一种食源性牛蹄筋ACE抑制肽、果蔬咀嚼片及其制备方法与流程

本发明属于食品加工技术领域，尤其涉及一种食源性牛蹄筋ace抑制肽、果蔬咀嚼片及其制备方法。

背景技术：

我国是果蔬生产大国，年产量在国际上也处于领先地位，但在国内果蔬却主要以鲜食为主，加工量不足10％，远低于发达国家70％的加工量水平，同时还存在严重的腐烂变质等问题。果蔬咀嚼片是近年来新出现的休闲保健食品，是果蔬加工的新形式，用新鲜果蔬加工成方便储运和消费的咀嚼片，不仅可有效避免果蔬腐烂的问题，同时可较好保留果蔬中的营养成分，提高产品附加值。

茄子、刺梨、沙棘均是产量较大且常见的果蔬。其中茄子的营养较丰富，含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素以及钙、磷、铁、钾等多种营养成分，特别是维生素p(药名为“卢丁”)的含量很高，每100克中含维生素p750毫克，这是许多蔬菜水果望尘莫及的。维生素p能使血管壁保持弹性和生理功能，防止硬化和破裂，所以经常吃些茄子，有助于防治高血压、冠心病、动脉硬化和出血性紫癜，维生素p在紫茄中维生素p的含量高达0.72％，在果蔬中含量最高；刺梨鲜食味酸甜，富含糖、有机酸和多种维生素，维生素p含量同样极高，每100g果肉中含维生素p5980mg-12895mg，比柑橘高120倍，比蔬菜类高150倍；它还富含维生素b1、b2、e、k1等16种微量元素，其功能比酸枣高46倍；由于维生素p有抗维生素c氧化作用，所以刺梨中的维生素c是相当稳定；沙棘所含的黄酮类化合物在果实成熟时含量可达到25毫克/100克，它们主要是甙，具有维生素p的活性，并且是抗坏血酸的氧化抑制剂。新库兹涅克的沙棘内维生素p的含量竞高达2450～2690毫克，沙棘维生素p是儿茶素、白花青素、花青素、黄酮、黄酮醇、查尔酮(芳烯丙酰芳烃)、脱氧查尔酮、芳香苷和酚酸等对人体有益的物质。

牛在屠宰过程中产生了大量的副产物，例如，脏器、血液、骨骼、毛皮、头蹄等副产物，目前，这些副产物的利用率极低，而且，采用蹄筋等副产物开发功能性食品的研究鲜有报道。蹄筋是牦牛的副产物之一，蹄筋中含有丰富的蛋白聚糖和胶原蛋白，脂肪含量也比肥肉低，从蹄筋中提取的ace抑制肽(血管紧张素转化酶抑制剂)具有降压作用，还可改善血管内皮功能和心功能，减少心律失常的发生。虽然相关文献中都公开过ace抑制肽的提取方法，但是这些方法提取时间过长，过程非常复杂，所提取到的ace抑制肽都是非食源性的，食源性ace抑制肽与化学合成的降压药物相比，有极高的安全性。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供一种食源性牛蹄筋ace抑制肽及其制备方法，旨在克服现有ace抑制肽的提取时间较长、过程非常复杂，并且现有方法提取到的ace抑制肽是非食源性的，不能达到安全食用要求的问题。

本发明的目的在于提供一种以上述食源性牛蹄筋ace抑制肽为组分的果蔬咀嚼片及其制备方法，旨在获得香甜适口、营养丰富、具有降血压、预防心血管疾病等功效的前提下，通过配方优化克服咀嚼片无法成型等问题。

本发明是这样实现的，一种食源性牛蹄筋ace抑制肽的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将处理干净的块状牛蹄筋置于0.5mol/l的醋酸溶液中，料液比为1:40(w/v)，在20℃条件下，向溶液中添加胃蛋白酶(3500u)，所加酶量与牛蹄筋原料质量比为1：100，室温下于磁力搅拌器上搅拌提取48h将提取后获得溶液用双层医用脱脂纱布过滤；

(2)滤液混匀后在15000r/min转速下低温离心30min后取上清液，往上清液中加入nacl，得到nacl浓度为5％(w/v)的总溶液，静置1d后在10000r/min转速下离心20min取沉淀；加蒸馏水，离心去盐分；将去盐分后的沉淀物在-50℃真空冷冻干燥得到胶原蛋白；

(3)将上述胶原蛋白悬浮加入到ph＝8.0的磷酸盐缓冲液中，胶原蛋白、缓冲液的质量体积比为1:100(w:v)，4℃过夜；在碱性蛋白酶的最佳温度下预孵育10min后，往缓冲液中加入碱性蛋白酶，酶与底物的重量比例为1:100(w/w)，水解60min后加热灭酶、冷却、离心处理后得到上清液，将上清液通过0.45μm孔径的醋酸纤维滤波器过滤得到胶原蛋白水解产物，将水解产物预冻、真空冷冻干燥，得到食源性牛蹄筋ace抑制肽的冻干粉。

优选地，在步骤(1)中，所述牛蹄筋的处理过程为：去除牛蹄肌腱组织周围肌肉、脂肪、筋膜、血管等组织，用0.9％的生理盐水冲洗肌腱2次，用蒸馏水洗净，将肌腱组织取出后，用刀片仔细刮除残余脂肪及筋膜，用蒸馏水冲洗2次，最后用刀片将肌腱切成体积为1mm×1mm×1mm的小块，于-20℃保存待用。

优选地，在步骤(2)中，所述离心去盐分具体为：往沉淀物中加入沉淀体积5～10倍体积的蒸馏水，缓慢摇匀，在4000r/min转速下离心10min，弃上清，重复此步骤3次以洗去残余的盐分。

优选地，在步骤(3)中，所述加热灭酶、冷却、离心处理具体为：将水解物立即加热到90℃灭酶15min、在冰浴条件下冷却20min后，在11000g转速下离心5min。

本发明进一步公开了一种果蔬咀嚼片的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将主料和辅料混合均匀后过20目筛，得到软材；所述主料包括沙棘粉5～15质量份、茄子粉10～20质量份、刺梨粉20～30质量份、上述食源性牛蹄筋ace抑制肽1质量份；所述辅料包括甜味剂25质量份、可溶性淀粉15质量份；

(2)将上述软材依次与填充剂10质量份、粘合剂1.5质量份混匀，用体积分数为90％的乙醇通过湿法造粒得到软材颗粒，将软材颗粒干燥过筛，得到目数为20～40目的整粒；

(3)将上述整粒与润滑剂1质量份在zp17a旋转式压片机混匀压片、灭菌后，得到果蔬降压咀嚼片。

优选地，在步骤(1)中，所述甜味剂为20质量份麦芽糊精、5质量份木糖醇；在步骤(2)中，所述粘合剂为黄原胶；所述填充剂为微晶纤维素；在步骤(3)中，所述润滑剂为硬脂酸镁。

优选地，在步骤(1)中，所述沙棘粉添加量为10质量份，茄子粉添加量为19质量份，刺梨粉添加量为25质量份；在步骤(2)中，所述黄原胶添加量为1.5质量份。

优选地，在步骤(1)中，所述茄子粉的制备具体为：挑选新鲜、色泽深、无机械损伤的茄子，水洗干净，取中段切厚度2～4mm薄片，在沸水中烫漂30s后立即取出，用0.1％vc溶液护色，之后真空冷冻干燥，再超微粉碎，过20目筛。

优选地，在步骤(2)中，所述干燥温度为45℃下鼓风烘干至颗粒中水分含量为3％左右。

优选地，在步骤(3)中，所述灭菌具体为：将压好的咀嚼片在紫外灯下照射1h、每20min翻动一次。

本发明克服现有技术的不足，提供一种食源性牛蹄筋ace抑制肽、果蔬咀嚼片及其制备方法，通过对处理干净的块状牛蹄筋经过醋酸溶液浸泡、胃蛋白酶初步酶解、过滤，将该滤液离心所得上清液加盐、离心，沉淀物去盐、真空冷冻干燥得到胶原蛋白，再对胶原蛋白通过碱性蛋白酶二次酶解、离心所得上清液通过0.45μm孔径的醋酸纤维滤波器过滤，过滤产物经过真空冷冻干燥得到食源性牛蹄筋ace抑制肽；再以茄子粉、刺梨粉、沙棘粉、食源性牛蹄筋ace抑制肽为原料，通过湿法造粒，压片制成咀嚼片，运用响应面试验进行配方优化，确定该类果蔬咀嚼片的最优配方，最终得到香甜适口、营养丰富、具有降血压及预防心血管疾病等保健功能的果蔬咀嚼片。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明食源性牛蹄筋ace抑制肽的制备方法更为简化，并且符合食用的安全要求。ace抑制肽具有降压作用，还可改善血管内皮功能和心功能，对高血压等心血管疾病具有预防作用；

(2)本发明果蔬咀嚼片形状完整、表面光滑平整，入口顺滑、硬度适宜、咀嚼性良好、香甜适口，感官品质优良；

(3)本发明果蔬咀嚼片营养丰富，具有降血压、预防心血管疾病等功效；经甘肃省疾控中心检测，果蔬咀嚼片中钾元素含量为4900mg/kg，钾元素具有帮助心脏维持规律的心跳，并控制血压的稳定，可预防心血管疾病；果蔬咀嚼片中vp含量为0.75％，其含量远远高于单一的水果蔬菜，是一种很好的降血压食品；此外，果蔬咀嚼片中食源性牛蹄筋ace抑制肽同样对高血压等心血管疾病具有很好的预防作用；

(4)本发明果蔬咀嚼片的原料既有果蔬原料、林产原料，也有畜产品原料，扩大了各种原料的利用途径，提高了原料附加值。

附图说明

图1是沙棘粉添加量对咀嚼片感官评价的影响；

图2是茄子粉添加量对咀嚼片感官评价的影响；

图3是刺梨粉添加量对咀嚼片感官评价的影响；

图4是黄原胶添加量对咀嚼片感官评价的影响；

图5是vp含量的标准曲线；

图6是各个因素相互之间的响应曲面图；其中，图6(a)是黄原胶、沙棘添加量之间的相互影响；图6(b)是茄子、沙棘添加量之间的相互影响；图6(c)是刺梨、沙棘添加量之间的相互影响；图6(d)是茄子、黄原胶添加量之间的相互影响；图6(e)是刺梨、黄原胶添加量之间的相互影响；图6(f)是刺梨、茄子添加量之间的相互影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在本发明实施例中涉及到的仪器与设备包括：鼓风干燥箱；真空干燥箱；真空冷冻干燥机；超微粉碎机；压片机；分光光度计；20目、40目整粒筛。

实施例1

(1)去除牛蹄肌腱组织周围肌肉、脂肪、筋膜、血管等组织，用0.9％生理盐水冲洗肌腱2次，用蒸馏水洗净，将肌腱组织取出后，用刀片仔细刮除残余脂肪及筋膜，用蒸馏水冲洗2次，最后用刀片将肌腱切成体积为1mm×1mm×1mm的小块，于-20℃保存待用。

(2)将牛蹄筋置于0.5mol/l的醋酸溶液中，料液比为1:40，在20℃条件下，向溶液中添加胃蛋白酶(3500u)，所加酶量与牛蹄筋原料质量比为1：100，室温下于磁力搅拌器上搅拌提取48h将提取后获得溶液用双层医用脱脂纱布过滤以除去未溶解的牛蹄筋残渣，滤液混匀后按以下步骤操作：

①低温离心30min(转速15000r/min)，取上清液；

②按上清液体积向上清液中加入nacl，使最终总溶液中nacl浓度为5％(w/v)，溶液静置1d后，离心20min(转速10000r/min)取沉淀；

③加入沉淀体积5～10倍体积的蒸馏水，缓慢摇匀(切勿产生气泡)，离心10min(转速4000r/min)，弃上清，重复此步骤3次以洗去残余的盐分；

④获得沉淀收集在一起，-50℃真空冻干，所得即为胶原蛋白；

(3)将获得的胶原蛋白悬浮在ph＝8.0的磷酸盐缓冲液中，并保持在4℃过夜水解；然后在碱性蛋白酶的最佳温度下预孵育10分钟，加入碱性蛋白酶，酶与底物的重量比为1:100(w/w)，再分装在若干个5毫升的离心管中，每个离心管分别水解60分钟后取出，并立即加热到90℃，灭酶15分钟，并在冰浴条件冷却20分钟后，离心(11000g,5分钟)，上清液通过醋酸纤维滤波器过滤(0.45微米的孔径)，然后在-20℃冻结所获得的即为胶原蛋白水解产物—食源性牛蹄筋ace抑制肽。

实施例2

(1)将主料和辅料混合均匀后过20目筛，得到软材；所述主料包括沙棘粉、茄子粉、刺梨粉、上述食源性牛蹄筋ace抑制肽1质量份；所述辅料包括甜味剂25质量份、可溶性淀粉15质量份；

在步骤(1)中，所述茄子粉的制备具体为：挑选新鲜、色泽深、无机械损伤的茄子，水洗干净，取中段切厚度2～4mm薄片，在沸水中烫漂30s后立即取出，用0.1％vc溶液护色，之后真空冷冻干燥，再超微粉碎，过20目筛。

(2)将上述软材依次与填充剂10质量份、1.5质量份粘合剂混匀，用体积分数为90％的乙醇通过湿法造粒得到软材颗粒，将软材颗粒干燥过筛，得到目数为20～40目的整粒；

在步骤(2)中，所述干燥温度为45℃下鼓风烘干至颗粒中水分含量为3％左右。

(3)将上述整粒与润滑剂1质量份在zp17a旋转式压片机混匀压片、灭菌后，得到果蔬降压咀嚼片，真空包装；

在步骤(3)中，所述灭菌具体为：将压好的咀嚼片在紫外灯下照射1h、每20min翻动一次。

上述实施例中，在步骤(1)中，所述甜味剂为20质量份麦芽糊精、5质量份木糖醇；在步骤(2)中，所述粘合剂为黄原胶；所述填充剂为微晶纤维素；在步骤(3)中，所述润滑剂为硬脂酸镁。本发明提供的是一种实施方式，但是在实际生产中，在等效替换的原则下，可不限定于这些具体物质。

在本发明果蔬降压咀嚼片的制备过程中，由于组分材质本身的限制，咀嚼片难以成型，并且，果蔬咀嚼片的感官品质优良需要进行优化，在本发明实施例中，对上述组分的优化更具体在实施例3中进行描述。

实施例3

1、单因素试验设计

1.1、不同沙棘粉添加量对咀嚼片的影响

按工艺流程及操作要点研制果蔬降压咀嚼片，将黄原胶2质量份、茄子粉10质量份、刺梨粉20质量份的果蔬粉、麦芽糊精20质量份、可溶性淀粉15质量份、微晶纤维素10质量份、木糖醇5质量份、硬脂酸镁1质量份、ace抑制肽1质量份等用量固定，研究不同沙棘粉添加量(5质量份、10质量份、15质量份、20质量份、25质量份)对咀嚼片的影响。

1.2、不同茄子粉添加量对咀嚼片的影响

按工艺流程及操作要点研制果蔬降压咀嚼片，将沙棘粉10质量份、黄原胶2质量份、刺梨粉20质量份的果蔬粉、麦芽糊精20质量份、可溶性淀粉15质量份、微晶纤维素10质量份、木糖醇5质量份、硬脂酸镁1质量份、ace抑制肽1质量份等用量固定，研究不同茄子添加量(10质量份、15质量份、20质量份、25质量份、30质量份)对咀嚼片的影响。

1.3、不同刺梨粉添加量对咀嚼片的影响

按工艺流程及操作要点研制果蔬降压咀嚼片，将沙棘粉10质量份、黄原胶2质量份、茄子粉15质量份的果蔬粉、麦芽糊精20质量份、可溶性淀粉15质量份、微晶纤维素10质量份、木糖醇5质量份、硬脂酸镁1质量份、ace抑制肽1质量份等用量固定，研究不同刺梨添加量(10质量份、15质量份、20质量份、25质量份、30质量份)对咀嚼片的影响。

1.4、不同黄原胶添加量对咀嚼片的影响

按工艺流程及操作要点研制果蔬降压咀嚼片，将沙棘粉10质量份、茄子粉15质量份、刺梨粉25质量份的果蔬粉、麦芽糊精20质量份、可溶性淀粉15质量份、微晶纤维素10质量份、木糖醇5质量份、硬脂酸镁1质量份、ace抑制肽1质量份等用量固定，研究不同黄原胶添加量(0.5质量份、1质量份、1.5质量份、2.0质量份)对咀嚼片的影响。

1.5、响应面试验设计与优化

在单因素试验的基础上，选取沙棘粉、黄原胶、茄子、刺梨粉添加量为试验因子，产品的感官评分为响应值，采用designexpert8.0.6软件设计4因素的中心组合试验，考察试验因子间交互作用，优化果蔬降压咀嚼片的配方，详见如下表1所示：

表1响应面试验设计

1.6、测定指标及方法

1.6.1、片重差异的测定

取样品20片，精密称量，计算平均片重，同时，每片重量与平均片重相比较，超出重量差异限度的不得多于2片，并不得有1片超出限度1倍，其中重量在平均片重以下的样品重量差异限度为±7.5％，平均片重以上的样品重量差异限度为±5.0％。

1.6.2、崩解时限

崩解时限的测定：取样品6片，分别置于洁净的吊篮玻璃管中，每管各放1片，将装有供试品的吊篮玻璃管浸入温度已达到37±1℃的水中，直至样品完全分散，记录每片崩解的时间，取平均值。

1.6.3、果蔬降压咀嚼片感官评价方法

选择10位健康、味觉正常人为受试者试吃并对外观、口味进行综合评分(100分制)，评分标准见表下2所示：

表2感官评分表

1.6.4、理化指标测定

水分含量的测定：参考gb5009.3-2016《食品中水分的测定》；

蛋白质含量的测定：参考gb5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》；

脂肪含量的测定：参考gb5009.6-2016《食品中脂肪的测定》；

灰分含量的测定：参考gb5009.4-2016《食品中灰分的测定》

1.6.5、微生物的测定

参考《gb4789.2-2016食品微生物学检验菌落总数测定》

1.6.6、vp含量的测定

(1)标曲的制作

本实验以芦丁作为咀嚼片vp含量的标准品。准确称取在120℃干燥至恒重的芦丁标准品10mg，用70％的乙醇溶解并定容至100ml，使其浓度为100μg/ml。将芦丁溶液用70％的乙醇稀释成0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/ml，各取1ml于试管中，加70％的乙醇1ml，加入0.3ml5％的nano3，混匀后放置6min，然后加入0.3ml10％的al(no3)3溶液，摇匀后放置6min。最后再加入2ml4％naoh，摇匀，放置10min。在510nm处测定不同浓度的标准品的吸光值。

根据标准曲线的制作方法，以浓度c(mg/ml)为纵坐标，吸光值a(510nm)为横坐标，进行线性回归方程。

(2)样品的测定

采用乙醇提取法，将样品65℃烘干，粉碎后过60目筛，备用，同一份材料3次重复，分别精密称取各干品1g于烧瓶中，加入70％的乙醇30ml，置于65℃的水浴锅中浸泡提取1.5h，将提取液用70％的乙醇定容至50ml。准确吸取1ml于容量瓶中，用70％的乙醇稀释至刻度。按标准曲线的制作方法，各取1ml于试管中，加70％的乙醇1ml、5％的nano33ml，混合后放置6min，再加入10％的al(no3)30.3ml，摇匀后放置6min，最后再加入4％的naoh2ml，摇匀后放置10min。在510nm处测定不同浓度样品的吸光值，计算vp含量。

2、结果与分析

2.1、单因素试验结果分析

2.1.1、不同沙棘粉添加量对咀嚼片的影响

沙棘添加量对果蔬咀嚼片的感官评价影响见图1。由图1可知，不同沙棘添加量对果蔬咀嚼片的影响不同，随添加量的增加，咀嚼片感官评价得分逐渐降低，当沙棘添加量的为10质量份时，感官评价得分最高，因此可知当沙棘添加量为10质量份时最优。

2.1.2、不同茄子添加量对咀嚼片的影响

茄子添加量对果蔬咀嚼片的感官评价影响见图2。由图2可知，随着茄子添加量的逐渐增加，咀嚼片的感官评分值先升高后降低，当茄子添加量为15质量份时，咀嚼片的感官评分值最高，综合感官评价可知当茄子添加量为15质量份时最优。

2.1.3、不同刺梨粉添加量对咀嚼片的影响.

刺梨添加量对果蔬咀嚼片的感官评价影响见图3。由图3可知，随着刺梨添加量的逐渐增加，果蔬咀嚼片的感官评值先增加后减少，当刺梨添加量为25质量份时，咀嚼片的感官品质最好。由此可知，当刺梨添加量为25质量份时最优。

2.1.4、不同黄原胶添加量对咀嚼片的影响

黄原胶添加量对果蔬咀嚼片的感官评价影响见图4。由图4可知，当黄原胶添加量为1.5质量份时，果蔬咀嚼片的感官评分值最高，随着黄原胶添加量的逐渐增加，咀嚼片的感官评分值呈先逐渐增高后逐渐减小的趋势，因此,当黄原胶添加量为1.5质量份时最优。

2.1.5、vp含量的测定

2.1.5.1、标准曲线的绘制

本发明以芦丁作为咀嚼片总芦丁含量的标准品。以浓度c(mg/ml)为纵坐标，吸光值a为横坐标，进行线性回归，得到回归方程：y＝0.0231x-0.0015，相关系数r²＝0.9913。标准曲线如图5所示。

2.1.5.2、样品的测定

根据前面提到的方法，测得吸光值a为0.002，按照芦丁标准曲线y＝0.0231x-0.0015，计算得到vp含量为0.75％。

2.1.6、理化指标结果如下表3所示：

表3理化指标

2.1.7、微生物指标

细菌总数≤500cfu/g，大肠菌群≤30mpn/100g，致病菌未检出。

2.2、响应面优化

根据以上单因素水平实验可知，沙棘粉最佳添加量为10质量份，黄原胶最佳添加量为1.5质量份，茄子粉最佳添加量为15质量份，刺梨粉添加量为25质量份在单因素实验的基础上选择沙棘添加量、黄原胶添加量、茄子添加量、刺梨添加量四个因素，根据响应面实验设计，试验结果如下表4所示，进行感官评价，来确定最佳方案。

表4响应面实验结果

根据表4的实验结果，运用designexpert软件进行多元二次回归拟合，得到了感官评定最佳得分(r1)对自变量a、b、c和d的四元二次多项回归方程：y＝-35.70681+2.55603×a+46.76996×b+3.56419×c+4.01570d-0.035030×a×b-5.19605e-003×a×c-0.010196×a×d+0.32686×b×c+0.82686×b×d-2.10165e-003×c×d-0.12142×a²-24.19502×b²-0.11238×c²-0.10238×d²。

各个因素相互之间的响应曲面图，如图6所示。根据响应面分析得到果蔬降压咀嚼片的最优工艺参数为：沙棘粉添加量为10.35质量份，黄原胶添加量为1.49质量份，茄子粉添加量为18.51质量份，刺梨粉添加量为25.49质量份，为便于实际操作，调整试验参数为：沙棘粉添加量为10质量份，黄原胶添加量为1.5质量份，茄子粉添加量为19质量份，刺梨粉添加量为25质量份。

3、结果与讨论

沙棘粉添加量为10质量份，黄原胶添加量为1.5质量份，茄子粉添加量为19质量份，刺梨粉添加量为25质量份，在此配比方案下果蔬降压咀嚼片感官评分值为92.2253分。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化配比方案制作咀嚼片，得到决定系数r²＝0.9528，r²adj＝0.9088，说明该模型与实际试验过程拟合程度高。为考察最佳工艺的准确性，做验证试验，测定三次，感官评分为92分，与模型预测值相差0.2253，测定结果稳定，偏差不大，说明结果可靠。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。