用于提升昆虫免疫力的组合物及方法与流程

本发明涉及一种用于提升昆虫免疫力的组合物及其方法，尤其是针对蜜蜂。

背景技术：

蜜蜂是对人类最有贡献的昆虫之一，除生产多样具健康价值的副产品外，也是农业上重要的作物授粉者。因此，若能提升蜜蜂的免疫力，以提高饲养的蜜蜂的存活率(或防止其死亡)，对相关产业将极有帮助。

技术实现要素：

在一方面，本发明提供一种血桐制备物或萃取物用于制备提升昆虫免疫力的组合物的用途。

另一方面，本发明提供一种用于提升昆虫免疫力的方法，包含对该昆虫施用一有效量的如上述的组合物。

又一方面，本发明提供一种可作为提升昆虫免疫力饲料或营养品的组合物，其包含一血桐制备物或萃取物。

再一方面，本发明提供一种用于防治昆虫病害或死亡的方法，包含对该昆虫施用一有效量的如上述的组合物。

应当理解的是，前文的一般性描述和以下的实施方式都只是例示性和说明性的，而不是对本发明的限制。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本发明的以下实施方式。在附图中：

图1a和图1b显示本发明的组合物能有效降低蜜蜂麻痹病毒(cbpv)感染率(图1a：对照组；图1b：实验组)。

图2a和图2b显示本发明的组合物能通过诱导蜜蜂免疫机制，降低蜜蜂麻痹病毒(cbpv)感染率(图2a：对照组；图2b：实验组)。

图3显示本发明的组合物能延长蜜蜂生存天数。

图4a至图4d显示本发明的组合物能通过诱导个体免疫基因表达提升免疫力进而抑制体内cbpv的增生(图4a：toll；图4b：pelle；图4c：myd88；图4d：dif)。

图5显示本发明的组合物可提高蜜蜂对益达胺的耐受性。

图6显示本发明的组合物可提高健康蜂王的育成率。

具体实施方式

在一方面，本发明提供一种血桐制备物或萃取物用于制备提升昆虫免疫力的组合物的用途。

另一方面，本发明提供一种用于提升昆虫免疫力的方法，包含对该昆虫施用一有效量的如上述的组合物。

又一方面，本发明提供一种可作为提升昆虫免疫力饲料或营养品的组合物，其包含一血桐制备物或萃取物。

再一方面，本发明提供一种用于防治昆虫病害或死亡的方法，包含对该昆虫施用一有效量的如上述的组合物。

根据本发明，该组合物可使用任何现有方法或标准制造方法制备。在本发明的部分具体实施例中，该血桐萃取物是由包含下列步骤的方法制得：以一中高极性溶媒萃取干燥血桐(优选为叶及/或雄蕊)，以获得一第一萃取液；去除该第一萃取液中的不溶物，以获得该血桐萃取物。根据本发明的一具体实施例，干燥血桐叶以一中高极性溶媒(例如，醇类或丙酮)萃取，萃取液浓缩后以吸附性树脂混合，由高至低用不同极性的溶媒(例如，水→甲醇→丙酮)依次洗涤以去除不溶物，萃取液合并浓缩后，得到该血桐萃取物。

在其他具体实施例中，该血桐制备物通过将干燥血桐(优选为叶及/或雄蕊)磨碎为粉末状而制得。

根据本发明实施例，本发明组合物特别对昆虫免疫力的提升有效，尤其是蜜蜂。

由于蜜蜂濒临灭种的危机，本发明还提供一种可作为提升蜜蜂免疫力饲料或营养品的组合物，其包含一血桐萃取物。

实施例

实施例1：本发明的组合物的制备

干燥血桐叶磨碎为粉末状得组合物1。

干燥血桐叶以一中高极性溶媒(例如，醇类或丙酮)萃取，萃取液浓缩后以吸附性树脂混合，由高至低用不同极性的溶媒(例如，水→甲醇→丙酮)依次洗涤以去除不溶物，萃取液合并浓缩后，得到该血桐萃取物，其包含20～25％单宁成份(包括：galloylglucoses,galloylshikimicacids,galloylquinicacids,corilagin,punicafolin,furosin,terchebin,geraniin等)及20～25％类黄酮成份(包括：propolinc、propolind、propolinf、propoling等)，该血桐萃取物可干燥后直接使用或进一步混粉造粒后使用(作为组合物2使用或用于配制组合物2)。

实施例2：本发明的组合物提升蜜蜂抗病力

a.田间试验：

实验分弱势蜂箱组与强势蜂箱组进行，每组均由蜂农挑选六巢蜂势接近的蜂箱，实验组与对照组各三巢，弱势蜂箱组的选择条件为工蜂数量较少且蜂后产卵能力降低的蜂箱，强势蜂箱组的选择条件为蜂势强盛且蜂王由同一蜂后所生的姊妹巢。营养补充剂以花粉饼为载体，实验组喂食含有组合物1的特殊花粉饼，对照蜂箱喂食一般花粉饼，连续喂食一个月后，每巢随机取样24只巢内蜂，检测蜜蜂慢性麻痹病毒(chronicbeeparalysisvirus,cbpv)的感染率的差异。

1.蜂慢性麻痹病毒cbpv的感染率变化

由各组取样工蜂的分离中肠抽取基因组rna，再以q-pcr检测蜜蜂cbpv感染情形。分别观察弱势蜂箱组与强势蜂箱组cbpv感染率的变化，弱势蜂箱处理组在喂食特殊花粉饼一个月后cbpv的感染率由喂食前52.8±19.2％，大幅降低至27.8±14.7％，其中有两个蜂箱cbpv降低比例更大于60％。在强势蜂巢组中，喂食特殊花粉饼一个月后处理组蜂箱cbpv平均感染率由44.4±6.4％显著下降至31.9±2.4％，与对照组蜂箱平均感染率50±8.3％相较仍明显较低。cbpv是蜂场中普遍感染的病毒，试验结果证实，食用含有组合物1的花粉饼的蜂群无论蜂势强弱都可以明显降低cbpv的感染率(参见图1a和图1b)。

2.蜜蜂免疫基因表达量的检测

基因组学研究发现昆虫有四条免疫信号途径，包括toll、imd、jak/stat和jnk，本次试验我们选择研究最多的toll途径相关免疫基因作为标的，检测各组取样工蜂基因组rna中toll、dif、relish等免疫基因表达量。实验结果显示，对照组蜜蜂的toll与dif等免疫基因表限量几乎没有变化，而实验组蜜蜂的toll基因表达量增强1.89～2.51倍(参见图2a和图2b)。证实组合物1能通过诱导蜜蜂免疫机制，降低cbpv感染情形。

b.实验室试验

为进一步证实田间试验的结果，我们由蜂场带回巢脾孵化新生蜜蜂，每次试验均使用同一天羽化后3日龄的新生蜜蜂，以糖水为载体，不同浓度的如实施例1所述的血桐萃取物分别配置于50％(w/v)蔗糖水(组合物2)。每组10只，将试验蜜蜂置于体积250ml布丁杯中，于室温环境中饲养(温度26～30℃；湿度50～60％)，每日提供1ml糖水供蜜蜂自由取食。

1.对蜜蜂生存率的影响

三种浓度(2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml)的血桐萃取物分别配置于50％蔗糖水中，对照组给予50％蔗糖水。实验结果发现第16天时，各组存活率分别为：对照组(30％)、2mg/ml组(30％)、1mg/ml组(80％)、0.5mg/ml组(100％)，结果显示在温湿度与空间体积等不适于蜜蜂生长的逆境环境下喂食含浓度0.5mg/ml血桐萃取物的组合物2，可显著提升蜜蜂的存活率(参见图3)。

2.对蜜蜂免疫基因表达量与cbpv的影响

将上述实验存活的3只对照组蜜蜂与3只0.5mg/ml实验组蜜蜂，进行cbpv与免疫基因toll、dif、pelle与myd88的表达量检测。实验结果如图4a至图4d所示。喂食0.5mg/ml浓度营养补充剂的蜜蜂，其toll、dif、pelle与myd88等基因的表达量均高于对照组蜜蜂2～3倍(toll表达量平均增加2.53倍、myd88表达量平均增加2.89倍、pelle表达量平均增加2.42倍、dif表达量平均增加2.48倍)。cbpv的检测结果发现，对照组三只工蜂中有二只带原cbpv，而实验组蜜蜂体内均未检测到cbpv。综合上述结果，确认实验组蜜蜂免疫基因表达量的提升并非病原刺激诱导所至，而是食用组合物2诱导产生的结果。cbpv能通过蜂后垂直传染给下一代，来自同一巢片同一时间羽化的新生蜜蜂，经过不同处理两周后，体内cbpv感染率却有极大差异，推测食用含血桐萃取物的糖水的蜜蜂可通过诱导个体免疫基因表达提升免疫力进而抑制体内cbpv的增生。

实施例3：本发明的组合物对提升蜜蜂抵抗农药的功效

许多报告证实新尼古丁类药剂会造成蜜蜂与多种生物的免疫系统损害(mason等人,2013)，显见免疫系统的损害可能是益达胺(农药)造成蜜蜂死亡的重要原因之一。根据本发明的组合物对蜜蜂生存率与免疫基因调控的实验结果，本实验以容易接触到农药的外勤蜂作为试验对象，喂食含0.5mg/ml浓度血桐萃取物的糖水，观察是否能增强蜜蜂对益达胺的耐受性。

实验参考美国epaocspp850.3020:honeybeeacutecontacttoxicitytest的方法采表面施药法(topicalapplication)，益达胺原料药以丙酮溶解稀释，试验浓度参考suchail等人(2000)的论文，以24小时内出现的两个半致死剂量(ld50)6.7ng/μl与23.8ng/μl作为试验浓度，将蜜蜂冷冻迷昏后，以微量施药器(microapplicator)将益达胺溶液1μg/蜜蜂定量施用于蜜蜂前胸背板上，溶剂对照组则施用1μg/蜜蜂的丙酮，每组10只蜜蜂，药物施用完毕后将蜜蜂移入恒温生长箱中饲养，实验组蜜蜂提供含0.5mg/ml浓度血桐萃取物的糖水供其取食，对照组则喂食50％蔗糖水，24小时后观察蜜蜂死亡只数，死亡率校正公式为{1-(处理组死亡只数/溶剂对照组死亡)}*100％。

实验结果显示，6.7ng/μl益达胺处理组，食用含血桐萃取物的糖水的蜜蜂24小时平均死亡率为5.26％，明显低于对照组19.30％；23.8ng/μl益达胺处理组，喂食含血桐萃取物的糖水的蜜蜂24小时平均死亡率为17.54％，也显著低于对照组的平均死亡率36.84％(参见图5)，显示食用组合物2可以提高蜜蜂对益达胺的耐受性。

实施例4：本发明的组合物提高健康蜂王的孵育率

依照合作蜂农惯行育王施作方法，于蜂王成长至15日龄时将王台带回实验室羽化，进行新生蜂王体重与健康程度评估。对照组蜂巢产出的蜂王平均体重为163±34.4mg，实验组产出的蜂王平均体重178.1±25.4mg，统计结果显示无显著差异。同时评估不健康的新生蜂王占各组羽化蜂王的比例，若新生蜂王有以下病征：畸翅、舌吐出、无法羽化等则视为不健康。结果显示，对照组蜂箱不健康蜂王比例为38.6％，而实验组蜂巢不健康蜂王比例仅占4.6％(参见图6)，因此，本发明的组合物在蜂王育成上显示有提升健康蜂王产出的效果。