本发明涉及畜牧生产技术领域，尤其涉及一种防治围产期奶牛脂肪肝的预混料及其相关应用。
背景技术：
奶牛围产期一般是指生产前3周(围产前期)至产后3周(围产后期)这一时期。在这期间奶牛要经历妊娠、分娩、泌乳等一系列复杂的生理过程，机体营养与内分泌机能发生很大的变化，导致奶牛免疫力下降，因而对疾病的抵抗力也大大降低。奶牛在妊娠后期，胎儿快速生长发育、分娩时能量被大量消耗以及泌乳初期产奶量快速增加，使得这一时期奶牛对能量的需求急剧增加。但是围产期奶牛因其生理代谢的特殊性，食欲反而减退，干物质采食量(dmi)降低，从而导致能量负平衡(neb)。为了弥补能量的不足，奶牛大量动员体内脂肪，激素发生剧烈变化。在泌乳早期，只要能量不能满足泌乳的需要，酯类的分解代谢就会持续发生。然而，过度体酯动员产生的大量非酯化脂肪酸过度的体脂动员产生的非酯化脂肪酸(nefa)在肝脏中蓄积，进而在肝脏中再酯化为甘油三酯(tg)而沉积，最终引发脂肪肝。患脂肪肝的奶牛由于肝功能障碍,常导致胆汁分泌不足,影响消化功能；同时还容易伴发其它围产期疾病,如胎衣不下、生产瘫痪和子宫内膜炎等,从而使患牛的产奶量、繁殖力和免疫力受到不同程度的影响，给奶牛养殖造成极大的经济损失。
因此，需要研发一种预混料用于防治围产期奶牛发生脂肪肝。该预混料能够改善奶牛肝脏功能，防治脂肪肝的发生；同时还预防肝脏氧化应激，维护肝脏的正常功能，保证奶牛的身体健康；此外还要能够维持奶牛后期产奶量，提高经济收益，满足长期发展需求；这是本领域亟待解决的问题之一。
技术实现要素：
本发明提供了一种防治围产期奶牛脂肪肝的预混料及其相关应用，本发明的防治围产期奶牛脂肪肝的预混料同时添加了过瘤胃胆碱和硒，创造性的利用了两者组合后对肝脏的双重保护功能，开创性地发现了二者同时添加在预混料中协同效果，在围产期奶牛的护肝、抗氧化以及泌乳性能上完美实现了壹加壹远远大于二的效果。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术措施为：
首先，本发明的第一个方面提供了一种防治围产期奶牛脂肪肝的预混料，所述预混料中复合添加有过瘤胃胆碱和亚硒酸钠。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所提供的技术措施还包括：
优选地，所述预混料中复合添加的过瘤胃胆碱占预混料总重量的85-95％，亚硒酸钠占预混料总重量的0.05‰-0.06‰。；进一步优选地，过瘤胃胆碱占预混料总重量的95％，亚硒酸钠占预混料总重量的0.055‰。
进一步地，所述预混料还包括维生素d、维生素e、微量元素和载体；其中，所述微量元素包括硫酸亚铁和硫酸锌，所述载体为沸石粉。
优选地，每吨所述防治围产期奶牛脂肪肝的预混料中各组分配比为：
其他余量组分。
进一步优选地，每吨所述预混料中各组分配比为：
另一方面，本发明还提供了一种适用于饲喂围产期奶牛的全价日粮，所述全价日粮复合添加有上述的防治围产期奶牛脂肪肝的预混料；优选地，全价日粮中每头牛的预混料的添加量为80g/d。
围产期奶牛为了弥补能量的不足，大量动员体内脂肪，激素发生剧烈变化，酯类的分解代谢就会持续发生，过度体脂动员产生的大量非酯化脂肪酸(nefa)在肝脏中蓄积，进而在肝脏中再酯化为甘油三酯(tg)而沉积，最终引发脂肪肝；非酯化脂肪酸(nefa)的另一条代谢途径为经过β-氧化产生酮体，而在此过程会代谢产生大量的自由基，导致肝脏的氧化应激。
现有技术中，应对围产期奶牛脂肪肝的技术方案为在日粮中添加过瘤胃胆碱，过瘤胃胆碱经过瘤胃被小肠吸收，合成磷脂酰胆碱，促进了肝脏中的甘油三脂以极低密度脂蛋白的形式输出。但在本发明的预混料中，开创性地添加了过量的亚硒酸钠(大大高于日粮中硒需求量，远远小于硒中毒剂量)和过瘤胃胆碱联用，实际效果超出预期地远远好于单独使用过瘤胃胆碱对脂肪肝的缓解作用或亚硒酸钠的抗氧化作用。一方面过瘤胃胆碱充分过瘤胃后在小肠中有效吸收，促进了肝脏中的甘油三脂以极低密度脂蛋白的形式输出，减少了甘油三脂在肝中的沉积，缓解了脂肪肝发生风险；另一方面硒作为抗氧化成分在吸收利用后转化成有生物学功能的硒蛋白酶，有效清除了肝脏中nefa代谢产生的自由基氧化产物，增强奶牛肝组织抗氧化能力(一方面缓解了β-氧化过程产生的自由基，另一方面缓解了脂肪肝形成的氧化应激)，保护肝脏发挥正常功能。更为重要的是，此二者的作用和过程在肝脏中能够相互促进，实现良性循环，甘油三酯的排出有效的缓解了肝脏代谢压力和进一步加剧脂肪肝的风险，同时也从侧面一定程度缓解了肝脏组织的氧化应激环境，而此氧化应激环境的改变也使得硒的抗氧化应激作用在甘油三酯代谢这条通路上的抗氧化能力得以更好的发挥，同时硒的抗氧化作用能够良好的解决β-氧化通路上产生的自由基问题，肝脏的氧化应激问题得到了更好的控制，代谢水平更好，反过来可以进一步促进甘油三酯的代谢和排出，如此良性循环，使得脂肪肝和奶牛体内氧化应激均大大得到缓解，进一步有缓解了围产期奶牛消化功能问题(胆汁分泌不足)、提高了其泌乳性能、缓解犊牛应激等系列问题，实际的应用效果实现了1+1远远大于2的效果。
附图说明
图1日粮添加防治围产期奶牛脂肪肝的预混料对围产期奶牛肝组织中gpx1和gpx4的mrna相对表达水平的影响；其中control为对照组，se为实验组一，rpc为实验组二，plp为实验组三。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例一
本实施例为动物实验，实验组分别为实验组一(单独添加亚硒酸钠)、实验组二(单独添加过瘤胃胆碱)、实验组三(本发明的防治围产期奶牛脂肪肝的预混料)以及对照组(无过瘤胃胆碱、无亚硒酸钠)，经过饲喂实验周期，进行了体况、分娩系数、泌乳性能、血液代谢指标等相关数据的测定，以期全面地反应和对照本发明的防治围产期奶牛脂肪肝的预混料对围产期奶牛各个方面的影响。具体实验步骤如下：
实验组一单独添加亚硒酸钠
本组的预混料配方为996.525kg的沸石粉、0.055kg的亚硒酸钠、0.02kg的维生素d、1kg的维生素e、0.8kg的硫酸亚铁、1.6kg的硫酸锌。
将上述组分分别加入粉碎机中研磨，经筛网过筛后得到颗粒物。将各组分的颗粒物放入混合机中混匀，分装为25kg的包装。然后将预混料撒播于日粮(配方见表1，其他三组日粮亦相同)表面，每头牛每天饲喂80g预混料。挑选14头健康的预产期≥15d的围产期奶牛。预试期为预产前15d至预产前10d，正试期从预产前10d开始，至产后45d结束(试验周期共60d)，每周为一采样周期。
表1受试奶牛日粮配方
实验组二单独添加过瘤胃胆碱
本组的预混料配方为46.58kg的沸石粉、950kg的过瘤胃胆碱、0.02kg的维生素d、1kg的维生素e、0.8kg的硫酸亚铁、1.6kg的硫酸锌；其他实验操作同实验组一。
实验组三本发明的防治围产期奶牛脂肪肝的预混料
本组的预混料配方为46.525kg的沸石粉、950kg的过瘤胃胆碱、0.055kg的亚硒酸钠、0.02kg的维生素d、1kg的维生素e、0.8kg的硫酸亚铁、1.6kg的硫酸锌；其他实验操作同实验组一。
对照组无过瘤胃胆碱及亚硒酸钠
对照组的预混料配方为996.58kg的沸石粉、0.02kg的维生素d、1kg的维生素e、0.8kg的硫酸亚铁、1.6kg的硫酸锌；其他实验操作同实验组一。
体况和分娩系数进行评定
对四组奶牛的体况和分娩系数进行评定。体况评分采用5分制，预试期前1天，于挤奶时各进行一次评分，求得日评分平均数；分娩系数测定也采用5分制，即：1＝产犊容易、2＝轻微困难、3＝需要助产、4＝相当困难、5＝需剖腹产。体况和分娩系数结果见表2。
表2奶牛分组信息及产犊数据
泌乳性能检测
采用管道式采集四组奶牛的乳汁，每天06:30、14:00和19:30各挤奶一次。泌乳前3天的乳汁丢弃(或进入泌乳牛棚时开始采集奶样)，产后每试验周期前2天连续记录奶产量，并同时采集奶样，每个奶样按早:中:晚为4:3:3的比例采集(采样管中事先已放入1粒防腐剂，采集间隔4℃保存，共50ml)，送回光明荷斯坦dhi检测中心备检，采用foss-milkoscantmminor乳成分分析仪(minorscanfoss，hillerod，danmark)测定乳常规，包括乳脂、乳蛋白、乳糖、总固形物、尿素氮和体细胞数。
四组奶牛的泌乳性能数据见表3，由表可知：对照组、实验组一、实验组二和实验组三奶牛的平均奶产量分别为38.6、39.1、39.5和40.2kg/d，实验组一至三平均奶产量无显著差异(p﹥0.05)，但与对照组相比，实验组一、实验组二和实验组三奶牛的平均奶产量分别提高了0.5、0.9和1.6kg/d，其中实验组三也就是添加本发明的防治围产期奶牛脂肪肝的预混料的奶牛奶产量增加最多，达到1.6kg/d。实验组一至三奶牛的4％乳脂校正乳相对于对照组有所增加，但无统计学差异(p﹥0.05)。与对照组相比，实验组一至三奶牛的乳脂肪、乳蛋白、乳糖、固形物的百分率及日产量和尿素氮含量均无显著性差异(p﹥0.05)；实验组三对围产期奶牛乳中体细胞数有降低的趋势(p＝0.085)。
表3各个预混料对围产期奶牛泌乳性能的影响
相关血液指标测定
实验组一至三和对照组奶牛的血液样品于预产前第14和7天、分娩当天和分娩后第7、14、21和28天在晨饲前30min采集，用采血针头从受试奶牛的尾静脉处穿刺，并用真空采血管分别采集全部受试奶牛的血样于10ml真空采血管中(肝素钠抗凝)。将抗凝血3500rpm离心10min以分离血浆，将离心获得的血浆转移至高压灭菌的2ml锥形底的ep管中，并保存于-80℃用于测定血浆glucose、nefa、bhba、tc、tg、alt和ast等的浓度；
实验组一至实验组三和对照组奶牛的血液代谢指标数据见表4，由表可知，实验组一至实验组三对围产期奶牛血液中的葡萄糖、nefa、bhba和tc浓度均无显著性影响(p﹥0.05)。实验组二和实验组三显著降低了围产期奶牛血液中tg浓度(p﹤0.05)，实验组一对围产期奶牛的tg浓度无显著影响(p﹥0.05)。实验组一至三均能显著降低围产期奶牛血液中的ast和alt浓度(p﹤0.05)，且实验组三的降低幅度最大。
表4各个预混料对围产期奶牛部分血液代谢指标的影响
注：组间数据肩标小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，相同表示差异不显著(p>0.05)
相关硒水平的测定
每次采集奶样后，分装10ml奶样于-20℃保存，用于乳硒含量测定；每次采集血样后，分装5ml于-20℃保存，用于测定血硒含量；将活体穿刺采集的肝组织样品一份用于肝组织硒含量测定。
实验组一至实验组三和对照组奶奶牛的肝脏中硒含量见表5。由表可知，日粮中添加亚硒酸钠硒(实验组一)和本发明的防治围产期奶牛脂肪肝的预混料(实验组三)能显著提高围产期奶牛乳和血液中的硒水平(p﹤0.05)，但日粮添加过瘤胃胆碱(实验组二)对硒的浓度无显著影响(p﹥0.05)。
表5各个预混料对围产期奶牛血液和肝组织中硒含量的影响
注：组间数据肩标小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，相同表示差异不显著(p>0.05)
相关抗氧化指标的测定
奶牛的肝脏活组织样品于分娩后的第14d采集，从实验组一至三和对照组中分别随机选取7头奶牛进行肝脏组织活体穿刺，样品分为三份，一份用于测定肝硒含量；一份用于肝脏抗氧化指标(t-aoc、gsh-px、sod、mda、h2o2)的测定，参照南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。
另一份肝组织样品按照rnaisoplus说明书的方法提取总rna。采用采用日本takara公司的rna逆转录试剂盒primescripttmrtmastermix(perfectrealtime)将总rna反转录为cdna。
根据genbank中牛β-actin、gpx1和gpx4的mrna序列，设计荧光定量pcr引物，检测肝细胞中gpx1和gpx4mrna表达水平的差异，所用引物序列见表6。
表6实时荧光定量pcr引物序列
采用abi公司的steponeplusreal-timepcrsystem进行实时荧光定量pcr，实时荧光定量pcr数据处理以β-actin为内参，采用2-δδct方法分析目的基因的相对表达差异。计算公式如下：
△ct＝(cttarget–ctβ-actin)timex-(cttarget–ctβ-actin)time0
各处理组奶牛肝组织中抗氧化指标见表7，由表7可知，与对照组和单独添加过瘤胃胆碱组(实验组二)相比，日粮中添加硒的预混料和本发明的预混料(即实验组一和实验组三)能显著提高围产期奶牛肝组织中t-aoc、sod和gpx的酶活性(p﹤0.05)，同时能显著降低围产期奶牛肝组织中mda和h2o2的含量(p﹤0.05)。与对照组相比，日粮中添加过瘤胃胆碱(即实验组二)对围产期奶牛肝组织中t-aoc、sod和gpx的酶活性无显著影响(p﹥0.05)，但能显著降低围产期奶牛肝组织中mda和h2o2的含量(p﹤0.05)。
表7抗氧化指标的测定结果
注：组间数据肩标小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，相同表示差异不显著(p>0.05)
图1显示了日粮添加防治围产期奶牛脂肪肝的预混料对围产期奶牛肝组织中gpx1和gpx4的mrna相对表达水平的影响；由图1可知，与对照组相比，日粮添加硒和防治围产期奶牛脂肪肝的预混料(实验组一和实验组三)的肝组织中gpx1的mrna相对表达水平显著升高(p﹤0.05)，但日粮补充过瘤胃胆碱(即实验组二)对gpx1的mrna相对表达水平无显著影响(p﹥0.05)；与对照组相比，处理组奶牛的gpx4的mrna相对表达水平无显著影响(p﹥0.05)。
本试验数据显示，围产期奶牛补硒(即实验组一)和本发明得到预混料(即实验组三)后奶牛肝脏抗氧化能和gpx1mrna相对表达水平显著升高，而肝脏中mda和h2o2的水平显著下降，且添加防治围产期奶牛脂肪肝的预混料组奶牛的肝脏氧化功能较补硒组奶牛有所提高，但mda和h2o2的水平显著下降显著低于实验组一的奶牛，充分说明了本发明的防治围产期奶牛脂肪肝的预混料在提高奶牛抗氧化能力上充分发挥了硒的生物学功能，同时也兼顾了胆碱清除肝脂维护肝功能的生物学作用，即如发明内容中所述，肝脏内部发生的相互促进的良性循环，使得脂肪肝的缓解和抗氧化水平都大大提高。
综上所述，本发明的一种防治围产期奶牛脂肪肝的预混料(即实验组三)的围产期奶牛的泌乳量提高了1.6kg，而对乳成分没有显著影响，相对于单独补充硒(即实验组一)和过瘤胃胆碱(即实验组二)，产奶量分别提高了1.1和0.7kg/d。同时实验组三对血液中代谢指标如葡萄糖、nefa和bhba水平也无显著影响，但能显著降低围产期奶牛产后血液中tg的含量，促进了肝脏中的tg以vldl形式输出，减少了tg在肝中的沉积，充分发挥了过瘤胃胆碱清除肝脂的功能。此外日粮中添加本发明的防治围产期奶牛脂肪肝的预混料显著降低了围产期奶牛血液中ast和alt的水平，降低肝脏的损伤程度减轻，改善了肝脏的功能。因此将过瘤胃胆碱和亚硒酸钠同时用作护肝预混料对肝脏中脂肪的降解和肝脏的抗氧化效果远远好于单独使用过瘤胃胆碱或亚硒酸钠。
另外，需要指出的是，申请人在实施其他实施例时，将实验组一和实验组三中亚硒酸钠的添加量调整为0.055kg或0.06kg均可以得到相同或近似的技术效果，即亚硒酸钠占预混料总重量的0.05‰-0.06‰均在本发明的保护范围之内。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。