本发明属于制药
技术领域：
，尤其涉及一种含有nadh的组合物、应用及能量补充剂的制备方法。
背景技术：
：在驾车过程中，如果司机疲劳了，会出现以下的情况：(1)速度波动，如在最高速度100公里/小时的路上行驶，要求司机只用踩油门的方式控制行车速度在95公里/小时。如果司机累了，车子的速度会在规定速度上下波动，司机越累行车速度波动越厉害；(2)侧方移位，当司机困了时候，不能保持在道路正中行驶，或左或右，司机越困的行车偏差越厉害。以上两种疲劳驾驶情况是非常危险的。通常，司机为了通过喝功能性饮料来抵抗瞌睡和疲劳。能量饮料中，可提神、补充能量的主要添加成分是人工咖啡因、牛磺酸、vb族等。但是含有人工咖啡因的能量饮料容易导致身体对咖啡因的习惯化，刺激胃粘膜，增加胃酸分泌等，不能满足人们对食品、饮料等的更健康、更天然的追求诉求。能量饮料是为人体补给能量的饮料，其中所含的维生素(一般为b族维生素)和碳水化合物(主要是白砂糖、蔗糖)在相互作用下转化为能量，给饮用者补充体力、缓解疲劳。目前市场上的很多补充人体能量的饮料，大部分都是含有激素的能量饮料，虽然能暂时补充能量，但是有副作用，严重影响人体的健康。目前市场上销售的红牛抗疲劳饮料，是由咖啡因、牛磺酸、赖氨酸、肌醇、维生素b6、维生素b12、柠檬酸、苯甲酸钠、柠檬黄、胭脂红、白砂糖以及水组成。有一定的抗疲劳功效，但是对于降低长时间开车产生的疲劳感作用不是特别有效。因此，有必要针对性的开发一种能抗疲劳从而实现安全驾驶目标的健康的功能性饮料。技术实现要素：本发明目的在于解决现有组合物的不足之处，提供一种抗疲劳，安全健康的能量补充剂。为了解决上述问题，本发明提供一种含有nadh的组合物的应用以及能量补充剂的制备方法。具体方案如下：第一方面，本发明提出一种含有nadh的组合物，所述组合物包括以下重量份组分：1-10份nadh、1-10份辅酶q10、1-10份硫酸软骨素、1-10份熊去氧胆酸、1-10份糖基的大豆异黄酮、1-10份s-腺苷蛋氨酸，1-10份γ-氨基丁酸、1-10份ppd以及1-10份rh2。其进一步地技术方案为：还包括辅料，所述辅料包括以下重量份组分的至少一种：0.01-0.05份氯化钠、0.01-0.05份氯化钾、0.001-0.005份维生素b12、0.001-0.01份维生素c、0.001-0.005份维生素b6、0.02-0.05份牛磺酸，3-6份蜂蜜、0.005-0.01份氯化镁。其进一步地技术方案为：还包括辅料，所述辅料包括以下重量份组分的至少五种：0.01-0.05份氯化钠、0.01-0.05份氯化钾、0.001-0.005份维生素b12、0.001-0.01份维生素c、0.001-0.005份维生素b6、0.02-0.05份牛磺酸，3-6份蜂蜜、0.005-0.01份氯化镁。本发明还提出了上述任一项技术方案所述的含有nadh的能量补充剂在制备制备缓解和/或降低疲劳的饮料中的应用。第二方面，本发明提出一种含有nadh的组合物的能量补充剂，包括如第一方面所述的组合物。本发明还提出一种制备如第二方面所述的含有nadh的组合物的能量补充剂的方法，包括如下步骤：s1、将nadh、辅酶q10、硫酸软骨素、熊去氧胆酸、糖基的大豆异黄酮、s-腺苷蛋氨酸，γ-氨基丁酸、ppd以及rh2分别干燥、粉碎、过30-80目筛，并按比例称重混合；s2、向步骤s1中的原料加入水搅拌混匀，然后升温至50-60℃浸提1-3h，得到混合物；s3、对步骤s2中的混合物过滤，得到浸提液；s4、在沸水中加入步骤s3的浸提液和辅料混合均匀，保持温度在50-60℃，均质处理，脱气、灭菌、罐装，得到含有nadh的能量补充剂。其进一步地技术方案为：所述步骤s2中的原料与水的质量比为1：5-10。其进一步地技术方案为：所述步骤s3中得到的浸提液与步骤s2中加入水的体积比为1/5-3/5。其进一步地技术方案为：所述步骤s4中的辅料用水溶解完全后，再加入沸水中，所述辅料与水的质量比为1：0.5-5。其进一步地技术方案为：所述步骤s4中的浸提液：沸水的体积比为1：5-40。与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：本发明提供的富含nadh组合物的能量补充剂不仅在营养成分和含量满足适应运动或体力活动人群的生理特点，还能被迅速渗透吸收，达到补充水分、电解质和能量的效果，使动员快速恢复体力。本发明可根据需要适当调整氯化钠、氯化钾的添加量，使最终产品的稳定性得到保证。此外，本发明采用特定的成分特定的配比，组方合理，配伍得当，本发明所选成分配伍相宜，符合中医药和现代医药相结合的理论，使用方便，吸收效果好，无不良及毒副作用，经临床验证，能有效的在短时间内提高人体的能量供应，在运动饮料领域具有很大的推广和应用前景。本发明所述的含有nadh的能量补充剂的制剂的制备方法，步骤简单、条件温和，适宜于工业化批量生产。具体实施方式以下通过实施例和实验来具体阐述本发明的内容，这些实施例和实验只是为了进一步说明本发明的内容而阐述的，本发明的权利范围不受这些实施例和实验所记载内容的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1本实施例提供一种含有nadh的组合物，以重量份计，所述组合物包括1份nadh、3份辅酶q10、7份硫酸软骨素、5份熊去氧胆酸、10份糖基的大豆异黄酮、3份s-腺苷蛋氨酸，1份γ-氨基丁酸、6份ppd以及2份rh2。本发明实施例提供的含有nadh的组合物，其中，nadh(即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的制备方法包括：提取烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的粗提物或其纯酶；固定化重组烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的粗提物或其纯酶；用固定化重组烟酰胺核苷腺苷酰转移酶催化，以烟酰胺核苷酸和三磷酸腺苷二钠(atp)为底物制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。具体操作步骤如下：将含烟酰胺核苷腺苷酰转移酶基因的质粒prset-bmj转化感受态细菌细胞e.colihb101，在luriabroth(lb)平板(含100mg/l卡那霉素)上37℃培养24小时。接种单个克隆于5毫升lb液体培养基(含100mg/l卡那霉素)中于30℃培养2024小时。离心收集菌体，并悬浮于1毫升100mmtris盐酸缓冲液(ph7.5)中。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10℃，17,800g，10分钟)并收集上清液，即为粗提蛋白(或称粗提物)。重组的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶粗提蛋白经70℃热处理10分钟，离心(10℃，17,800g，10分钟)并收集上清液，即为部分纯化的蛋白。烟酰胺核苷腺苷酰转移酶固定化取烟酰胺核苷腺苷酰转移酶粗提蛋白或部分纯化的蛋白，用洗酶缓冲液(0.02mtrishcl/0.001medta，ph7.0溶液)稀释至蛋白含量5-10mg/ml。将酶稀释液与pb溶液(2.0mol/l磷酸二氢钾，ph7.5)等体积混合，加入环氧型固定化酶载体lx-3000(10毫克酶/克载体)，于摇床(转速100rpm)中25℃反应20小时。反应完成后用滤袋过滤，用洗酶缓冲液清洗5-6次，得到固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶。用固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸配制底物溶液：含5mm的烟酰胺核苷酸、10mm的三磷酸腺苷二钠(atp)、100mmtris盐酸缓冲液和终浓度为10mm的mgcl2，调ph至7.5。取底物溶液1毫升，然后加入0.05克固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶，于37℃进行反应2-20小时。离心(10℃，17,800g，15分钟)并收集上清液。通过高效液相色谱(hplc)测定所得上清液中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量。结果，烟酰胺核苷酸转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的转化率超过80％。本实施例还提出了上述含有nadh的组合物在制备缓解和/或降低疲劳的饮料中的应用。例如，本实施例提出一种含有nadh的组合物的能量补充剂，所述能量补充剂通过如下步骤制备：s1、将组合物中的各组分分别干燥、粉碎、过30目筛，使颗粒度分布均匀，流动性更好，按各组分比例称重混合均匀；s2、向步骤s1得到的混合物中加5倍量的水搅拌混匀，在25℃下搅拌混合均匀，然后升温至50℃后浸提1h，得到含有nadh的混合物。s3、对步骤s2中的混合物过滤，得到浸提液，浸提液为s2中加水的体积的2/5；s4、在浸提液5倍体积的沸水中加入步骤s3的浸提液和适当的调味剂，混合均匀，保持温度在50℃，均质处理2次，时溶液更加微细话，增强溶液的稳定效果，对均质后的溶液进行脱气、灭菌、罐装，得到含有nadh的组合物的能量补充剂。在本实施例中，可依据口感添加适宜的调味剂如白糖、蜂蜜、食用盐等，本发明对此不做具体限定。本实施例提供的富含nadh组合物的能量补充剂不仅在营养成分和含量满足适应运动或体力活动人群的生理特点，还能被迅速渗透吸收，达到补充水分、电解质和能量的效果，使动员快速恢复体力。实施例2本实施例提供一种含有nadh的组合物，以重量份计，所述组合物包括5份nadh、7份辅酶q10、1份硫酸软骨素、9份熊去氧胆酸、1份糖基的大豆异黄酮、10份s-腺苷蛋氨酸，5份γ-氨基丁酸、10份ppd以及7份rh2；以及辅料，辅料包括0.01份氯化钠、0.01份氯化钾以及0.005份维生素b12。本实施例还提出了上述含有nadh的组合物在制备缓解和/或降低疲劳的饮料中的应用。例如，本实施例提出一种含有nadh的组合物的能量补充剂，所述能量补充剂通过如下步骤制备：s1、将nadh、辅酶q10、硫酸软骨素、熊去氧胆酸、糖基的大豆异黄酮、s-腺苷蛋氨酸，γ-氨基丁酸、ppd以及rh2分别干燥、粉碎、过50目筛，使颗粒度分布均匀，流动性更好，并按比例称重混合；s2、向步骤s1得到的混合物中加8倍量的水搅拌混匀，在25℃下搅拌混合均匀，然后升温至56℃后浸提1.5h，得到含有nadh的混合物。s3、对步骤s2中的混合物过滤，得到浸提液，浸提液为s2中加水的体积的3/5；s4、在浸提液15倍体积的沸水中加入步骤s3的浸提液、预先用0.5倍量的水溶解好的辅料和适当的调味剂，混合均匀，保持温度在55℃，均质处理2次，时溶液更加微细话，增强溶液的稳定效果，对均质后的溶液进行脱气、灭菌、罐装，得到含有nadh的组合物的能量补充剂。实施例3本实施例提供一种含有nadh的组合物，以重量份计，所述组合物包括7份nadh、8份辅酶q10、4份硫酸软骨素、6份熊去氧胆酸、3份糖基的大豆异黄酮、10份s-腺苷蛋氨酸，4份γ-氨基丁酸、1份ppd以及10份rh2；以及辅料，辅料包括0.05份氯化钠、0.003份维生素b12、0.01份维生素c、0.004份维生素b6、0.05份牛磺酸以及0.009份氯化镁。本实施例还提出了上述含有nadh的组合物在制备缓解和/或降低疲劳的饮料中的应用。例如，本实施例提出一种含有nadh的组合物的能量补充剂，所述能量补充剂通过如下步骤制备：s1、将nadh、辅酶q10、硫酸软骨素、熊去氧胆酸、糖基的大豆异黄酮、s-腺苷蛋氨酸，γ-氨基丁酸、ppd以及rh2分别干燥、粉碎、过40目筛，使颗粒度分布均匀，流动性更好，并按比例称重混合；s2、向步骤s1得到的混合物中加10倍量的水搅拌混匀，在40℃下搅拌混合均匀，然后升温至60℃后浸提2h，得到含有nadh的混合物。s3、对步骤s2中的混合物过滤，得到浸提液，浸提液为s2中加水的体积的1/2；s4、在浸提液40倍体积的沸水中加入步骤s3的浸提液、预先用5倍量的水溶解好的辅料和适当的调味剂，混合均匀，保持温度在60℃，均质处理2次，时溶液更加微细话，增强溶液的稳定效果，对均质后的溶液进行脱气、灭菌、罐装，得到含有nadh的组合物的能量补充剂。实施例4本实施例提供一种含有nadh的组合物，以重量份计，所述组合物包括10份nadh、10份辅酶q10、10份硫酸软骨素、1份熊去氧胆酸、7份糖基的大豆异黄酮、6份s-腺苷蛋氨酸，10份γ-氨基丁酸、3份ppd以及10份rh2；以及辅料，辅料包括0.02份氯化钠、0.03份氯化钾、0.002份维生素b12、0.005份维生素c、0.002份维生素b6、0.03份牛磺酸以及0.001份氯化镁。本实施例还提出了上述含有nadh的组合物在制备缓解和/或降低疲劳的饮料中的应用。例如，本实施例提出一种含有nadh的组合物的能量补充剂，所述能量补充剂通过如下步骤制备：s1、将nadh、辅酶q10、硫酸软骨素、熊去氧胆酸、糖基的大豆异黄酮、s-腺苷蛋氨酸，γ-氨基丁酸、ppd以及rh2分别干燥、粉碎、过80目筛，使颗粒度分布均匀，流动性更好，并按比例称重混合；s2、向步骤s1得到的混合物中加20倍量的水搅拌混匀，在40℃下搅拌混合均匀，然后升温至54℃后浸提3h，得到含有nadh的混合物。s3、对步骤s2中的混合物过滤，得到浸提液，浸提液为s2中加水的体积的1/5；s4、在浸提液30倍体积的沸水中加入步骤s3的浸提液、预先用0.8倍量的水溶解好的辅料和适当的调味剂，混合均匀，保持温度在54℃，均质处理2次，时溶液更加微细话，增强溶液的稳定效果，对均质后的溶液进行脱气、灭菌、罐装，得到含有nadh的组合物的能量补充剂。实施例5本实施例提供一种含有nadh的组合物，以重量份计，所述组合物包括3份nadh、4份辅酶q10、5份硫酸软骨素、10份熊去氧胆酸、5份糖基的大豆异黄酮、8份s-腺苷蛋氨酸，8份γ-氨基丁酸、7份ppd以及5份rh2；以及辅料，辅料包括0.04份氯化钠、0.05份氯化钾、0.004份维生素b12、0.008份维生素c、0.004份维生素b6、0.04份牛磺酸以及6份蜂蜜。本实施例还提出了上述含有nadh的组合物在制备缓解和/或降低疲劳的饮料中的应用。例如，本实施例提出一种含有nadh的组合物的能量补充剂，所述能量补充剂通过如下步骤制备：s1、将nadh、辅酶q10、硫酸软骨素、熊去氧胆酸、糖基的大豆异黄酮、s-腺苷蛋氨酸，γ-氨基丁酸、ppd以及rh2分别干燥、粉碎、过80目筛，使颗粒度分布均匀，流动性更好，并按比例称重混合；s2、向步骤s1得到的混合物中加18倍量的水搅拌混匀，在30℃下搅拌混合均匀，然后升温至51℃后浸提2.5h，得到含有nadh的混合物。s3、对步骤s2中的混合物过滤，得到浸提液，浸提液为s2中加水的体积的3/10；s4、在浸提液25倍体积的沸水中加入步骤s3的浸提液、预先用1倍量的水溶解好的辅料和适当的调味剂，混合均匀，保持温度在51℃，均质处理2次，时溶液更加微细话，增强溶液的稳定效果，对均质后的溶液进行脱气、灭菌、罐装，得到含有nadh的组合物的能量补充剂。实验例-能量补充剂的活性检测(1)动物实验选取健康昆明种雄性小鼠180只，体重(20±2)g。按体重随机将生长正常、会游泳的实验小鼠分为3组：实验i组灌胃实施例2的nadh能量补充剂，对照组1灌胃某市售多肽型运动饮料，对照组2灌胃生理盐水，每组60只，实验室饲养1周后灌胃给药，剂量按体表面积比率折算等效剂量为0.1ml·10g-1，每日1次，连续21d。实验期间，小鼠自由摄食及饮水。(2)小鼠生长速率的测定实验之前和之后各称量一次实验小鼠的体重，计算平均净增质量。结果见表1。组别实验前质量/g实验结束时质量/g平均净增质量/gⅰ组20.78±1.0835.58±1.0914.8±0.52对照组119.18±1.7833.54±0.6014.36±1.62对照组220.11±1.9235.84±0.6015.73±1.30表1不同处理对小鼠生长速度的影响由表1可知，3组小鼠灌胃21d试验结果表明，i组和对照组1、2的小鼠平均净增质量无显著性差异。因此含有nadh的能量补充剂不影响小鼠机体的生长发育。(3)能量补充剂安全性检测在21d喂养期间，观察3组小鼠中每只的摄食、饮水、大小便情况，观察生长发育、行为是否正常，以及是否有中毒表现，实验结束后，检查各受试小鼠的肝、心、肺、肾、空肠、脾脏、胸腺和睾丸是否受到损伤或病变。结果显示，在21d喂养期间，3组小鼠的摄食、饮水、大小便正常，生长发育良好，未观察到明显行为改变和中毒表现，试验结束时将小鼠解剖对其肝、心、肺、肾、空肠、脾脏、胸腺和睾丸进行健康检查，未发现明显病变，各组动物脏器均未见由受试物引起的损害性改变，因此含有nadh组合物的能量补充剂是安全无毒的。(4)小鼠游泳能力试验小鼠连续灌胃21d，末次灌胃30min后，进行负重游泳实验。在小鼠尾部1/3处负重质量为5％体重的铅皮，投入水深30cm、水温25-30℃的游泳箱中游泳，观察和记录小鼠自入水后到沉入水中10s不能浮出水面(处于力竭状态)的时间。结果见表2。组别力竭游泳所需时间/minⅰ组56.0±2.1对照组136.7±2.0对照组230.8±1.8表2含有nadh的能量补充剂对小鼠负重游泳时间的影响负重游泳实验室是评价抗疲劳作用的动物模型，游泳时间的长短与运动耐力有关，可以反应动物运动疲劳的程度。本试验中，小鼠给予不同的能量补充剂喂养以后，与对照组1、2相比，i组、iv组处理可显著延长小鼠负重游泳时间，与ii组、iii组均存在显著性差异，但这两组之间无显著性差异，因此，可知含有nadh的能量补充剂具有一定的抗疲劳的作用。(5)小鼠生化指标的测定将游泳力竭后小鼠从水中捞出，立即眼眶采血0.5ml，分离血清，检测血清中血乳酸(lac)、超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)和血清尿素氮(bun)的含量。然后将采血后实验小鼠立即处死。分离肝脏，经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏200mg，用蒽酮比色法测定各组小鼠肝糖原的含量。结果如表3所示。组别lac％肝糖原(mg)sod(u/ml)mda(mmol/ml)bun(mg/ml)ⅰ组37.81±1.515.53±0.6523.53±1.418.53±0.4514.53±1.05对照组143.39±1.783.83±0.6115.56±1.349.16±0.6119.13±1.12对照组248.63±1.252.46±0.1513.03±1.1510.97±0.4520.11±1.03表3小鼠生化指标的测定结果由上表可知，对小鼠连续灌胃21d后，i组的血乳酸含量、丙二醛含量低，肝糖原、超氧化物歧化酶含量较高，与对照组1和对照组2存在显著性差异。本发明提供的含有nadh组合物的能量补充剂具有良好的协同作用，各组分共同使用，产生了增效的效果。在运动时，肌肉通过糖酵解反应产生了大量的乳酸，由乳酸解离所生成的氢离子使肌肉中的氢离子浓度上升，ph值下降，进而引起一系列的生化变化，导致疲劳，减少乳酸的产生或加速乳酸的清除可引起抗疲劳的作用，丙二醛是衡量基体自由基代谢的敏感指标，其含量能客观地反应基体产生自由基的水平。本实验结果表明nadh能量补充剂可抑制脂质过氧化，减少乳酸堆积，较快消除运动疲劳的作用。糖原是运动中最重要的能源物质，体内糖原的水平与耐久力密切相关，糖原贮备的提高有利于基体耐力速度的提高和运动时间的延长。超氧化物歧化酶在组织内能清除机体内过多的氧自由基，可提高人体免疫力，增强抗氧化能力，抗氧化剂已成为一类重要的运动营养补剂。实验中灌胃含有nadh组合物的能量补充剂后，小鼠超氧化物歧化酶含量、糖原含量显著增加，从而证明含有nadh组合物的能量补充剂具有增强小鼠的抗氧化能力，消除运动疲劳的功能。含有nadh组合物的能量补充剂作用机制可能是通过增加力竭运动过程中肝糖原的储备，显著降低代谢产物mda、bun的水平，提高sod活性，加速自由基的清除，增强小鼠的抗氧化能力，减轻基体的氧化损伤，来提高小鼠的运动能力，起到抗疲劳作用。以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12