一种天然北五味子果汁的生物降酸方法与流程

本发明属于生物降酸方法，尤其是指一种北五味子果汁的生物降酸方法。

背景技术：

北五味子是我国传统的药食同源中药材，为木兰科植物五味子schisandrachinensis(turcz.)baill.的干燥成熟果实，习称“北五味子”。分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西、宁夏、甘肃、山东等地。具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心之功效。常用于久嗽虚喘，梦遗滑精，遗尿尿频，久泻不止，自汗盗汗，津伤口渴，内热消渴，心悸失眠。

北五味子主要成分为木脂素、挥发油、多糖、多酚、有机酸等成分。因其具有极高的营养价值和药理保健功能，被认为是品质优良的食品原料，然而，北五味子中的可滴定酸含量与柠檬接近，酸度过高导致北五味子糖酸比例不协调，口感风味不佳，高浓度的有机酸和较低的ph值对人体牙釉质和牙本质也具有腐蚀作用，制约了北五味子果汁的深度开发。因此在保持浓郁香气和营养成分的前提下，降低酸度是改善北五味子口感和生产北五味子保健产品的重要保障。

目前降酸的方法主要有化学法、树脂法和生物法。化学降酸法是通过加入caco3等化学试剂，使其发生中和反应来降低果汁中的部分有机酸，但这种方法在果汁储藏过程中会产生盐类沉淀，且外源性化学试剂的加入也会对降酸后的产品使用安全性造成影响；树脂降酸法主要采用碱性离子交换树脂对北五味子果汁中的酸性成分进行吸附，已达到降酸的目的，然而，此法会使北五味子果汁中的营养成分大量流失，在降酸的同时也降低了北五味子果汁的附加值；生物降酸法主要是利用微生物代谢这一特性，在一定的条件下，分解北五味子果汁中的有机酸，形成酸度较低的其他活性物质，从而达到降低酸度的目的，该方法相较上述两种方法而言，具有条件绿色、反映温和、食用安全性高等优点，可以作为北五味子果汁生物降酸的主要手段。目前尚没有关于北五味子果汁生物降酸的中国专利，仅有一篇硕士论文(李铁柱.不同降酸方法对五味子汁降酸效应的研究[d].吉林农业大学,2014.)记载了一种北五味子生物碱酸的摸索性实验，然而，该论文所提到的方法具有很多不足和局限性，例如：①论文中所使用的“果汁”是利用热水从市售的五味子干燥果实中提取出来的浸提液，其成分与天然北五味子果汁具有较大的差别，且不同的北五味子果实干燥方法和果汁提取方法对于果汁中酸性成分的组成和含量具有极大的影响，直接干扰后续生物降酸工艺的稳定性，不能保证该方法的普遍推广；②其所使用的菌种为粟酒裂殖酵母，该菌种并没有列入中华人民共和国国家卫生健康委员会(卫健委)允许在食品及保健食品工业上使用的菌种列表名单中，该菌种的自身代谢产物是否对人体有害并没有得到科学的证明，因此利用该菌种对北五味子果汁进行降酸存在一定的生物安全问题；③该论文仅仅利用酸碱滴定法对北五味子果实水提液的酸度变化进行考察，方法的准确性和精密度有待商榷，且忽视了该方法对于北五味子果汁中活性成分变化的考察，物质基础不明确；④该论文只是对于北五味子果汁的生物降酸试验进行了一次尝试，其方法的降酸效果并不明显，既没有突出生物降酸的优势，也不能满足北五味子果汁深度开发的要求。

技术实现要素：

本发明提供一种天然北五味子果汁的生物降酸方法，以解决目前存在的降酸效果不明显的问题。

本发明采取的技术方案是：包括下列步骤：

(1)、发酵菌种的种子液配置

1)灵芝菌(ganodermalucidum)的斜面培养

将复苏或活化的灵芝菌接入到制备好的斜面后，放入恒温恒湿培养箱中，26～30℃培养5～6天，取出使用；

2)灵芝菌液体种子液的配制

用无菌0.9％氯化钠水溶液冲洗5～6天菌龄的灵芝菌斜面，通过在显微镜下观察血小球计数板读书，将洗下来的孢子液稀释至10⁷孢子/毫升，接下来将孢子悬液以体积比2.5％～7.5％接入到制备好的灵芝菌液体种子液培养基中，在150～180转/分钟、26～30℃的恒温摇床中进行培养3～4天，备用；

(2)北五味子果汁的生物降酸

称取北五味子果实冻干粉1份，加入质量比0.01％～0.03％的维生素b1，溶解于15倍体积的纯净水中，溶解后在121℃的高压灭菌锅中灭菌15分钟～25分钟；取出果汁溶液，在超净工作台中放至室温，按照体积比5％～7.5％的接种量接入菌龄为3～4天的灵芝菌液体种子液，在150～180转/分钟、26～30℃的恒温摇床中培养10～12天后，取出，8000～10000转/分钟，离心10～15分钟，取上清液，过5～120微米孔径的滤纸或滤膜，冻干后即得到降酸后的北五味子果汁粉末。

本发明所述步骤(1)中灵芝菌(ganodermalucidum)的斜面培养是：

pda斜面培养基的配方和制备方法如下：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂24g/l，ph自然。将马铃薯洗净，去皮，切成小块，放入适量水中煮烂，用八层滤布过滤出残渣，缓慢均匀的加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂完全溶解后，再缓慢地加入葡萄糖，搅拌均匀，边搅拌边补足减失的水分，趁热将溶液分装于各试管中，用棉塞塞紧瓶口，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌15分钟～25分钟，待灭菌器内温度降到50℃时，取出试管，在无菌操作台上铺成斜面。

本发明所述步骤(1)中灵芝菌液体种子液的配制是：灵芝菌液体种子液培养基的配方和制备方法如下：蛋白胨10g/l、酵母浸粉2g/l、葡萄糖20g/l、硫酸镁0.5g/l、碳酸钙0.1g/l、硫酸锰0.1g/l、磷酸二氢钾1g/l、维生素b110mg/l、蒸馏水1000ml，ph自然；将称量好的各固体试剂放入洁净的锥形瓶中，加蒸馏水溶解，搅拌均匀，至完全溶解后，分装于干净的锥形瓶中，用无菌透气封口膜封好，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌15分钟～25分钟，灭菌完成后取出，放入无菌接种室中晾凉，备用。

本发明所述北五味子果实冻干粉的制备方法：取新鲜的北五味子果实，除梗，洗净，用8～16层纱布包裹绞汁，果汁用5～120微米孔径的滤纸或滤膜过滤后，冻干。

本发明优点是：

本发明从卫健委规定的食品及保健食品工业允许使用的发酵菌种列表中筛选出了生物安全度较好、遗传稳定性较高的药食两用真菌作为北五味子果汁生物降酸的发酵菌种，在无需添加外源性碳源和氮源的基础上优化出一套系统稳定的北五味子果汁生物降酸工艺，并对降酸之后的主要活性成分进行了含量分析，初步阐明了果汁酸度降低的原理。

本发明首次将生物发酵技术应用于天然北五味子果汁的降酸工艺，将天然北五味子果汁的ph值从≈1.6提高到≈3.3，滴定酸度从14.7g/l降低到6.9g/l，与原果汁相比酸度降低了约53％，远远高于目前已报道的北五味子果汁生物降酸技术(酸度降低约15％)。

选择菌种是卫健委规定的允许在保健食品工业上使用的药食同源的真菌，工艺简便、营养成分背景清晰，在降酸的同时，果汁中活性多糖的含量上升约61.5％，提高了北五味子果汁的营养附加值。

目前关于北五味子果汁发酵的研究主要集中在果酒、果醋和酸奶的产品开发上面，具有一定的局限性，本发明在保持北五味子果汁特殊风味的基础上建立绿色、温和、安全的降酸工艺，在达到降酸目的的同时，保持了北五味子独特的风味，得到的北五味子降酸果汁可以作为多种保健食品和健康产品的原料，为相关保健食品和健康产品的开发奠定基础，开发潜力巨大。

附图说明

图1是比色法绘制的葡萄糖标准曲线图；

图2是比色法绘制的芦丁标准曲线图；

图3是比色法绘制的没食子酸标准曲线图；

图4是北五味子果汁生物降酸前后单糖含量变化图。

具体实施方式

实施例1

包括下列步骤：

(1)、发酵菌种的种子液配置

1)灵芝菌(ganodermalucidum)的斜面培养

pda斜面培养基的配方和制备方法如下：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂24g/l，ph自然。将马铃薯洗净，去皮，切成小块，放入适量水中煮烂(用玻璃棒能戳破即可)，用八层滤布过滤出残渣，缓慢均匀的加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂完全溶解后，再缓慢地加入葡萄糖，搅拌均匀，边搅拌边补足减失的水分，趁热将溶液分装于各试管中，用棉塞塞紧瓶口，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌15分钟，待灭菌器内温度降到50℃时，取出试管，在无菌操作台上铺成斜面；

将复苏或活化的灵芝菌接入到制备好的斜面后，放入恒温恒湿培养箱中，26℃培养6天，观察到白色菌丝布满整个斜面，即可取出使用。

2)灵芝菌液体种子液的配制

灵芝菌液体种子液培养基的配方和制备方法如下：蛋白胨10g/l、酵母浸粉2g/l、葡萄糖20g/l、硫酸镁0.5g/l、碳酸钙0.1g/l、硫酸锰0.1g/l、磷酸二氢钾1g/l、维生素b110mg/l、蒸馏水1000ml，ph自然；将称量好的各固体试剂放入洁净的锥形瓶中，加蒸馏水溶解，搅拌均匀，至完全溶解后，分装于干净的锥形瓶中，用无菌透气封口膜封好，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌15分钟，灭菌完成后取出，放入无菌接种室中晾凉，备用；

用无菌0.9％氯化钠水溶液冲洗6天菌龄的灵芝菌斜面，通过在显微镜下观察血小球计数板读书，将洗下来的孢子液稀释至10⁷孢子/毫升，接下来将孢子悬液以体积比2.5％接入到制备好的灵芝菌液体种子液培养基中，在150转/分钟、26℃的恒温摇床中进行培养4天，当瓶中的生长状态为大小均匀的星芒状白色菌球时，即可备用；

(2)北五味子果汁的生物降酸

取新鲜的北五味子果实，除梗，洗净，用8层纱布包裹绞汁，果汁用5微米孔径的滤纸或滤膜过滤后，冻干；称取冻干粉1份，加入质量比0.01％的维生素b1，溶解于15倍体积的纯净水中，溶解后在121℃的高压灭菌锅中灭菌15分钟；取出果汁溶液，在超净工作台中放至室温，按照体积比5％的接种量接入菌龄为4天的灵芝菌液体种子液，在150转/分钟、26℃的恒温摇床中培养12天后，取出，8000转/分钟，离心10分钟，取上清液，过5微米孔径的滤纸或滤膜，冻干后即得到降酸后的北五味子果汁粉末。

实施例2

包括下列步骤：

(1)、发酵菌种的种子液配置

1)灵芝菌(ganodermalucidum)的斜面培养

pda斜面培养基的配方和制备方法如下：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂24g/l，ph自然。将马铃薯洗净，去皮，切成小块，放入适量水中煮烂(用玻璃棒能戳破即可)，用八层滤布过滤出残渣，缓慢均匀的加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂完全溶解后，再缓慢地加入葡萄糖，搅拌均匀，边搅拌边补足减失的水分，趁热将溶液分装于各试管中，用棉塞塞紧瓶口，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌25分钟，待灭菌器内温度降到50℃时，取出试管，在无菌操作台上铺成斜面；

将复苏或活化的灵芝菌接入到制备好的斜面后，放入恒温恒湿培养箱中，30℃培养5天，观察到白色菌丝布满整个斜面，即可取出使用。

2)灵芝菌液体种子液的配制

灵芝菌液体种子液培养基的配方和制备方法如下：蛋白胨10g/l、酵母浸粉2g/l、葡萄糖20g/l、硫酸镁0.5g/l、碳酸钙0.1g/l、硫酸锰0.1g/l、磷酸二氢钾1g/l、维生素b110mg/l、蒸馏水1000ml，ph自然；将称量好的各固体试剂放入洁净的锥形瓶中，加蒸馏水溶解，搅拌均匀，至完全溶解后，分装于干净的锥形瓶中，用无菌透气封口膜封好，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌25分钟，灭菌完成后取出，放入无菌接种室中晾凉，备用；

用无菌0.9％氯化钠水溶液冲洗5天菌龄的灵芝菌斜面，通过在显微镜下观察血小球计数板读书，将洗下来的孢子液稀释至10⁷孢子/毫升，接下来将孢子悬液以体积比7.5％接入到制备好的灵芝菌液体种子液培养基中，在180转/分钟、30℃的恒温摇床中进行培养3天，当瓶中的生长状态为大小均匀的星芒状白色菌球时，即可备用；

(2)北五味子果汁的生物降酸

取新鲜的北五味子果实，除梗，洗净，用16层纱布包裹绞汁，果汁用120微米孔径的滤纸或滤膜过滤后，冻干；称取冻干粉1份，加入质量比0.03％的维生素b1，溶解于15倍体积的纯净水中，溶解后在121℃的高压灭菌锅中灭菌25分钟；取出果汁溶液，在超净工作台中放至室温，按照体积比7.5％的接种量接入菌龄为4天的灵芝菌液体种子液，在180转/分钟、30℃的恒温摇床中培养10天后，取出，10000转/分钟，离心15分钟，取上清液，过120微米孔径的滤纸或滤膜，冻干后即得到降酸后的北五味子果汁粉末。

实施例3

包括下列步骤：

(1)、发酵菌种的种子液配置

1)灵芝菌(ganodermalucidum)的斜面培养

pda斜面培养基的配方和制备方法如下：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂24g/l，ph自然。将马铃薯洗净，去皮，切成小块，放入适量水中煮烂(用玻璃棒能戳破即可)，用八层滤布过滤出残渣，缓慢均匀的加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂完全溶解后，再缓慢地加入葡萄糖，搅拌均匀，边搅拌边补足减失的水分，趁热将溶液分装于各试管中，用棉塞塞紧瓶口，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20分钟，待灭菌器内温度降到50℃时，取出试管，在无菌操作台上铺成斜面；

将复苏或活化的灵芝菌接入到制备好的斜面后，放入恒温恒湿培养箱中，28℃培养5.5天，观察到白色菌丝布满整个斜面，即可取出使用。

2)灵芝菌液体种子液的配制

灵芝菌液体种子液培养基的配方和制备方法如下：蛋白胨10g/l、酵母浸粉2g/l、葡萄糖20g/l、硫酸镁0.5g/l、碳酸钙0.1g/l、硫酸锰0.1g/l、磷酸二氢钾1g/l、维生素b110mg/l、蒸馏水1000ml，ph自然；将称量好的各固体试剂放入洁净的锥形瓶中，加蒸馏水溶解，搅拌均匀，至完全溶解后，分装于干净的锥形瓶中，用无菌透气封口膜封好，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20分钟，灭菌完成后取出，放入无菌接种室中晾凉，备用；

用无菌0.9％氯化钠水溶液冲洗5.5天菌龄的灵芝菌斜面，通过在显微镜下观察血小球计数板读书，将洗下来的孢子液稀释至10⁷孢子/毫升，接下来将孢子悬液以体积比5.0％接入到制备好的灵芝菌液体种子液培养基中，在165转/分钟、28℃的恒温摇床中进行培养3.5天，当瓶中的生长状态为大小均匀的星芒状白色菌球时，即可备用；

(2)北五味子果汁的生物降酸

取新鲜的北五味子果实，除梗，洗净，用8～16层纱布包裹绞汁，果汁用60微米孔径的滤纸或滤膜过滤后，冻干；称取冻干粉1份，加入质量比0.02％的维生素b1，溶解于15倍体积的纯净水中，溶解后在121℃的高压灭菌锅中灭菌20分钟；取出果汁溶液，在超净工作台中放至室温，按照体积比6.5％的接种量接入菌龄为3.5天的灵芝菌液体种子液，在165转/分钟、28℃的恒温摇床中培养11天后，取出，9000转/分钟，离心12.5分钟，取上清液，过60微米孔径的滤纸或滤膜，冻干后即得到降酸后的北五味子果汁粉末。

下边通过含量测定实验来进一步说明本发明。

滴定酸度计算公式：

cnaoh是naoh溶液的浓度，g/l；

vnaoh是滴定所用naoh溶液体积，ml；

vsc是北五味子果汁体积，ml；

k是体积换算系数

天然北五味子果汁生物降酸之后的活性成分含量测定结果

1、多糖的含量测定结果

1)测定方法：比色法绘制葡萄糖标准曲线，见图1；

回归方程：y＝0.05656x-0.02524，r²＝0.9995，线性关系良好。

2)测定仪器：可见光-紫外分光光度计

3)测定结果

表1鲜果汁多糖含量测定结果

表2降酸后果汁多糖含量测定结果

由上述实验数据可知：1g鲜果汁冻干粉中含有多糖47.54mg，1g生物降酸后的果汁冻干粉中含有多糖76.76mg，降酸之后果汁中多糖含量提高了约61.5％。

2、黄酮的含量测定结果

1)测定方法：比色法绘制芦丁标准曲线

回归方程为：y＝0.01203x+0.0592，r²＝0.9997，线性关系良好。

2)测定仪器：可见光-紫外分光光度计

3)测定结果

表3鲜果汁黄酮含量测定结果

表4降酸后果汁黄酮含量测定结果

由上述实验数据可知：1g鲜果汁冻干粉中含有黄酮6.24mg，1g生物降酸后的果汁冻干粉中含黄酮3.08mg，降酸后果汁中黄酮的含量降低了约50.6％。

3、多酚的含量测定结果

1)测定方法：比色法(没食子酸绘制标准曲线)

回归方程为：y＝0.12095x+0.06581，r²＝0.9996，线性关系良好。

2)测定仪器：可见光-紫外分光光度计

3)测定结果

表5鲜果汁多酚含量测定结果

表6降酸后果汁多酚含量测定结果

由上述实验数据可知，1g鲜果汁冻干粉中含有多酚7.59mg，1g生物降酸后的果汁冻干粉中含多酚2.72mg，降酸后果汁中多酚的含量降低了约64.2％。

4)单糖的种类和含量的测定

1)测定方法：高效液相色谱法

2)测定仪器：hplc-dad

3)测定结果，见图4，可知，北五味子鲜果汁经过生物降酸之后，甘露糖的百分含量由2.73％变为4.52％、鼠李糖的百分含量由15.18％变为10.74％、葡萄糖的百分含量由74.53％变为79.13％、半乳糖的百分含量由2.60％变为2.99％、(d-/l+)阿拉伯糖的百分含量由4.2％变为2.15％，其甘露糖、葡萄糖、半乳糖的含量均升高，鼠李糖、阿拉伯糖含量降低。

4)天然北五味子果汁生物降酸之后的感官评价

采用综合评分法对北五味子发酵产物进行感官评价鉴定，综合考虑颜色、气味、澄清度、口感等方面的因素，给出正确评价。满分以100分计，请50名志愿者，男女各半，年龄分布位于20-40岁之间，对10批北五味子生物降酸果汁进行评分，鉴评后给出得分，取其平均值作为最终结果。

表7感官评分细则

表8感官评分结果

50名志愿者评分的平均值结果显示：发酵产品呈浅橙色，有五味子独特的果香和灵芝的味道，溶液较澄清，口感较好。

8.5北五味子果汁生物降酸原理探讨

综合以上实验结果，我们发现，经过生物发酵之后，北五味子果汁中的酸性成分黄酮和多酚含量明显下降，这可能是引起果汁酸度降低的主要原因，同时，果汁中多糖含量明显上升，酮糖和醛糖的比例发生了明显的变化，这可能与北五味子果汁口感的改善有密切的关联。