本发明涉及一种酱油生产领域，具体涉及一种多菌种协同发酵生产酱油的方法。
背景技术：
高盐稀态和低盐固态是两种主要的酱油生产发酵方式。研究发现，高盐稀态发酵酱油在发酵过程中，其酵母菌及乳酸菌等次生菌群较多，因为其发酵周期长，对酱油风味的形成有着积极影响，可使酱油的香味浓郁、感官品质好，但是发酵周期长，会导致高盐稀态酱油的产量偏低，工业生产的规模较小；低盐固态发酵主要以米曲霉为主，与高盐稀态发酵相反，其周期短，但是对酱油风味的形成有积极作用的次生菌群较少，因此所酿造出来的酱油风味及感官品质较差。低盐固态法是目前我国酱油行业普遍采用的酿造工艺，产量占到我国酱油年产量的90%，但是这种方法不能有效地利用其蛋白质原料。
中国专利cn201410206105.2公开了一种多菌种协同发酵生产高盐稀态酱油的方法，该发明在制备种曲时用米曲霉和黑曲霉复合制曲，在酱醪发酵过程中适当添加日本裂殖酵母与戊糖片球菌，具有原料蛋白利用率高、成本低的特点，所生产的酱油酱香浓郁、酯香醇厚、鲜味充足，但该发明生产酱油周期长，为150~180天。专利cn201510653622.9公开了一种中盐稀态酱油的酿造工艺，该发明在原料中首次加入了甘蔗渣、玉米秸秆渣，促进发酵，使发酵程度完全，但其酿造步骤繁杂，对酿造条件要求苛刻。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明公开了一种多菌种协同发酵生产酱油的方法。本发明首先采用米曲霉3.042和黑曲霉混合制曲，然后制曲结束后加入碱性蛋白酶水解成曲，促进多肽的生成，发酵时再通过添加谷氨酰胺酶、乳酸菌、酵母菌混合发酵，增加酱油风味产生的微生物菌种，最后通过磁场作用，促进酱油中的风味物质的生成。本发明结合低盐固态发酵与稀醪发酵，结合磁场的弱磁性影响作用，缩短酱油的发酵时间，增加酱油的风味及品质。
本发明的技术方案如下：
一种多菌种协同发酵生产酱油的方法，包括以下步骤：
（1）将豆粕干蒸10~20min，加入80~90℃的水浸泡豆粕20~30min，再加入小麦浸泡10~15min，然后加入麸皮混匀后开始蒸料，在121℃，0.15mpa条件下蒸煮30min，料熟后倒入曲盘，打散无结块，冷却；
（2）待熟料冷却至37℃~42℃时，接入米曲霉3.042和黑曲霉，接种量分别为0.2%~0.5%、0.1%~0.3%；
（3）接种后搅拌均匀，制曲，使曲盘厚度一致，表面平整，调节室温，控制品温为30℃左右，制曲48h后即获得成曲；
（4）将步骤（3）所得的成曲中加入磷酸氢二钠溶液调节ph为7.2~7.5，然后加入碱性蛋白酶，在37℃下酶解20~60min，获得改良成曲；
（5）将改良成曲装入发酵缸中，加入13~15波美度的盐水，并使酱醅水分在50~53%，盖上封面盐，酱醅品温控制在41~50℃，发酵9天；
（6）往发酵缸中加入19~20波美度的盐水，然后加入采用磁性碳为固定化载体的谷氨酰胺酶、乳酸菌和酵母菌；
（7）往发酵缸中加入酵母菌60min后，在发酵缸周围施加磁场，通过改变电流控制发酵缸中磁场强度；所述磁场为恒定磁场，磁场强度为60~90mt；
（8）恒定磁场每天启动时间为40~120min，发酵30~40天后停止施加磁场，发酵时间隔7~9天通气搅拌一次；
（9）沉酵：在发酵缸中沉酵2~3天；
（10）过滤，将不溶物过滤除去；
（11）灭菌：在80~95℃温度下灭菌15~20min即得酱油。
作为本发明的进一步说明：豆粕、小麦、麸皮加入质量比例为5:(0.6~10):(0.7~1.3)。
作为本发明的进一步说明：碱性蛋白酶的加入质量为成曲质量的1.5%~3.5%。
作为本发明的进一步说明：碱性蛋白酶的酶活力为45000~55000u/g。
作为本发明的进一步说明：步骤（6）中加入19~20波美度的盐水，使酱醅水分含量为56%~59%。
作为本发明的进一步说明：采用磁性碳为固定化载体的谷氨酰胺酶、乳酸菌和酵母菌的制作方法如下：往已经制备好的体积分数为10%的酶悬浮液、菌悬浮液中加入磁性碳，磁性碳加入质量为悬浮液体积的0.5倍，轻轻震荡30~60min，使酶或菌株能完全吸附在磁性碳中，然后过滤，获得磁性碳固体，将其加入30%的海藻酸钠溶液中，使磁性碳完全被海藻酸钠溶液包裹静置30~40min后放入冰箱中进行冷藏过夜，第二天将海藻酸钠溶液进行过滤，滤出的磁性碳固体用灭菌水冲洗2~3次。
作为本发明的进一步说明：谷氨酰胺酶、乳酸菌、酵母菌加入质量分别为酱醅质量的2.5%、(1.5%~5.5%)、9%~12%。
作为本发明的进一步说明：乳酸菌为嗜盐片球菌、酱油片球菌、酱油四联球菌、植质乳杆菌中的一种或几种混合。
作为本发明的进一步说明：酵母菌为蒙奇球拟酵母、埃切球拟酵母、大豆结合酵母、鲁氏酵母中的一种。
本发明的技术原理如下：
淀粉在发酵过程中被酶分解成糖，对酱油滋味的改善、酱油色泽的形成有着重要的作用，小麦和麸皮是酱油酿造较常用的淀粉质原料。小麦中的糖类除主要含有约70%淀粉外，还含有约2～3%的糊精和2～4%的蔗糖、葡萄糖和果糖。小麦含10～14%的蛋白质，其中麸胶蛋白和谷蛋白丰富，麸胶蛋白中的氨基酸以谷氨酸最多，是产生酱油鲜味的主要因素之一。麸皮又称麦皮，含有丰富的多缩戊糖和一定量的蛋白质，其质地疏松，体轻、表面积大，除一般成分外，还含有多种维生素及钙、铁等无机盐。营养成分适于米曲霉的生长和产酶，既有利于制曲，又有利于淋油，能提高酱油的原料利用率和出品率。
作为调味料，以鲜味为最主要，酱油鲜味来源于米曲霉分泌的蛋白酶、肽酶及谷氨酸酶的作用后水解生成氨基酸。而在制曲过程中，米曲霉产蛋白酶含量不多，所产生的蛋白转化为多肽的含量少。通过在制曲后添加蛋白酶可以增加蛋白转化为多肽、氨基酸的含量，使米曲霉在酱油发酵过程中的代谢产物分解增多，发酵时间缩短，且碱性蛋白酶酶解的大豆多肽对酵母菌生长具有一定的促进作用，添加碱性蛋白能间接促进酵母菌生长，缩短后期发酵时间。
酿造酱油原料豆粕及麸皮中含蛋白质，经蛋白酶分解作用，逐步降解成胨、多肽和氨基酸。有些氨基酸是呈味的，就变成酱油的调味成分，如谷氨酸和天冬氨酸具有鲜味。谷氨酸产量的多少和谷氨酰胺酶有关系，谷氨酰胺酶增多，分解得到的谷氨酸增多，酱油鲜味增加。谷氨酰胺酶是胞内酶，需菌体细胞自溶后才能发挥作用，故要充分发挥谷氨酰胺酶的作用，应适当延长发酵时间。通过添加谷氨酰胺酶，则直接增加谷氨酰胺酶的含量，且通过固定化技术，使谷氨酰胺酶在固定化载体中保存着稳定的酶活力，使酶作用得到更加充分及稳定的作用，缩短发酵时间，提高酱油中的鲜味。
酱油酿造中涉及的细菌主要是乳酸菌，适量的乳酸，使酱油口感柔和，是构成酱油风味的重要因素之一。酱油乳酸菌是生长在酱醅这一特定环境中的特殊乳酸菌，在此环境中的乳酸菌是耐盐的，且这些乳酸菌耐乳酸能力不强，因此不会产生过量乳酸菌使酱醅ph过低而造成酸败。
酵母菌在酿造过程中，与酒精发酵作用、酸累发酵作用及酯化作用等有直接或间接的关系，对酱油的香气影响最大。在稀态发酵中，发酵时间长，酵母菌的作用得到充分发挥。需要缩短时间，则需要添加物质促进酵母菌的生长。在发酵前期，采用碱性蛋白酶分解大豆多肽，促进酵母菌快速进入对数期，在发酵中期，则主要通过磁场影响促进酵母菌发酵作用。
目前在酱油酿造中，原料利用率和酱油中有机酸、脂类含量，主要是通过延长发酵时间提高，发酵周期延长，生产的成本提高，效率降低。磁场处理是通过磁场强度控制，影响磁场内物质的生成、分解作用等作用的技术。在强磁场作用下，可对物质进行杀菌，而在适当的弱磁场下，可影响微生物的生长情况，促进微生物的生长，且在磁场处理中，对预处理的磁场通过添加零价铁作为磁化剂，铁的添加，会影响酱油的口感。磁性碳是经过正质子幅射（掺氢）后，使其点阵歪曲，表面可具有和铁，镍等同量级大小的磁化强度，居里温度可达500k，具有这种表面磁性的碳，其表面的磁性可以吸附微生物，作为固定化技术的载体，其具有很好的吸附能力，配合海藻酸钠的包埋作用，将微生物或酶进行固定化处理。同时在磁场的作用下，通过磁场磁性强度影响包埋在磁性碳中的微生物、酶的生长，促进微生物代谢产物和发酵作用的进程，从而缩短了发酵的时间，增加了酱油风味物质的产生。同时，磁场处理通过对酱油磁化处理，将不良风味物质（主要含有金属的物质）吸附或聚集在固定化微生物周围，过滤时将其过滤除去，减少不良风味物质的含量。
本发明的有益效果：
（1）在制曲、发酵过程中分别通过添加碱性蛋白酶和谷氨酰胺酶，促进菌株蛋白水解，促进酱油鲜味和风味的增加。
（2）首次在酱油发酵过程中增加磁场，通过磁场影响酱油的风味物质的生成。
（3）通过多菌种和磁场的协同作用，缩短了酱油的生产时间。
具体实施方式
实施例1：
（1）固定化谷氨酰胺酶、嗜盐片球菌和鲁氏酵母：往已经制备好的体积分数为10%的酶悬浮液、菌悬浮液中加入磁性碳，磁性碳加入质量为悬浮液体积的0.5倍，轻轻震荡30min，使酶或菌株能完全吸附在磁性碳中，然后过滤，获得磁性碳固体，将其加入30%的海藻酸钠溶液中，使磁性碳完全被海藻酸钠溶液包裹静置35min后放入冰箱中进行冷藏过夜，第二天将海藻酸钠溶液进行过滤，滤出的磁性碳固体用灭菌水冲洗2~3次；
（2）按重量份计，称取豆粕500份，小麦60份，麸皮100份，将豆粕干蒸20min，加入80~90℃的水浸泡豆粕25min，再加入小麦浸泡10min，然后加入麸皮混匀后开始蒸料，在121℃，0.15mpa条件下蒸煮30min，料熟后倒入曲盘，打散无结块，冷却；
（3）待熟料冷却至37℃~42℃时，接入米曲霉3.042和黑曲霉，接种量分别为0.5%、0.2%；
（4）接种后搅拌均匀，制曲，使曲盘厚度一致，表面平整，调节室温，控制品温为30℃左右，制曲48h后即获得成曲；
（5）将步骤（3）所得的成曲中加入磷酸氢二钠溶液调节ph为7.2~7.5，然后加入酶活力为45000~55000u/g的碱性蛋白酶，加入质量为成曲质量的3.0%，在37℃下酶解40min，获得改良成曲；
（6）将改良成曲装入发酵缸中，加入13~15波美度的盐水，使酱醅水分在50~53%，盖上封面盐，酱醅品温控制在41~50℃，发酵9天；
（7）往发酵缸中加入19~20波美度的盐水，使酱醅水分含量为56%~59%，然后加入采用磁性碳为固定化载体的谷氨酰胺酶、嗜盐片球菌和鲁氏酵母，加入质量分别为酱醅质量的2.5%、4.0%、9%；
（8）往发酵缸中加入鲁氏酵母60min后，在发酵缸周围施加磁场，通过改变电流控制发酵缸中磁场强度；所述磁场为恒定磁场，磁场强度为70mt；
（9）恒定磁场每天启动时间为120min，发酵30天后停止施加磁场，发酵时间隔6天通气搅拌一次；
（10）沉酵：在发酵缸中沉酵2天；
（11）过滤，将不溶物过滤除去；
（12）灭菌：在80~95℃温度下灭菌15min即得酱油。
实施例2：
（1）固定化谷氨酰胺酶、酱油片球菌和大豆结合酵母：往已经制备好的体积分数为10%的酶悬浮液、菌悬浮液中加入磁性碳，磁性碳加入质量为悬浮液体积的0.5倍，轻轻震荡40min，使酶或菌株能完全吸附在磁性碳中，然后过滤，获得磁性碳固体，将其加入30%的海藻酸钠溶液中，使磁性碳完全被海藻酸钠溶液包裹静置30min后放入冰箱中进行冷藏过夜，第二天将海藻酸钠溶液进行过滤，滤出的磁性碳固体用灭菌水冲洗2~3次；
（2）按重量份计，称取豆粕500份，小麦90份，麸皮70份，将豆粕干蒸15min，加入80~90℃的水浸泡豆粕30min，再加入小麦浸泡15min，然后加入麸皮混匀后开始蒸料，在121℃，0.15mpa条件下蒸煮30min，料熟后倒入曲盘，打散无结块，冷却；
（3）待熟料冷却至37℃~42℃时，接入米曲霉3.042和黑曲霉，接种量分别为0.3%、0.15%；
（4）接种后搅拌均匀，制曲，使曲盘厚度一致，表面平整，调节室温，控制品温为30℃左右，制曲48h后即获得成曲；
（5）将步骤（3）所得的成曲中加入磷酸氢二钠溶液调节ph为7.2~7.5，然后加入酶活力为45000~55000u/g的碱性蛋白酶，加入质量为成曲质量的1.5%，在37℃下酶解20min，获得改良成曲；
（6）将改良成曲装入发酵缸中，加入13~15波美度的盐水，使酱醅水分在50~53%，盖上封面盐，酱醅品温控制在41~50℃，发酵9天；
（7）往发酵缸中加入19~20波美度的盐水，使酱醅水分含量为56%~59%，然后加入采用磁性碳为固定化载体的谷氨酰胺酶、酱油片球菌和大豆结合酵母，加入质量分别为酱醅质量的2.5%、1.5%、10%；
（8）往发酵缸中加入大豆结合酵母60min后，在发酵缸周围施加磁场，通过改变电流控制发酵缸中磁场强度；所述磁场为恒定磁场，磁场强度为90mt；
（9）恒定磁场每天启动时间为60min，发酵40天后停止施加磁场，发酵时间隔8天通气搅拌一次；
（10）沉酵：在发酵缸中沉酵3天；
（11）过滤，将不溶物过滤除去；
（12）灭菌：在80~95℃温度下灭菌20min即得酱油。
实施例3：
（1）固定化谷氨酰胺酶、酱油四联球菌和埃切球拟酵母：往已经制备好的体积分数为10%的酶悬浮液、菌悬浮液中加入磁性碳，磁性碳加入质量为悬浮液体积的0.5倍，轻轻震荡60min，使酶或菌株能完全吸附在磁性碳中，然后过滤，获得磁性碳固体，将其加入30%的海藻酸钠溶液中，使磁性碳完全被海藻酸钠溶液包裹静置40min后放入冰箱中进行冷藏过夜，第二天将海藻酸钠溶液进行过滤，滤出的磁性碳固体用灭菌水冲洗2~3次；
（2）按重量份计，称取豆粕500份，小麦70份，麸皮110份，将豆粕干蒸10min，加入80~90℃的水浸泡豆粕25min，再加入小麦浸泡10min，然后加入麸皮混匀后开始蒸料，在121℃，0.15mpa条件下蒸煮30min，料熟后倒入曲盘，打散无结块，冷却；
（3）待熟料冷却至37℃~42℃时，接入米曲霉3.042和黑曲霉，接种量分别为0.4%、0.3%；
（4）接种后搅拌均匀，制曲，使曲盘厚度一致，表面平整，调节室温，控制品温为30℃左右，制曲48h后即获得成曲；
（5）将步骤（3）所得的成曲中加入磷酸氢二钠溶液调节ph为7.2~7.5，然后加入酶活力为45000~55000u/g的碱性蛋白酶，加入质量为成曲质量的2.0%，在37℃下酶解60min，获得改良成曲；
（6）将改良成曲装入发酵缸中，加入13~15波美度的盐水，使酱醅水分在50~53%，盖上封面盐，酱醅品温控制在41~50℃，发酵9天；
（7）往发酵缸中加入19~20波美度的盐水，使酱醅水分含量为56%~59%，然后加入采用磁性碳为固定化载体的谷氨酰胺酶、酱油四联球菌和埃切球拟酵母，加入质量分别为酱醅质量的2.5%、3.5%、11%；
（8）往发酵缸中加入埃切球拟酵母60min后，在发酵缸周围施加磁场，通过改变电流控制发酵缸中磁场强度；所述磁场为恒定磁场，磁场强度为80mt；
（9）恒定磁场每天启动时间为100min，发酵35天后停止施加磁场，发酵时间隔7天通气搅拌一次；
（10）沉酵：在发酵缸中沉酵2天；
（11）过滤，将不溶物过滤除去；
（12）灭菌：在80~95℃温度下灭菌15min即得酱油。
实施例4：
（1）固定化谷氨酰胺酶、植质乳杆菌和蒙奇球拟酵母：往已经制备好的体积分数为10%的酶悬浮液、菌悬浮液中加入磁性碳，磁性碳加入质量为悬浮液体积的0.5倍，轻轻震荡50min，使酶或菌株能完全吸附在磁性碳中，然后过滤，获得磁性碳固体，将其加入30%的海藻酸钠溶液中，使磁性碳完全被海藻酸钠溶液包裹静置40min后放入冰箱中进行冷藏过夜，第二天将海藻酸钠溶液进行过滤，滤出的磁性碳固体用灭菌水冲洗2~3次；
（2）按重量份计，称取豆粕500份，小麦100份，麸皮90份，将豆粕干蒸20min，加入80~90℃的水浸泡豆粕30min，再加入小麦浸泡15min，然后加入麸皮混匀后开始蒸料，在121℃，0.15mpa条件下蒸煮30min，料熟后倒入曲盘，打散无结块，冷却；
（3）待熟料冷却至37℃~42℃时，接入米曲霉3.042和黑曲霉，接种量分别为0.2%、0.25%；
（4）接种后搅拌均匀，制曲，使曲盘厚度一致，表面平整，调节室温，控制品温为30℃左右，制曲48h后即获得成曲；
（5）将步骤（3）所得的成曲中加入磷酸氢二钠溶液调节ph为7.2~7.5，然后加入酶活力为45000~55000u/g的碱性蛋白酶，加入质量为成曲质量的3.5%，在37℃下酶解30min，获得改良成曲；
（6）将改良成曲装入发酵缸中，加入13~15波美度的盐水，使酱醅水分在50~53%，盖上封面盐，酱醅品温控制在41~50℃，发酵9天；
（7）往发酵缸中加入19~20波美度的盐水，使酱醅水分含量为56%~59%，然后加入采用磁性碳为固定化载体的谷氨酰胺酶、植质乳杆菌和蒙奇球拟酵母，加入质量分别为酱醅质量的2.5%、5.5%、10.5%；
（8）往发酵缸中加入蒙奇球拟酵母60min后，在发酵缸周围施加磁场，通过改变电流控制发酵缸中磁场强度；所述磁场为恒定磁场，磁场强度为85mt；
（9）恒定磁场每天启动时间为40min，发酵40天后停止施加磁场，发酵时间隔9天通气搅拌一次；
（10）沉酵：在发酵缸中沉酵3天；
（11）过滤，将不溶物过滤除去；
（12）灭菌：在80~95℃温度下灭菌20min即得酱油。
实施例5：
（1）固定化谷氨酰胺酶、酱油片球菌、植质乳杆菌和鲁氏酵母：往已经制备好的体积分数为10%的酶悬浮液、菌悬浮液中加入磁性碳，磁性碳加入质量为悬浮液体积的0.5倍，轻轻震荡55min，使酶或菌株能完全吸附在磁性碳中，然后过滤，获得磁性碳固体，将其加入30%的海藻酸钠溶液中，使磁性碳完全被海藻酸钠溶液包裹静置35min后放入冰箱中进行冷藏过夜，第二天将海藻酸钠溶液进行过滤，滤出的磁性碳固体用灭菌水冲洗2~3次；
（2）按重量份计，称取豆粕500份，小麦80份，麸皮130份，将豆粕干蒸10min，加入80~90℃的水浸泡豆粕20min，再加入小麦浸泡10min，然后加入麸皮混匀后开始蒸料，在121℃，0.15mpa条件下蒸煮30min，料熟后倒入曲盘，打散无结块，冷却；
（3）待熟料冷却至37℃~42℃时，接入米曲霉3.042和黑曲霉，接种量分别为0.45%、0.1%；
（4）接种后搅拌均匀，制曲，使曲盘厚度一致，表面平整，调节室温，控制品温为30℃左右，制曲48h后即获得成曲；
（5）将步骤（3）所得的成曲中加入磷酸氢二钠溶液调节ph为7.2~7.5，然后加入酶活力为45000~55000u/g的碱性蛋白酶，加入质量为成曲质量的2.5%，在37℃下酶解50min，获得改良成曲；
（6）将改良成曲装入发酵缸中，加入13~15波美度的盐水，使酱醅水分在50~53%，盖上封面盐，酱醅品温控制在41~50℃，发酵9天；
（7）往发酵缸中加入19~20波美度的盐水，使酱醅水分含量为56%~59%，然后加入采用磁性碳为固定化载体的谷氨酰胺酶、酱油片球菌、植质乳杆菌和鲁氏酵母，加入质量分别为酱醅质量的2.5%、1.5%、2.5%、12%；
（8）往发酵缸中加入鲁氏酵母60min后，在发酵缸周围施加磁场，通过改变电流控制发酵缸中磁场强度；所述磁场为恒定磁场，磁场强度为60mt；
（9）恒定磁场每天启动时间为90min，发酵40天后停止施加磁场，发酵时间隔8天通气搅拌一次；
（10）沉酵：在发酵缸中沉酵2天；
（11）过滤，将不溶物过滤除去；
（12）灭菌：在80~95℃温度下灭菌20min即得酱油。