小新月菱形藻高效养殖和采收方法
【专利摘要】本发明提供了一种小新月菱形藻高效养殖和采收方法，属水产养殖领域。过去，小新月菱形藻多采用开放水泥池粗放养殖，成本高，易污染，工艺复杂，操作麻烦，基建投资大，产量低。本发明在微藻培养室中采用白塑料桶充气培养，且采用两个塑料桶串联的方式，使充入的气体得到二次利用，节约了能量和资源。本发明还对传统培养液配方进行了优化，营养更全面、均衡，不易污染，成本低，易于操作，小新月菱形藻产量提高150％。另外，以前小心月菱形藻的采收采用离心法，耗电多，沉淀不彻底，费用高，本发明采用复合沉淀剂，沉淀速度快，沉淀彻底，节约资金。
【专利说明】小新月菱形藻高效养殖和采收方法
[0001]【技术领域】本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种小新月菱形藻高效养殖和采收方法。
【背景技术】
[0002]小新月菱形藻Nitzschia closterium俗称“小娃藻”，隶属娃藻门，羽纹娃藻纲，管壳缝目，菱形藻科，菱形藻属，为暖温性、咸水种或半咸水种藻类植物。藻体为单细胞，主要生长在沿海潮间带滩面上，也浮游于近海水体，我国各海区均有。细胞中央膨大，呈纺锤形，两端渐尖，笔直或朝同一个方向弯曲似月牙形。细胞长12-23微米，宽2-3微米。中央有一个胞核，色素体黄褐色，两片，位于胞核两侧，行纵分裂繁殖。生长繁殖适温5-28 °C，最适15-20°C，超过28°C，藻细胞停止生长，最终大量死亡。盐度适应范围广，18-61.5%。，最适25-32%。。最适光照强度4000-200001ux，小型培养时忌直射阳光。适应pH范围7_10，最适7.5-8.5。该藻大小适口，营养丰富，是中国较早培养和应用的单细胞饵料，广泛用作栉孔扇贝、贻贝、泥蚶、毛蚶、魁蚶、杂色蛤、牡蛎、缢蛏、中国对虾、基围虾、南美白对虾、毛虾等的开口饵料，有重要培养价值。
[0003]关于小新月菱形藻的培养方法，过去张新建曾公开了一种富含油脂新月菱形藻及其优化培养基和规模化培养方法(申请号CN201010238174)，所述藻种为新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC N0.3747 ;所述优化培养基为发明人优选自养培养基和异养培养基；所述规模化培养方法包括光合自养培养和异养规模化培养。在优化培养条件下，藻细胞生长迅速，比生长速率大，细胞密度高，油脂含量达到65 %。该法投资少，培养简单，效益较高，但操作麻烦，易污染，难以在生产中推广应用。另外，郑维发明了一种培养新月菱形藻的方法及其专用培养基(申请号CN200410047885)。该发明所提供的培养基，配方为:硝酸钠，180_220mg ;磷酸二氢钾，18_22mg ;娃酸钠，90_110mg ;碳酸氢钠，400_500mg ;梓檬酸铁，0.45-0.55mg ;维生素 B12，0.35-0.55 μ g ;维生素 B1, 350-450 μ g ;乙二胺四乙酸二钠，1.8-2.2mg ;脲素，3.5-4.5mg ;海水定容至1000ml。应用该发明所提供的培养基培养新月菱形藻，包括如下步骤:I)用海水配置培养基；2)新月菱形藻藻种密度为3 X 15细胞/毫升，按与培养基体积比为1: 5-9的比例将新月菱形藻接种到培养基中，在19-25?，光照强度3000-60001ux，光照时间8-12h/天条件下通气培养。该发明所提供的ZBNC培养基采用开放式的培养方式即可获得新月菱形藻及其目标产物，效果明显，运行稳定可靠，但工艺复杂，操作麻烦，基建投资大，成本高，效益差。
[0004]为了克服目前技术的不足，本发明公开了一种小新月菱形藻高效养殖和采收方法，在微藻培养室中采用白塑料桶充气培养，且采用两个塑料桶串联的方式，使充入的气体得到二次利用，节约了能量和资源，培养采用二阶段养殖法，第一阶段即前6天提供较低的温度和光照强度，有利于藻细胞生长且避免强光对细胞造成光伤害，第二阶段即后5天提高了温度和光照强度并延长了光照时间，有利于高不饱和脂肪酸的积累。本发明还对传统培养液配方进行了优化，补充了牛粪浸出液，NH4VO3, CaCl2.2H20，Na2MoO4, FeC6H5O7,Co (NO3) 2.6H20，人尿，NaN03，(NH4) 2S04，Na2HPO4.2H20，CuSO4.5H20，EDTA, FeCl3, MgSO4.7H20，K2S13，吲哚乙酸，海泥浸出液，维生素H，肌醇，叶酸，胸间氮苯等成分，营养更全面、均衡，不易污染，成本低，易于操作，小新月菱形藻产量提高150%。另外，以前小心月菱形藻的采收采用离心法或单一沉淀剂，耗电多，沉淀不彻底，费用高，现在本发明采用复合沉淀剂，沉淀速度快，沉淀彻底，节约资金，适于大规模应用。
【发明内容】
[0005]为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种小新月菱形藻高效养殖和采收方法，具体方法如下:
[0006]步骤⑴培养液的准备
[0007]培养液成分:牛粪浸出液I 份，NH4VO3 0.001 份，CaCl2.2Η20 0.1 份，Na2MoO4 0.005份，FeC6H5O7 0.002 份，Co (NO3)2.6Η20 0.02 份，人尿 0.8 份，NaNO3 0.4 份，(NH4)2SO4 0.2份，Na2HPO4.2Η20 0.1 份，CuSO4.5Η20 0.05 份，EDTA 0.02 份，FeCl3 0.001 份，MgSO4.7Η200.6份，K2S13 0.025份，吲哚乙酸0.003份，海泥浸出液1.2份，维生素H 0.0002份，肌醇0.001份，叶酸0.01份，胸间氮苯0.004份，煮沸冷却海水1000份；装入棕色磨口塞试剂瓶中，密封，放在摇床上摇匀15分钟，置入4°C冰箱保存，备用；
[0008]步骤⑵接种培养
[0009]取两个65升带盖的大口白塑料桶(市场有售)，分别加入步骤I所述培养液40升，选生长旺盛、无污染、处于指数生长期的小新月菱形藻藻种分别接种，接种要在上午9-10点进行，接种密度4万个细胞/每毫升藻液，轻轻摇匀3分钟。每个盖子上打上2个孔，孔直径10毫米，每个盖子上插入2根管子，一根为塑料管，用以充气，长3米，直径8毫米，另一根较短，长30厘米，直径8毫米，为比较硬的料管，用以排气；第一个桶的充气管一端连接空气压缩机，另一端插入到藻液底部，用以充气，充入混合气体，气体成分=空气97% +纯C022.5% +纯氨气0.5%，连续不间断充气，气量不宜太大，以让藻细胞浮起不下沉即可；第二个桶的充气管与第一个桶的排气管以料管相连，如此一来，充入的气体可以得到二次利用，提高了气体利用率。将这两个塑料桶放入微藻培养室中培养，室内空调控温，日光灯管照明，以打开灯管的数量多少来控制光照强度，连续培养11天，前6天调节温度至17°C，光照强度120001ux(因塑料桶壁的阻挡和吸收作用，到达藻液的实际光照强度约为60001UX)，光暗周期=14h/L+10h/D，即提供间歇光，14小时连续光照，10小时黑暗；后5天，调节温度至20°C，光照强度ISOOOlux，每天提供24小时连续光照，至第11天，藻细胞密度可达到160万/每毫升藻液，后转入下一步骤；
[0010]步骤⑶藻细胞采收
[0011]取甲壳素，明矾，聚丙烯酰胺适量，分别用粉碎机粉碎至面粉状(粒径大小以通过120目筛絹为宜)，按甲壳素I份，明矾2份，聚丙烯酰胺I份的比例混合，用搅拌机充分搅拌、混合30分钟，直至均匀，制成复合沉淀剂，取步骤2所述培养后的藻液1000份，加入复合沉淀剂0.8份，玻璃棒充分搅拌、混合均匀，静置、沉淀24小时，弃上清液，取底部绿色藻泥，藻细胞收集完毕。
[0012]有益结果
[0013]过去，小新月菱形藻多采用开放水泥池粗放养殖，成本高，易污染，工艺复杂，操作麻烦，基建投资大，产量低。为了克服目前技术的不足，本发明公开了一种小新月菱形藻高效养殖和采收方法，在微藻培养室中采用白塑料桶充气培养，且采用两个塑料桶串联的方式，使充入的气体得到二次利用，节约了能量和资源，培养采用二阶段养殖法，第一阶段即前6天提供较低的温度和光照强度，有利于藻细胞生长且避免强光对细胞造成光伤害，第二阶段即后5天提高了温度和光照强度并延长了光照时间，有利于高不饱和脂肪酸的积累。本发明还对传统培养液配方进行了优化，补充了牛粪浸出液，NH4VO3, CaCl2.2H20，Na2MoO4, FeC6H5O7, Co (NO3)2.6H20，人尿，NaNO3, (NH4)2SO4, Na2HPO4.2H20，CuSO4.5H20，EDTA,FeCl3, MgSO4.7H20，K2S13，吲哚乙酸，海泥浸出液，维生素H，肌醇，叶酸，胸间氮苯等成分，营养更全面、均衡，不易污染，成本低，易于操作，小新月菱形藻产量提高150%。另外，以前小心月菱形藻的采收采用离心法或单一沉淀剂，耗电多，沉淀不彻底，费用高，现在本发明采用复合沉淀剂，沉淀速度快，沉淀彻底，节约资金，适于大规模应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为小新月菱形藻形态；
[0015]图2为步骤2中培养小新月菱形藻方法图，其中附图标记为:1充气管，2白塑料桶，3藻液，4排气管；箭头所指为气体运动方向。
【具体实施方式】
[0016]为了克服现有技术的缺陷，现提供一种小新月菱形藻高效养殖和采收方法，具体方法如下:
[0017]步骤⑴培养液的准备
[0018]培养液成分:牛粪浸出液I 份，NH4VO3 0.001 份，CaCl2.2Η20 0.1 份，Na2MoO4 0.005份，FeC6H5O7 0.002 份，Co (NO3)2.6Η20 0.02 份，人尿 0.8 份，NaNO3 0.4 份，(NH4)2SO4 0.2份，Na2HPO4.2Η20 0.1 份，CuSO4.5Η20 0.05 份，EDTA 0.02 份，FeCl3 0.001 份，MgSO4.7Η20
0.6份，K2S13 0.025份，吲哚乙酸0.003份，海泥浸出液1.2份，维生素H 0.0002份，肌醇
0.001份，叶酸0.01份，胸间氮苯0.004份，煮沸冷却海水1000份；装入棕色磨口塞试剂瓶中，密封，放在摇床上摇匀15分钟，置入4°C冰箱保存，备用；
[0019]步骤⑵接种培养
[0020]取两个65升带盖的大口白塑料桶(市场有售)，分别加入步骤I所述培养液40升，选生长旺盛、无污染、处于指数生长期的小新月菱形藻藻种分别接种，接种要在上午9-10点进行，接种密度4万个细胞/每毫升藻液，轻轻摇匀3分钟。每个盖子上打上2个孔，孔直径10毫米，每个盖子上插入2根管子，一根为塑料管，用以充气，长3米，直径8毫米，另一根较短，长30厘米，直径8毫米，为比较硬的料管，用以排气；第一个桶的充气管一端连接空气压缩机，另一端插入到藻液底部，用以充气，充入混合气体，气体成分=空气97% +纯C022.5% +纯氨气0.5%，连续不间断充气，气量不宜太大，以让藻细胞浮起不下沉即可；第二个桶的充气管与第一个桶的排气管以料管相连，如此一来，充入的气体可以得到二次利用，提高了气体利用率。将这两个塑料桶放入微藻培养室中培养，室内空调控温，日光灯管照明，以打开灯管的数量多少来控制光照强度，连续培养11天，前6天调节温度至17°C，光照强度120001ux(因塑料桶壁的阻挡和吸收作用，到达藻液的实际光照强度约为60001ux)，光暗周期=14h/L+10h/D，即提供间歇光，14小时连续光照，10小时黑暗；后5天，调节温度至20°C，光照强度ISOOOlux，每天提供24小时连续光照，至第11天，藻细胞密度可达到160万/每毫升藻液，后转入下一步骤；
[0021]步骤⑶藻细胞采收
[0022]取甲壳素，明矾，聚丙烯酰胺适量，分别用粉碎机粉碎至面粉状(粒径大小以通过120目筛絹为宜)，按甲壳素I份，明矾2份，聚丙烯酰胺I份的比例混合，用搅拌机充分搅拌、混合30分钟，直至均匀，制成复合沉淀剂，取步骤2所述培养后的藻液1000份，加入复合沉淀剂0.8份，玻璃棒充分搅拌、混合均匀，静置、沉淀24小时，弃上清液，取底部绿色藻泥，藻细胞收集完毕。
[0023]步骤I中所述人尿制备方法:取一 3000毫升三角烧瓶，装入人尿1500毫升，静置，自然发酵48小时，放在电炉上加热，煮沸3分钟，冷却，装入磨口塞棕色试剂瓶，密封，置于4°C冰箱冷藏备用；
[0024]步骤2中接种用的小新月菱形藻预先进行提纯(本领域常规方法，只要可实现提纯即可，例如米氏提取法)，以确保接种时藻种为纯种、无污染且处于生长旺盛的指数生长期；
[0025]步骤I中各种营养盐要按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；
[0026]步骤I中各种无机营养盐和维生素可预先配成母液且置于4°C冰箱冷藏保存备用，放置时间不要超过45天；
[0027]步骤I中牛粪浸出液制备方法:取牛粪50公斤，加入麸皮3公斤，玉米面I公斤，自来水4升，充分搅拌，堆成圆锥状，自然发酵15天，后摊成薄层，阳光下暴晒3天，后取3公斤放入水桶中，加入10升蒸馏水，充分搅匀，静置，48小时后100目筛絹过滤，取滤液加热，煮沸45分钟，杀死其中的细菌、霉菌、病毒等，冷却，沉淀48小时，取上清液，即得牛粪浸出液，装入磨口塞试剂瓶，密封，置于4°C冰箱备用；
[0028]步骤I中海泥浸出液制备方法:取比较肥沃又不於黑的海泥，以I份泥加2份淡水，充分搅拌均匀，静置1-2分钟，取上层泥浆于铝锅中，按每1000毫升泥浆加I克NaOH的量加入NaOH，煮沸25分钟。煮时需不断搅拌均匀，煮后静置24小时取上清液备用；
[0029]步骤3中所用玻璃棒需洗刷干净放在85°C烘箱中烘干后使用；
[0030]步骤2所述接种过程需在上午9-10点且在无菌操作台上进行；
[0031]步骤2中所用塑料桶要选用透光性好且韧性强度高，以提高光能利用率和塑料桶使用寿命；
[0032]步骤2中充气管、排气管与盖子连接处需用玻璃胶粘合，以防漏气；
[0033]步骤I中所用化学药品纯度均需化学纯级别。
[0034]最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
【权利要求】
1.一种小新月菱形藻高效养殖和采收方法，其特征在于具体方法如下: 步骤(I)培养液的准备 培养液成分:牛粪浸出液I份，NH4VO3 0.001份，CaCl2.2Η20 0.1份，Na2MoO4 0.005份，FeC6H5O7 0.002 份，Co (NO3)2.6Η20 0.02 份，人尿 0.8 份，NaNO3 0.4 份，(NH4)2SO4 0.2 份，Na2HPO4.2Η20 0.1 份，CuSO4.5Η20 0.05 份，EDTA 0.02 份，FeCl3 0.001 份，MgSO4.7Η200.6份，K2S13 0.025份，吲哚乙酸0.003份，海泥浸出液1.2份，维生素H 0.0002份，肌醇0.001份，叶酸0.01份，胸间氮苯0.004份，煮沸冷却海水1000份；装入棕色磨口塞试剂瓶中，密封，放在摇床上摇匀15分钟，置入4°C冰箱保存，备用； 步骤(2)接种培养 取两个65升带盖的大口白塑料桶，分别加入步骤I所述培养液40升，选生长旺盛、无污染、处于指数生长期的小新月菱形藻藻种分别接种，接种要在上午9-10点进行，接种密度4万个细胞/每毫升藻液，轻轻摇匀3分钟，每个盖子上打上2个孔，孔直径10毫米，每个盖子上插入2根管子，一根为塑料管，用以充气，长3米，直径8毫米，另一根较短，长30厘米，直径8毫米，为比较硬的料管，用以排气；第一个桶的充气管一端连接空气压缩机，另一端插入到藻液底部，用以充气，充入混合气体，气体成分=空气97% +纯CO2 2.5%+纯氨气0.5%，连续不间断充气，气量不宜太大，以让藻细胞浮起不下沉即可；第二个桶的充气管与第一个桶的排气管以料管相连，如此一来，充入的气体可以得到二次利用，提高了气体利用率，将这两个塑料桶放入微藻培养室中培养，室内空调控温，日光灯管照明，以打开灯管的数量多少来控制光照强度，连续培养11天，前6天调节温度至17°C，光照强度120001UX (因塑料桶壁的阻挡和吸收作用，到达藻液的实际光照强度约为60001uX)，光暗周期=14h/L+10h/D，即提供间歇光，14小时连续光照，10小时黑暗；后5天，调节温度至20°C，光照强度ISOOOlux，每天提供24小时连续光照，至第11天，藻细胞密度可达到160万/每毫升藻液，后转入下一步骤； 步骤(3)藻细胞采收 取甲壳素，明矾，聚丙烯酰胺适量，分别用粉碎机粉碎至面粉状(粒径大小以通过120目筛絹为宜)，按甲壳素I份，明矾2份，聚丙烯酰胺I份的比例混合，用搅拌机充分搅拌、混合30分钟，直至均匀，制成复合沉淀剂，取步骤2所述培养后的藻液1000份，加入复合沉淀剂0.8份，玻璃棒充分搅拌、混合均匀，静置、沉淀24小时，弃上清液，取底部绿色藻泥，藻细胞采收完毕。
【文档编号】C12R1/89GK104480017SQ201410752220
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】王培磊 申请人:临沂大学