一种白耙齿菌及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种白耙齿菌及其用途，其形态特征：在PDA培养基上，25℃培养一周，菌丝白色，菌落平坦，绳状，边缘羊毛状，两周后菌丝变为象牙黄，有水果香味。显微镜观察发现菌丝容易染色，生殖菌丝直径2-4um，菌丝有隔膜，且多分支，菌丝系统为一体系至二体系，生殖菌丝具简单分隔，显微镜观察，菌丝着色深，均匀，且分支多，呈网状，有隔膜，且所有菌丝在Melzer试剂中无变色反应，在棉蓝试剂中厚壁菌丝有中度嗜蓝反应,菌丝均匀，分支多，呈网状，粗壮；而在CA培养基上，菌丝稀疏，白色，质地呈绳状，无味。本发明在酱香型白酒酿造中产酶、皂苷和挥发性物质。CCTCC NO：M201416620140428
【专利说明】一种白耙齿菌及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体来说涉及一种白耙齿菌，同时涉及该白耙齿菌在 产酶、皂苷等物质方面的用途。
【背景技术】
[0002] 酱香型白酒是中国三大香型白酒之一，由于其独特的风味和保健作用，受到众人 的喜爱。其中白酒中具有保健功能的药用成分也是白酒的研究热点，目前，认为萜类物质有 重要作用（徐岩，2013)。在白酒酿造中，液化酶、糖化酶和蛋白酶活力对于出酒率和白酒品 质有重要作用，液化酶和糖化酶降解淀粉使其糖化，糖化是发酵的基础，直接影响出酒率， 并与白酒中还原糖和杂醇油含量有关(王立钊，2006)。蛋白酶能降解蛋白质促进糖化作用 和微生物的生长(马加军，2000)，且降解产物在多种酶的作用下生成酯及其它香味物质(唐 胜球，2005 ;魏炜，1997)。在研究白耙齿菌时，发现白耙齿菌降解木材，能够产生一些降解木 材的酶(张伟，2009)，而对于是否产液化酶、糖化酶和蛋白酶未见报道。除此之外，对其发酵 产多糖和蛋白含量的测定方法也有研究(袁文彬，2012)。
[0003] 酱香型大曲微生物研究中还未见分离到白耙齿菌，对于皂苷和挥发性物质的研究 未见报道，并在白酒酿造工艺中也未见报道，这为酱香型白酒的功能性开发提供了新的论 点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一株在酱香型白酒酿造中产酶、皂苷和挥发性物质的白耙 齿菌。
[0005] 本发明的另一目的在于提供该白耙齿菌在产酶、皂苷等物质方面的用途 一种白耙齿菌，其形态特征：在PDA培养基上，25°C培养一周，菌丝白色，菌落平坦，绳 状，边缘羊毛状，两周后菌丝变为象牙黄，有水果香味。显微镜观察发现菌丝容易染色，生 殖菌丝直径2_4um，菌丝有隔膜，且多分支，菌丝系统为一体系至二体系，生殖菌丝具简单分 隔，显微镜观察，菌丝着色深，均匀，且分支多，呈网状，有隔膜，且所有菌丝在Melzer试剂 中无变色反应，在棉蓝试剂中厚壁菌丝有中度嗜蓝反应，菌丝均匀，分支多，呈网状，粗壮； 而在CA培养基上，菌丝稀疏，白色，质地呈绳状，无味。
[0006] 该菌种已于2014年4月28保藏到中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武 汉大学)，保藏号：CCTCC N0:M2014166,名称：白耙齿菌hci￡^s)FBKL3. 0021。
[0007] 本发明的一种白耙齿菌FBKL3. 0021 (Jrpez /aciem)的分离，包括以下步骤： (一）对白把齿菌 FBKL3. 0〇21 (Ζτ/76? /acieiAs)的分离： 称取IOg粉碎酱香型大曲放入盛有90mL生理盐水三角瓶中，再加玻璃珠，室温震荡 30min。取ImL样品悬液进行10倍梯度稀释，分别为10'ΚΓ3,用浇注平板法分离培养，在 25°C条件下培养4d，对不同的菌株划线纯化，对纯化菌株斜面保藏。
[0008] (二）培养基： 斜面培养基：马铃薯琼脂糖培养基（PDA) 麸皮培养基：将麸皮和蒸馏以1 :1混合，用玻璃棒搅匀，121°C灭菌20min。
[0009] 小麦培养基：将粉碎小麦和蒸馏以1 :1混合，用玻璃棒搅匀，121°C灭菌20min。
[0010] 高粱小麦培养基：高粱：小麦质量比为1 :1，小麦全部粉碎，高粱整粒：碎粒质量 比为3 :1，搅拌均勻，取30g，加30mL睡，搅拌均匀，121°C灭菌20min， 固体种子培养基：将麸皮和蒸馏以1 :1混合，用玻璃棒搅匀，121°C灭菌20min。 toon] 液体种子培养基：马铃薯葡萄糖液体培养基 鉴定培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)，马铃薯液体培养基。
[0012] (三）菌种的保种和传代： (1)液体石蜡保藏法：将白耙齿菌接种到PDA斜面培养基上，在25°C培养箱中培养4d 后，在斜面上加一层无菌无水液体石蜡，石蜡高出斜面Icm处，写上标签，置于4°C保存，保 存时间为3-5年。
[0013] (2)液氮超低温保藏法：将白耙齿菌接种到PDA平板上，在25°C培养箱中培养4d 后，轻轻刮取平板上的菌丝体使成菌悬液，加入甘油终浓度为15%，吸取0. 5-0. 8mL悬液注 入安瓿管中，熔封管口，写上标签，置液氮冷冻器中保存。
[0014] (3)超低温冰箱保藏法：将白耙齿菌接种到PDA平板上，在25°C培养箱中培养一 周后，在超净工作台中利用解剖刀轻轻分割平板吗，使成为〇. 5cm2的方形菌种块，取5支 I. 8mL的无菌冻存管，在超净工作台中加入0. 5mL-l. OmL的马铃薯液体培养基，之后加入甘 油使其终浓度为15%，分别放进3-8块方形菌种块，使液体培养基全部掩盖菌种块。盖紧瓶 盖，写上标签，置于_70°C超低温冰箱中保存。
[0015] (四）菌种的生态特征： 该菌接种在PDA培养基上，25°C培养一周，菌丝白色，菌落平坦，绳状，边缘羊毛状，两 周后菌丝变为象牙黄，有水果香味。显微镜观察发现菌丝容易染色，生殖菌丝直径2-4um，菌 丝有隔膜，且多分支，菌丝系统为一体系至二体系，生殖菌丝具简单分隔，显微镜观察，菌丝 着色深，均匀，且分支多，呈网状，有隔膜，且所有菌丝在Melzer试剂中无变色反应，在棉蓝 试剂中厚壁菌丝有中度嗜蓝反应，菌丝均匀，分支多，呈网状，粗壮；而在CA培养基上，菌丝 稀疏，白色，质地呈绳状，无味。
[0016] (五）分子生物学鉴定： 将菌种接种到PDA培养基上活化2-3次，将菌种再接种到100 mL马铃薯液 体培养基中，25 °C摇瓶培养3d，用滤纸过滤，将菌丝水分用滤纸吸干用液氮研磨， 用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，进行PCR扩增，PCR采用引物为ITS4: 是28 81?隱基因序列（51〇^〇^(：1741764了4了603'），几55是18 81?隱基因序列 (5' GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3'），经PCR扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳进行DNA电泳检测， 最后将序列进行测序。白耙齿菌（Irpex lacteus) FBKL3. 0021的内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS)的核酸序列（（包括 18SDNA 和 28SDNA 的一部分以及 5. SSDNA 和三者之间的两段间隔序列）长度为628个碱基，通过美国生物技术信息中心（National Center for Biorechnology Information, NCBI)进行序列同源性分析，将白耙齿菌（Irpex Iacteus)序列通过Blast比对，结果为白耙齿菌，结合形态学特征，根据MycoBank数据库鉴 定该菌株为担子菌属中的白耙齿菌。
[0017] (六）菌种的培养特性 (1) 培养温度15°c?40°C，最适培养温度28°C?32°C ; (2) 培养pH为3?8,最适生长PH为6?7。
[0018] 该菌接种在PDA培养基上，菌丝白色，菌落平坦，绳状，菌丝有隔膜，且多分支，菌 丝在Melzer试剂中无变色反应，在棉蓝试剂中厚壁菌丝有中度嗜蓝反应，菌丝均匀，分支 多，呈网状，粗壮。
[0019] 该菌株可以与酿酒酵母等酿造类菌种混合发酵使用，并有增香，高酶活，提高发酵 制品功能因子的作用。
【具体实施方式】
[0020] 本发明的白耙齿菌分离方法： 称取IOg粉碎酱香型大曲放入盛有90mL生理盐水三角瓶中，再加适量玻璃珠，室温震 荡30min。取ImL样品悬液进行10倍梯度稀释，分别为10-2、10-3,后用浇注平板法分离培 养，在25 °C条件下培养4d，纯化后在斜面培养基上保藏。
[0021] 该菌接种在PDA培养基上，25°C培养一周，菌丝白色，菌落平坦，绳状，边缘羊毛 状，两周后菌丝变为象牙黄，有水果香味。显微镜观察发现菌丝容易染色，生殖菌丝直径 2-4um，菌丝有隔膜，且多分支，菌丝系统为一体系至二体系，生殖菌丝具简单分隔，显微镜 观察，菌丝着色深，均匀，且分支多，呈网状，有隔膜，且所有菌丝在Melzer试剂中无变色反 应，在棉蓝试剂中厚壁菌丝有中度嗜蓝反应，菌丝均匀，分支多，呈网状，粗壮；而在CA培养 基上，菌丝稀疏，白色，质地呈绳状，无味。
[0022] 发酵产品制备： 样品I，将白耙齿菌接种到斜面培养基上30°C培养7天，之后接种到液体种子培养基 中，在160r/min条件下30°C培养7天，将10%种子液接种到高粱小麦培养基上，在30°C条 件下发酵7天。
[0023] 样品II，将白耙齿菌接种到斜面培养基上30°C培养7天，之后接种到液体种子培 养基中，在160r/min条件下30°C培养7天，将5%种子液接种到高粱小麦培养基上，在30°C 条件下发酵2天后加入5%酿酒酵母，在28°C条件下培养5天 样品III，将白耙齿菌接种到斜面培养基上30°C培养7天，之后接种到液体种子培养基 中，在160r/min条件下30°C培养7天，将5%种子液接种到高粱小麦培养基上，30°C条件下 发酵4天后加入5%酿酒酵母，在28°C条件下培养3天。
[0024] 样品IV，将白耙齿菌接种到斜面培养基上30°C培养7天，之后接种到液体种子培 养基中，在160r/min条件下30°C培养7天，白耙齿菌和酿酒酵母各5%接种量同时接种到高 粱小麦培养基上，28°C发酵7天. 空白样品，将高粱小麦培养基灭菌，但不接种。
[0025] 皂苷含量测定： 标准曲线的绘制：吸取人参阜苷Re (中国药品生物制品检定所）标准溶液（2. Omg/mL 0、20、40、60、80、100此(相当于人参皂苷1^0、40、80、120、160、200即)）。于1011^比色管中， 用氮气吹于，显色步骤如测定酶活方法测定吸光度。并绘制标准曲线。
[0026] 人参总皂苷浓度为20-200ug/mL之间与吸光度值呈线性关系。相关系数（r) 0. 999〇
[0027] 称取2· Og左右样品于IOOmL烧杯中，加入20 - 40mL85%乙醇，超声波振荡30min， 再定容至50mL，摇匀，放置，吸取上清液I. OmL挥十后以水溶解残渣，进行柱分离。
[0028] 柱层析：以PT -大孔吸附树脂柱（河北省津杨滤材厂）进行层析分离，准确吸取 上述已处理好的样品溶液I. OmL上柱，用15mL水洗柱，以洗去糖分等水溶性杂质，弃去洗 脱液，再用20mL 85%乙醇洗脱总皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，于水浴上蒸干，以此作显色 用。
[0029] 显色：在上述已挥干的蒸发皿中准确加人0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，转动蒸 发皿，使残清溶解，再加〇. 8mL高氯酸，混匀后移人IOmL比色管中，塞紧盖子于60°C以下水 浴上加温I 5min取出，冷却后准确加人冰乙酸5. OmL,摇勻后以LOcm比色皿、于560nm处 与人参皂昔Re标准管同时比色。
【权利要求】
1. 一种白耙齿菌(/_r/7^r hcte^s)FBKL3. 0021，其特征在于所述菌种的保藏号为CCTCC NO :M2014166,名称：白耙齿菌（Zrpez 7acte^s)FBKL3. 0021。
2. 如权利要求1所述的白耙齿菌在产酶、皂苷等物质方面的用途。
【文档编号】C12G3/02GK104403950SQ201410611648
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】王晓丹, 邱树毅, 班世栋 申请人:贵州大学