性程度较高；往往造成语音、咀嚼、吞咽、面容等功能障碍和严重的面容毁 损，并威胁到患者的生命；五年生存率只有60%左右。尽管近来口腔癌手术方法的不断改 进和放疗、化疗的广泛应用，但口腔癌的五年生存率并没有明显的提高。
[0003] 导致这一状况的主要原因在于：口腔癌的发病机制不清，侵袭转移机制不明，缺乏 有效的早期预防和预后判断手段。因此研究口腔癌发生和发展的分子机制，从中找到口腔 癌早期预防、预后判断和治疗方法是口腔癌研究中急待解决的重大问题。
[0004] 转录组学是研究活细胞在某一功能状态下所含信使RNA (Messenger RNA，mRNA)的 类型和拷贝数，反应了某一特定时间和空间细胞内所有基因的表达情况。转录组动态反应 了细胞的生长发育状态，不同生理、病理状态下以及不同细胞类型都具有细胞特异的转录 组，了解转录组是解读细胞的分子功能、组成成分及其完成的生物过程所必需的，对我们理 解生命体机体发育、疾病发生与预防都具有重要作用。
[0005] 以Roche454，Illumina Solexa和ABI SOLiD为代表的第二代测序技术的出 现，使得大规模应用基因组和转录组学方法解决科学问题成为可能。mRNA测序（mRNA sequencing, mRNA-Seq)是把mRNA逆转录生成的cDNA，利用第二代高通量测序技术进行 cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织样本在某一状态下几乎所有转录本表 达丰度的信息。各类型的转录本都可以采用同样的原理用高通量测序技术进行深度测序， 来反应它们的表达水平，统称为RNA-Seq。伴随着二代测序平台的商业化，尤其是RNA-Seq 技术的应用，上千万甚至是上亿的通量测序极大的提高了转录组测序的深度和覆盖度，使 得定性和定量分析转录组成为可能，推动了转录组学的快速发展。目前已广泛应用到生物 医学的各个领域并取得突出进展，使我们对于疾病的分子与遗传学基础的认识达到了一个 新的水平。这些研究成果对于阐明疾病的病因、解析疾病发生的分子机制、寻找疾病特异的 生物标志物和药物靶点，进而提升疾病的预防、诊断和治疗水平具有重要意义。
[0006] 发明人通过Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台选取8例口腔癌癌变、 癌旁及正常组织的转录组深度测序分析，初步筛选出影响口腔癌发生发展的相关基因 BPIFB2,并进一步采用分子生物学方法证实了 BPIFB2基因与口腔癌的关系：BPIFB2与口腔 癌具有很好的相关性，可用于制备口腔癌辅助诊断或者预后制剂，具有重要的临床应用价 值。
【发明内容】
[0007] 本发明目的是提供了 口腔癌致病相关基因 BPIFB2。
[0008] 本发明目的是提供了一种检测BPIFB2表达水平的荧光定量PCR试剂盒。
[0009] 进一步，本发明还提供了一对检测BPIFB2表达水平的荧光定量PCR引物。
[0010] 进一步，本发明还提供了一种检测BPIFB2表达水平的荧光定量PCR试剂盒使用方 法。
[0011] 本发明目的是提供BPIFB2基因在制备口腔癌的诊断或者预后产品中的应用。
[0012] 为实现上述目的，本发明对癌变、癌旁及正常组织的三组样品进行高通量cDNA测 序，检测到癌变与癌旁组织之间有252个差异表达基因，癌变与正常组织之间有234个差 异表达基因，为了更好的理解差异表达基因的功能，发明人对表达失调的基因进行Gene Ontology的功能富集分析。最终从差异表达基因中筛选出BPIFB2。
[0013] 本发明运用荧光定量PCR方法分析筛选到的口腔癌致病基因 BPIFB2在口腔癌患 病病人的肿瘤组织和癌旁组织的表达情况。
[0014] 为了实现上述目的，本发明首先分别提取了 50例口腔癌患病病人的肿瘤组织和 癌旁组织，对其总RNA的进行提取，设计了用于扩增BPIFB2基因的2条引物SEQ ID NO. 1和 SEQIDN0. 2,用于扩增内参基因β-actin的2条引物。制备了含有BPIFB2基因序列的标 准DNA模板，并进行了敏感性实验。进而，采用qRT-PCR的方法比较BPIFB2基因在口腔癌 组织和癌旁组织中的表达水平。结果表明：qRT-PCR扩增结果稳定，其中BPIFB2在癌旁组织 中的表达水平明显低于口腔癌瘤组织和对照质粒lOOcopies，而在口腔癌组织中的BPIFB2 高表达，即生物信息学筛选得到的BPIFB2基因与口腔癌具有很好的相关性，可用于制备口 腔癌辅助诊断或者预后制剂。
[0015] 本发明目的是提供了一种检测BPIFB2表达水平的荧光定量PCR试剂盒及其使用 方法。该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定 量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0016] 本发明制备的一种检测BPIFB2表达水平的荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性 引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物， 上游引物序列为SEQ ID N0. 1，下游引物序列为SEQ ID N0. 2。所述内参引物为β -actin内参 引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 3,下游引物序列为SEQ ID NO. 4。所述荧光定量PCR反应液 包括 2 XUltralSYBR One Step RT-qPCR Buffer (With R0X)、SuperEnzyme Mix 和 RNase-Free Water。
[0017] 本发明还公开了一种检测BPIFB2表达水平的荧光定量PCR试剂盒的使用方法， 荧光定量PCR体系：上游引物；下游引物；样品RNA10pg-100ng ;2XUltralSYBR One St印 RT-qPCR Buffer (With R0X)，SuperEnzyme Mix，加 RNase-Free Water 至 25 μ L。突光定量 PCR 程序：45°C lOmin ;95°C 5min 预变性，接 30-40 个循环：95°C 10s，60°C 45s。
[0018] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。
[0019] 所述的试剂盒应用于口腔癌BPIFB2基因的定量检测，一步法荧光定量PCR，方便 快速，适用于临床检测。
[0020] 本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为106-10 2c〇pieS/ μ 1，最小检出浓度为lOOcopies/μ 1。
[0021] 本发明优点：
[0022] (a)本发明提供的BPIFB2与口腔癌具有很好的相关性，可用于制备口腔癌辅助诊 断或者预后制剂。
[0023] (b)本发明提供的检测BPIFB2表达水平的荧光定量PCR试剂盒包含了从RNA提取 到荧光定量实验所用的整套试剂，并且采用了一步法荧光定量PCR，既方便临床使用，又保 证了结果的一致性。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0025] 实施例1研究样本的收集及RNA的提取
[0026] 收集8例口腔癌及正常新鲜组织，对其进行分组及编号：3例正常组织块（编号为 Nl、N2、N3)、3例癌旁组织（编号为PI、P2、P3)块和2例癌组织块（C1和C2)。
[0027] 对三组样品进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳。从电泳结果初步认为提 取的RNA样品质量合格，可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDroplOOO分光光度 计检测RNA样品的提取情况，结果如表1所示。每个样品体积均为30μ1。RNA-seq测序的 样品要求：0D260/0D280 为 1. 8-2. 2。RIN(RNA integrity number)指的是 RNA 完整性指数， 是RNA质量的重要指标。从表1可以看出，本研究的样品均达到转录组测序的要求。
[0028] 表1 口腔癌RNA样品的分光光度检测
[0029]
【权利要求】
1. 一种BPIFB2基因在制备口腔癌的诊断或者预后产品中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的口腔癌的诊断或者预后产品包括 用RT-PCR、基因芯片或免疫方法检测口腔癌中BPIFB2基因的产品。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的用于RT-PCR检测口腔癌中BPIFB2 基因的产品含有一对特异性扩增BPIFB2基因的引物；所述的基因芯片包括与BPIFB2基因 的核酸序列杂交的探针；所述用免疫方法检测口腔癌的产品包括与BPIFB2蛋白特异性结 合的抗体。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述一对特异性扩增BPIFB2基因的引物 上游引物序列为SEQ ID NO. 1，下游引物序列为SEQ ID NO. 2。
5. -种检测口腔癌相关基因 BPIFB2的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物包括上游引物和下游 引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 1，下游引物序列为SEQ ID NO. 2。
7. 根据权利要求5或6任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含RNA 抽提试剂。
8. 根据权利要求5-7任意一项所述的试剂盒，其特征在于，荧光定量PCR体系：上游引 物、下游引物、样品 cDNA、2 XUltralSYBR One Step RT-qPCR Buffer (With R0X)，SuperEnzyme Mix，RNase-Free Water ;突光定量 PCR 程序：45°C lOmin ;95°C 5min 预变性，接 30-40 个循 环：95°C 10s，60°C 30s。
9. 一种权利要求5-8任意一项所述的试剂盒在制备口腔癌辅助诊断或者预后制剂中 的应用。
【文档编号】C12Q1/06GK104059982SQ201410315624
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】杨承刚, 李红伟, 常鹏, 孙锦云 申请人:杨承刚