糖化血红蛋白的测定方法
【专利摘要】一种含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于，在选自由吡啶盐、盐、咪唑盐和异喹啉盐组成的组中的至少一种盐存在下，使含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶反应，使果糖基肽氧化酶作用于得到的反应产物，并测定生成的过氧化氢。根据本发明，提供准确地测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的方法。
【专利说明】糖化血红蛋白的测定方法
[0001] 本申请是申请号为201180038604. X(国际申请号为PCT/JP2011/068104)、中国国 家阶段进入日为2013年2月5日（国际申请日为2011年8月9日）、发明名称为"糖化血 红蛋白的测定方法"的中国发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002] 本发明涉及含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法、测定试剂及测定 试剂盒。另外，本发明涉及含有无色型色原体的水溶液的保存方法、无色型色原体的稳定化 方法。
【背景技术】
[0003] 糖化血红蛋白是在血红蛋白上结合葡萄糖而成的糖化物。血红蛋白具有由α链、 β链构成的四聚体结构，但将β链的N末端糖化后的血红蛋白称为血红蛋白Alc，血糖值 越高越增加，因此，作为糖尿病标志物，在临床检查中进行日常测定作为血糖控制的指标。
[0004] 作为糖化血红蛋白的测定方法，已知HPLC法等色谱法、电泳法、胶乳免疫凝聚法 等利用抗体的免疫测定法、使用作用于糖化蛋白的酶和作用于糖化肽和/或糖化氨基酸的 酶的酶测定法等。
[0005] 作为糖化血红蛋白的酶测定法，已知如下方法等：首先，通过改性剂使含有血红蛋 白的试样中的糖化血红蛋白改性，使蛋白质分解酶作用于改性糖化血红蛋白，接着，使糖化 肽氧化酶作用于生成的糖化肽，使生成的过氧化氢在过氧化物酶等过氧化活性物质存在下 与氧化显色型色原体反应而导入色素中，由生成的色素的吸光度测定糖化血红蛋白。在此， 改性剂用于使蛋白质分解酶能够作用于糖化血红蛋白，目前为止已知：含有乙酸基的化合 物或其盐、N-酰基牛磺酸或其盐、聚氧乙烯烷基醚硫酸或其盐（专利文献1);聚氧乙烯烷基 醚硫酸盐类、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸盐类等阴离子类表面活性剂（专利文献2);月桂基 硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠等磺酸化合物（专利文献3);磺酸化合物和硝基化合物（专利 文献4);季铵盐、烷基苄基二甲基氯化铵、月桂基二甲胺氧化物等（专利文献5)改性剂。
[0006] 另外，糖化血红蛋白的酶测定法中，经常使用如下方法：将糖化血红蛋白转变成过 氧化氢，使所生成的过氧化氢在过氧化物酶等过氧化活性物质存在下与氧化显色型色原体 反应而导入色素中，由所生成的色素的吸光度测定糖化血红蛋白。在此，作为氧化显色型色 原体，经常使用无色型色原体。无色型色原体是在过氧化物酶等过氧化活性物质存在下与 过氧化氢反应而生成色素的色原体的一种，与耦合型色原体不同，无色型色原体是其本身 单独即可生成色素的色原体，已知有吩噻嗪类的无色型色原体、三苯基甲烷类的无色型色 原体、二苯胺类的无色型色原体等（例如参照专利文献6?8)。
[0007] 作为高灵敏度色原体，无色型色原体适合用于对试样中仅微量存在的应该定量的 成分进行定量（例如参照非专利文献1)。但是，另一方面，其保存稳定性差，特别是具有在 溶液中随时间而自然显色的缺点，由于该无色型色原体所具有的稳定性不良，产生无法准 确地测定试样中应该定量的成分的问题。
[0008] 针对该无色型色原体所具有的稳定性不良的问题，目前为止已研究并报道了无色 型色原体在溶液中稳定化的方法（例如参照专利文献9、10)。
[0009] 现有技术文献
[0010] 专利文献
[0011] 专利文献I :W02006/013921小册子
[0012] 专利文献2 :TO2005/049858小册子
[0013] 专利文献3 :W02004/007760小册子
[0014] 专利文献4 :W02003/107011小册子
[0015] 专利文献5 :日本特开2009-159989号公报
[0016] 专利文献6 :日本特开昭57-029297号公报
[0017] 专利文献7 :日本特开平3-206896号公报
[0018] 专利文献8 :日本特开昭62-093261号公报
[0019] 专利文献9 :TO2005/088305小册子
[0020] 专利文献 10 :W02007/083703 小册子
[0021] 非专利文献
[0022] 非专利文献 1 :临床检查，1997 年，Vol. 41，No. 9, P. 1014-1019
【发明内容】
[0023] 发明所要解决的问题
[0024] 在糖化血红蛋白的酶测定法中，关于目前已知的糖化血红蛋白的改性剂，由于糖 化血红蛋白的改性不充分，因此，无法令人满意地进行蛋白质分解酶反应，存在不能进行糖 化血红蛋白的准确测定的问题。另外，在糖化血红蛋白的测定方法中，关于所使用的无色型 色原体，以往已知的保存方法需要在严苛的条件下进行保存等，不一定可以说是能够令人 满意的方法。
[0025] 本发明的目的在于提供准确地测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的方 法、试剂和试剂盒、以及能够准确地测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的、含有无 色型色原体的水溶液的保存方法和无色型色原体的稳定化方法。
[0026] 用于解决问题的方法
[0027] 本发明人对本问题进行了深入的研究，结果发现如下见解：通过在吡啶_盐、憐. 盐、咪唑镥盐或异喹啉镥盐存在下使含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解 酶反应，能够使血红蛋白和糖化血红蛋白充分地改性，从而能够准确地测定含有血红蛋白 的试样中的糖化血红蛋白。另外发现吡啶?盐、禱盐、咪唑铺盐或异喹啉铺盐使无色型色原 体稳定化的见解，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下的[1]?[18]。
[0028] [1] 一种含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于，在选自 由由以下通式（I)表示的吡啶镲盐、由以下通式（II)表示的憐盐、由以下通式（III)表示 的咪唑锩盐和由以下通式（IV)表示的异喹啉锚盐组成的组中的至少一种盐存在下,使含 有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶反应，使果糖基肽氧化酶作用于得到 的反应产物，并测定生成的过氧化氢，
[0029]
【权利要求】
1. 一种含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于，在由以下通 式a)表示的吡啶Ii盐存在下，使含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶 反应，使果糖基肽氧化酶作用于得到的反应产物，并测定生成的过氧化氢，
式（I)中，R1表示取代或未取代的烷基、或者取代或未取代的烯基，Ra表示氢原子、取 代或未取代的烧基、或者取代或未取代的烯基，η表示1?5的整数，表示1价的阴离子。
2. 如权利要求1所述的测定方法，其中，过氧化氢的测定利用过氧化氢测定试剂来进 行。
3. 如权利要求2所述的测定方法，其中，过氧化氢测定试剂为含有过氧化物酶和无色 型色原体的试剂。
4. 如权利要求3所述的测定方法，其中，无色型色原体为吩噻嗪类色原体。
5. 如权利要求4所述的测定方法，其中，吩噻嗪类色原体为10-(羧甲基氨基羰 基）-3, 7-双（二甲氨基）吩噻嗪。
【文档编号】C12Q1/28GK104313121SQ201410541606
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2011年8月9日 优先权日:2010年8月11日
【发明者】征矢阳代, 村上智美, 角田春树, 大杉友, 依田彩子, 松下政嗣 申请人:协和梅迪克斯株式会社