一种基于荧光pcr技术检测esr1基因突变的方法
【专利摘要】本发明提供一种基于荧光PCR快速准确检测ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G四种突变的方法，能够避免假性结果产生、灵敏度高、适应范围广、节省耗材和时间。针对四种突变分别设计的上游引物:5’-GAACGTGGTGCCCCTCcC-3’5’-GAACGTGGTGCCCCTgTG-3’5’-AGAACGTGGTGCCCCaCA-3’5’-ACGTGGTGCCCCTCTATtG-3’；设计的一条共通的下游引物:5’-CACGGCTAGTGGGCGC-3’设计的一条共通的TaqMan荧光探针：5’-FAM-CTGGAGATGCTGGACGCCCAC-BHQ2-3’。
【专利说明】-种基于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测ESR1基因突变的方法。
【背景技术】
[0002] 人类雌激素受体 a (Estrogen receptor alpha, ESR α )由 ESR1 (Estrogen Rec印tori)基因编码。ESRa与其配体雌激素结合后，可激活细胞内一系列的细胞生物学 效应。ESR1基因的突变和异常表达均与乳腺癌等疾病的发生有关。
[0003] ESR1基因最为常见的突变类型为Y537S，Y537C，Y537N以及D538G。这些突变使得 ESR α的构象改变，其可在不与雌激素结合的情况，表现为持续性激活状态。
[0004] 目前已报道的应用于检测ESR1突变的方法的为直接测序技术和二代测序技术。 其中直接测序技术成本低，准确性高，然而需要PCR后处理步骤，既操作复杂，又容易发生 污染，产生假性结果；且该方法灵敏度不足，不能完全适应临床样本的复杂情况。二代测 序技术灵敏度高，但其依赖于昂贵的仪器和分析软件，检测成本大大增加，难以作为普适技 术。
[0005] 等位基因特异性 PCR(Allele-specific PCR),也称为 ARMS (Amplification Refractory Mutation System)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增 而达到检测基因突变的方法。其核心原理是根据PCR过程中DNA聚合酶引导的引物延伸从 引物的Y末端开始，而引物：V末端的碱基与模板的互补配对程度强烈影响聚合酶的识 别作用和PCR反应的进行：若这个碱基与模板正常互补配对（A-T，G-C)，则引物可以不间断 延伸，PCR得以高效进行，得到完整的产物；反之，若这个碱基与模板非正常配对，则引物的 延伸受到阻滞，PCR效率大大降低。故将与突变位点对应的碱基放置在引物的3'末端，同 时在必要时人为引入其他碱基的错位配对，便可以达到选择性扩增某种等位基因的作用。 将ARMS技术与以TaqMan探针为基础的荧光PCR结合起来，便可以达到快速准确检测基因 突变的目的。
【发明内容】
[0006] 为了克服传统检测技术的缺陷，本发明提供一种基于荧光PCR快速准确检测ESR1 基因 Y537S，Y537C，Y537N以及D538G四种突变的方法，即通过设计等位基因特异性引物，结 合TaqMan探针技术，在一个反应中快速准确检测ESR1基因突变。
[0007] 为实现以上发明目的，本发明的基本技术方案如下：
[0008] 基于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的方法，用于非疾病诊断目的，包括以下环 节：
[0009] (1)引物及荧光探针设计：
[0010] 针对ESR1基因 Y537S，Y537C，Y537N以及D538G这四种突变分别设计等位基因特 异性引物，均作为上游引物，序列如下：
[0011] Y537S: 5，-GAACGTGGTGCCCCTCcC-3 '
[0012] Y537C: 5，-GAACGTGGTGCCCCTgTG-3 '
[0013] Y537N: 5，-AGAACGTGGTGCCCCaCA-3 '
[0014] D538G: 5 ' -ACGTGGTGCCCCTCTATtG-3 '
[0015] 其中小写字母表示的碱基为人为引入的错配，以增强检测的特异性；
[0016] 针对四种突变设计一条共通的下游引物，序列如下：
[0017] Rp: 5，-CACGGCTAGTGGGCGC-3，
[0018] 针对四种突变设计一条共通的TaqMan荧光探针，其序列及修饰如下：
[0019] Probe: 5 ' -FAM-CTGGAGATGCTGGACGCCCAC-BHQ2-3 '
[0020] 针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合，作为内质控体系，其序列如下：
[0021] ALB Fp (上游引物）：5 ' -TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3 '
[0022] ALB Rp (下游引物）：5 ' -GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3 '
[0023] ALB Probe (探针）：5，-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3，
[0024] 其中，FAM 为 6-carboxyfluorescein ;HEX 为 6-carboxy-hexachlorofluorescein ; BHQ2 为 Black Hole Quencher-2 ;
[0025] (2)模板的制备：提取待测样本的基因组DNA ;
[0026] (3)建立荧光实时定量PCR反应体系：
[0027] 以反应体系总量为20 μ L计，在同一个反应体系中，分别加入Y537S等位基因 特异性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特异性上游引物250ηΜ-500ηΜ，Υ537Ν等 位基因特异性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特异性上游引物250ηΜ-500ηΜ，下 游引物（Rp)250nM-500nM，TaqMan荧光探针100ηΜ-250ηΜ，以及ALB基因特异性上游引物 250ηΜ-500ηΜ、下游引物 250ηΜ-500ηΜ、探针 100nM-250nM、2XRealtimeMastermixl0y L、待 测样本基因组DNA10-50ng，使用PCR等级的H20补足体积20 μ L ;
[0028] (4)结果判定：将配制好的各反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，根据仪 器给出的ESR1基因与ALB基因的扩增指标（Ct值），即FAM通道和HEX通道的扩增情况来 进行结果判定。对结果的判断分以下四种情况进行：
[0029] 第一种情况，若样本在FAM通道和HEX通道均呈现正常扩增，则该样本携带有ESR1 基因 Y537S，Y537C，Y537N或D538G四种突变中的一种或几种；
[0030] 第二种情况，若样本在FAM通道没有正常扩增，而在HEX通道扩增情况正常，则表 明该样本未携带有ESR1基因 Y537S，Y537C，Y537N或D538G四种突变，或该样本的突变比例 低于了本设计的检测限。
[0031] 第三种情况，若样本表现为在FAM通道呈现正常扩增，而在HEX通道没有正常 扩增，则是由于ESR1基因的扩增抑制了 ALB基因的扩增，表明该样本携带有ESR1基因 Y537S，Y537C，Y537N或D538G四种突变中的一种或几种，同第一种情况。
[0032] 第四种情况，若样本在FAM通道和HEX通道均没有正常扩增，则表明该样本DNA质 量过差或加入的DNA样本量不足，需要重新进行检测。
[0033] 上述荧光实时定量PCR反应的最佳扩增参数为：
[0034] 95?，2 ?15min，不循环；
[0035] 95°C，5 ?15sec ;6(TC，40-60sec ;共计 40 个循环。
[0036] 相应的，本发明还提供一种用于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的试剂盒，其特 点是：包括上述针对ESR1基因 Y537S，Y537C，Y537N以及D538G这四种突变分别设计的上游 引物、共通的下游引物、共通的TaqMan荧光探针以及作为内质控体系的另一特异性引物探 针组合。当然，通常还有2XRealtime 1\&18七61'111丨11〇4]^、？0?等级的!120。
[0037] 这里，作为内质控体系的另一特异性引物探针组合并不局限于上述针对ALB基因 设计的序列特异性引物探针组合，本发明将其视为较佳的内质控体系。
[0038] 具体以试剂盒中的试剂总量20 μ L计，各试剂的较佳用量分别为：Y537S等位基 因特异性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537N等 位基因特异性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特异性上游引物250nM-500nM，下 游引物（Rp)250nM-500nM，TaqMan荧光探针100nM-250nM，以及ALB基因特异性上游引物 250nM-500nM、下游引物 250nM-500nM、探针 100nM-250nM，2 X Realtime MastermixlO μ L、 PCR等级的Η20补足体积。
[0039] 本发明具有以下优点：
[0040] 1.避免假性结果产生。在本发明中，针对ESR1基因 Y537S，Y537C，Y537N以及 D538G四种突变设计的特异性引物具有很高的位点特异性；同时没有PCR后操作，避免了交 叉污染，二者共同保证了检测的准确性，避免了假性结果的产生。
[0041] 2.灵敏度高。在本发明中，只需20ng基因组DNA便可以进行准确的ESR1基因突 变检测，相比于传统的技术，大大提高了检测的灵敏度。
[0042] 3.适应范围广。基于本设计中PCR反应的特点，本发明可以适用于新鲜活检组织， 石蜡包埋组织等不同类型样本的检测。
[0043] 4.节省耗材和时间。基于本实验中设计和PCR反应的特点，使得该方法可以很大 程度上节省实验时间和耗材，样本可以在一个反应中完成检测，PCR过程只需要60min，整 个实验也可以在4小时内全部完成。
【专利附图】
【附图说明】
[0044] 图1为本发明所设计的ESR1基因四种突变特异性及探针的示意图。
[0045] 图2为本发明一个实施例的实验结果图。
[0046] 图3为本发明另一个实施例的实验结果图。
【具体实施方式】
[0047] 对一个特点的突变类型而言，根据碱基变化的形式、是否引入人为的错配碱基以 及引入错配碱基的位置和数量的不同，可设计的等位基因特异性引物达十余种之多，且目 前缺少可靠的资料来正确指导对这些潜在引物进行理论上的优选。所以，为了达到检测反 应最佳的灵敏度和特异性，则需将所有可设计的等位基因特异性引物进行逐一尝试。因此， 仅建立一个特定突变的反应体系便需要反复的设计和尝试，且难以参考其他的成功例子。 对于ESR1基因的四种类型突变而言，若分别建立四个单独的反应体系，则至少需要进行数 十次设计和尝试才可以达到最佳的设计。然而，若想在一个反应体系中同时完成对四种突 变的检测，情况则更为复杂。首先，由于四种突变的在碱基序列上相邻，造成了引物之间的 相互干扰，故不能简单的将单独检测体系中最佳引物加以混合，而是开始就应在一个整体 的理念下进行设计，这种情况下可设计引物组合便多达上千种；其次，引物对及荧光探针是 一个不可分割整体，为了协调扩增片段大小、扩增效率以及扩增特异性等因素，则需要更多 不同的尝试。因此，在一个单独的反应中同时对ESR1基因的四种突变进行高灵敏高特异的 检测需要非常精确的设计。
[0048] 最终，本发明提出以下设计方案：
[0049] (1)引物及荧光探针设计：
[0050] 针对ESR1基因 Y537S，Y537C，Y537N以及D538G四种突变分别设计等位基因特异 性引物，均作为上游引物，序列如下：
[0051] Y537S: 5，-GAACGTGGTGCCCCTCcC-3 '
[0052] Y537C: 5，-GAACGTGGTGCCCCTgTG-3 '
[0053] Y537N: 5，-AGAACGTGGTGCCCCaCA-3 '
[0054] D538G: 5 ' -ACGTGGTGCCCCTCTATtG-3 '
[0055] 其中小写字母表示的碱基为人为引入的错配，旨在增强检测的特异性。
[0056] 针对四种突变设计一条共通的下游引物，序列如下：
[0057] Rp: 5 ' -CACGGCTAGTGGGCGC-3 '
[0058] 针对四种突变设计一条共通的TaqMan荧光探针，其序列及修饰如下：
[0059] Probe: 5 ' -FAM-CTGGAGATGCTGGACGCCCAC-BHQ2-3 '
[0060] 弓丨物及TaqMan探针的位置如图1所示。
[0061]同时针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合，作为内质控体系，其序列信 息如下：
[0062] ALB Fp (上游引物）：5，-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3 '
[0063] ALB Rp (下游引物）：5 ' -GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3 '
[0064] ALB Probe (TaqMan 突光探针）：
[0065] 5, -HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3，
[0066] 其中，FAM 为 6-carboxyfluorescein ;HEX 为 6-carboxy-hexachlorofluorescein ; BHQ2 为 Black Hole Quencher-2
[0067] (2)模板的制备：提取待测样本的基因组DNA ;
[0068] (3)实时定量PCR:针对步骤（1)中的所设计的引物及TaqMan荧光探针，建 立待测样本的检测体系：每个被测样本的反应体系为20 μ L，在一个反应体系中，分别 加入Y537S等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特异性上游引物 250ηΜ-500ηΜ，Υ537Ν等位基因特异性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特异性上游引 物 250nM-500nM，下游引物（Rp)250nM-500nM，TaqMan 荧光探针 100nM-250nM，以及 ALB 基 因特异性上游引物 250nM-500nM、下游引物 250nM-500nM、探针 100nM-250nM、2XRealtime MastermixlO μ L、被测样本基因组DNA约10_50ng，使用PCR等级的H20补足体积20 μ L ;
[0069] (4)结果判定：将配制好的各反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，扩增过 程参数为：95°C，2?15min，不循环；95°C，5?15sec，60°C，40-60sec，共计40个循环。根 据仪器给出的ESR1基因与ALB基因的扩增指标（Ct值），即FAM通道和HEX通道的扩增情 况来进行结果判定。对结果的判断分以下四种情况进行：
[0070] 第一种情况，若样本在FAM通道和HEX通道均呈现正常扩增，则该样本携带有ESR1 基因 Y537S，Y537C，Y537N或D538G四种突变中的一种或几种；
[0071] 第二种情况，若样本在FAM通道没有正常扩增，而在HEX通道扩增情况正常，则表 明该样本未携带有ESR1基因 Y537S，Y537C，Y537N或D538G四种突变，或该样本的突变比例 低于了本设计的检测限。
[0072] 第三种情况，若样本表现为在FAM通道呈现正常扩增，而在HEX通道没有正常 扩增，则是由于ESR1基因的扩增抑制了 ALB基因的扩增，表明该样本携带有ESR1基因 Y537S，Y537C，Y537N或D538G四种突变中的一种或几种，同第一种情况。
[0073] 第四种情况，若样本在FAM通道和HEX通道均没有正常扩增，则表明该样本DNA质 量过差或加入的DNA样本量不足，需要重新进行检测。
[0074] 下面以制备的人胚肾HEK-293细胞系基因组DNA和4种突变型ESR1基因克隆质 粒（作为样本），按照本发明的突变检测方法，进行实验说明，以体现本发明的技术效果。
[0075] 将ESR1基因为野生型的人胚肾HEK-293细胞系基因组DNA (野生型模板）及四种 突变型ESR1基因克隆质粒（突变型模板）分别进行提取，并使用Nanodrop核酸定量仪定 量。使用TE缓冲液对DNA模板进行稀释，将HEK-293细胞系基因组DNA稀释至20ng/ μ L， 将所有质粒模板稀释至浓度为〇. 〇〇〇〇lng/ μ L (该浓度质粒的ESR1基因拷贝数非常接近于 20ng基因组DNA中ESR1基因的拷贝数）。取部分稀释好的HEK-293细胞系基因组DNA和 4种突变型ESR1基因克隆质粒，分别按照一定梯度比例混合制备得到混合型模板（该梯度 比例将直接体现本技术的检测灵敏度），将稀释好的4种突变型质粒分别与HEK-293细胞系 基因组DNA按ESR1基因拷贝数1:9(10% ),1:19(5% ),1:99(1% )混合制备混合型模板。 以Y537S突变为例，将10 μ L浓度为0. OOOOlng/ μ L的Y537S突变突变型质粒溶液加入到 90 μ L浓度为20ng/ μ L的HEK-293细胞系基因组DNA溶液中，便制备成Y537S突变比例为 10%的混合型模板；然后将该混合型模板继续按一定比例与HEK-293细胞系基因组DNA混 合，便可以制备成Y537S突变比例为5%及1%的混合型模板。其他三种突变类型的混合型 模板的制备情况与次相同。
[0076] 同时配制多个反应体系，在每一个反应体系中，分别加入Y537S等位基因特异性 上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537N等位基因 特异性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特异性上游引物250nM-500nM，下游引物 (Rp)250nM-500nM，TaqMan荧光探针100nM-250nM ;体系中同时加入ALB基因特异性上游引 物 250nM-500nM，下游引物 250nM-500nM，TaqMan 荧光探针 100nM-250nM，以及 2XRealtime MastermixlO μ L ;在各反应体系中分别加入20ng的HEK-293细胞系基因组DNA，0. OOOOlng 的四种突变型质粒，以及所制备的各混合型模板，以及PCR等级的H20(作为无模板对 照）。上述扩增过程的最佳扩增参数为：95°C，2?15min，不循环；95°C，5?15sec，60°C， 40_60sec，共计40个循环。
[0077] 将配制好的各反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，根据仪器给出的ESR1 基因与ALB基因的扩增指标（Ct值），即FAM通道和HEX通道的扩增情况来进行结果判定。 实验结果如图2所示。
[0078] 请参阅图2所示，使用本发明所设计的技术体系，在FAM通道中，所有含有突变 型ESR1基因的模板（质粒和各混合型模板）均呈现出正常扩增，而ESR1基因为野生型的 HEK-293细胞系基因组DNA则没有扩增；同时在HEX通道中，ESR1基因为野生型的HEK-293 细胞系基因组DNA则呈现出正常扩增情况。按本设计的结果判定标准，所有含有突变型 ESR1基因的模板均判断为携带本发明所覆盖的ESR1基因突变（第一或第三种情况），而 HEK-293细胞系基因组DNA则判断为本未携带有ESR1基因突变（第二种情况）。图中每一 条曲线指代一个PCR反应，呈现明显"S"型的曲线表明有正常扩增，而未呈现"S"型的曲线 (水平方向的直线）则表明没有扩增。综合分析可以得出，对于ESR1基因的四种类型突变， 本发明技术体系的检测灵敏度均可达1%。
[0079] 下面再以10例复发性乳腺癌DNA样本作为检测对象，按照本发明的突变检测方 法，进行实验说明，以体现本发明的技术效果。
[0080] 按上述参数配置多个反应体系，分别加入各乳腺癌DNA样本20ng进行实验。结果 如图3所示。
[0081] 请参阅图1所示，本发明所设计的ESR1基因四种突变（Y537S，Y537C，Y537N和 D538G)的等位基因特异性引物及TaqMan荧光探针。本发明基于引物3'末端序列决定其延 伸效率的原理，设计出一套可以高特异性扩增ESR1基因四种突变的引物探针组合。箭头指 示引物的位置，横线指示TaqMan荧光探针的位置。
[0082] 请参阅图3所示，使用本发明所设计的技术体系，对10例复发性乳腺癌DNA样 本进行检测。按本技术结果判定标准可以得出，共有3例样本携带有ESR1突变，而7例为 ESR1野生型。
[0083] 所有样本由本发明的得到检测结果与之前得到的测序结果完全一致。
[0001] 说明书核苷酸和氨基酸序列表 <110>陕西佰美基因股份有限公司 <120>-种基于荧光PCR技术检测ESRi基因突变的方法 <160> 9 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> 人炎（Homo sapiens) <400> 1 gaacgtggtg cccctccc 18 <210〉2 <211> 18 <212> DNA <213> 人类（Homo sapiens) <400> 2 gaacgtggtg cccctgtg 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213〉人处 rHomo sapiens) <400> 3 agaacgtggt gccccaca 18 <210>4 <211> 18 <212> DNA <213〉人炎（Homo sapiens) <400> 4 acgtggtgcc cctctattg 18 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> 人类（Homo sapiens) <400> 5 cacggctagt gggcgc 16
[0002] <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> 人类（Homo sapiens) <400> 6 ctggagatgc tggacgccca c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> 人类（Homo sapiens) <400 7 tgttgcatga gaaaacgcca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> 人类（Homo sapiens) <400 8 gtcgcctgtt caccaaggat 20 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> 人类（Homo sapiens) <400 9 agtgacagag tcaccaaatg ctgcaca 27
【权利要求】
1. 一种基于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的方法，用于非疾病诊断目的，包括以下 环节： (1) 引物及荧光探针设计： 针对ESR1基因 Y537S，Y537C，Y537N以及D538G这四种突变分别设计等位基因特异性 引物，均作为上游引物，序列如下： Y537S:5 ' -GAACGTGGTGCCCCTCcC-3 ' Y537C:5 ' -GAACGTGGTGCCCCTgTG-3 ' Y537N:5 ' -AGAACGTGGTGCCCCaCA-3 ' D538G:5 ' -ACGTGGTGCCCCTCTATtG-3 ' 其中小写字母表示的碱基为人为引入的错配，以增强检测的特异性； 针对四种突变设计一条共通的下游引物，序列如下： Rp: 5，-CACGGCTAGTGGGCGC-3， 针对四种突变设计一条共通的TaqMan荧光探针，其序列及修饰如下： Probe:5 ' -FAM-CTGGAGATGCTGGACGCCCAC-BHQ2-3 ' 针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合，作为内质控体系，其序列如下： ALB Fp (上游引物）：5' -TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3' ALB Rp (下游引物）：5' -GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3' ALB Probe (探针）：5' -HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3' 其中，FAM 为 6-carboxyfluorescein ;HEX 为 6-carboxy-hexachlorofluorescein ; BHQ2 为 Black Hole Quencher-2 ; (2) |吴板的制备：提取待测样本的基因组DNA ; (3) 建立荧光实时定量PCR反应体系： 以反应体系总量为20 μ L计，在同一个反应体系中，分别加入Y537S等位基因特异 性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特异性上游引物250ηΜ-500ηΜ，Υ537Ν等位基 因特异性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特异性上游引物250ηΜ-500ηΜ，下游 引物（Rp) 250nM-500nM，TaqMan荧光探针100ηΜ-250ηΜ，以及ALB基因特异性上游引物 25011]\1-50011]\1、下游引物25011]\1-50011]\1、探针10011]\1-25011]\1、2\1^31^1116]\&18七61'111丨叉1(^1^、待 测样本基因组DNA10-50ng，使用PCR等级的Η 20补足体积20 μ L ; (4) 结果判定： 将配制好的反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，根据仪器给出的ESR1基因与 ALB基因的扩增指标（Ct值），即FAM通道和HEX通道的扩增情况来进行结果判定。
2. 根据权利要求1所述的基于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的方法，其特征在于， 扩增过程参数为： 95°C，2 ?15min，不循环； 95°C，5 ?15sec ;6(TC，40-60sec ;共计 40 个循环。
3. -种用于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1 中针对ESR1基因 Y537S，Y537C，Y537N以及D538G这四种突变分别设计的上游引物、共通的 下游引物、共通的TaqMan荧光探针以及作为内质控体系的另一特异性引物探针组合。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述作为内质控体系的另一特异性引 物探针组合是针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合，其序列如下： ALB Fp (上游引物）：5' -TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3' ALB Rp (下游引物）：5' -GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3' ALB Probe (探针）：5' -HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3'。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：以试剂盒中的试剂总量20 μ L计， 其中的Y537S等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特异性上游引物 250ηΜ-500ηΜ，Υ537Ν等位基因特异性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特异性上游引 物 250nM-500nM，下游引物（Rp)250nM-500nM，TaqMan 荧光探针 100nM-250nM，以及 ALB 基 因特异性上游引物 250nM-500nM、下游引物 250nM-500nM、探针 100nM-250nM，2XRealtime MastermixlO μ L、PCR等级的H20补足体积。
【文档编号】C12Q1/68GK104120178SQ201410315487
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月3日
【发明者】戴鹏高, 张洁, 陈超, 赵莹, 邹晖 申请人:陕西佰美基因股份有限公司