本发明公开了一种热耦合多频超声应用于黄豆酱杀菌的工艺，属于半固体食品杀菌技术领域。
背景技术：
黄豆酱(soybeanpaste)又称大豆酱、黄酱等，是以黄豆、谷物为主要原料，利用以米曲霉、酵母、乳酸菌为主的微生物，经过自然发酵而制成的风味独特的半固体粘稠状的调味品。豆酱作为传统的大豆发酵食品，具有预防肝癌、抑制血清胆固醇上升、抑制脂肪肝积蓄、去除放射性物质、降血压、抗氧化等功效。目前，黄豆酱的杀菌方式主要采用的是巴氏杀菌和添加防腐剂。巴氏杀菌存在着物料内外部杀菌温度不均一，热敏性营养物质损失等缺点。而添加防腐剂不仅抑菌效果差，而且消费者存在着防腐剂是否安全的疑虑。
超声波杀菌技术是一种使用频率大于人类听觉极限(即16khz)的声波来进行杀菌的一种非热杀菌技术。超声波主要是通过空化效应起到杀灭微生物的作用，包括产生声流、微射流、局部热点、冲击波等物理作用以及自由基、过氧化氢等化学作用。与传统热杀菌技术相比，超声杀菌速度快、设备较成熟、易操作、对人体无伤害并且不影响食品的品质。但是，超声波尤其是低频超声波杀菌不彻底，需要和其他方法联合使用。声热复合杀菌技术，一方面，采用的温度较低，能耗小，另一方面，可以很好地保留食品的风味和营养。而且，声热复合杀菌技术操作过程和杀菌设备相对简单，杀菌效果也较好，因此具有较大的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种杀菌效果佳、能很好的保留黄豆酱原有风味的热耦合多频超声杀菌方法。该方法的杀菌设备简单、使用方便、杀菌效果好、有利于工业化应用。
为了实现本发明的目的，采用的技术方案是：
一种热耦合多频超声对黄豆酱杀菌的方法，按照下述步骤进行：将接有大肠杆菌的黄豆酱在温度40～50℃下进行超声波处理，超声条件为：超声频率为20、40、60khz相互组合，超声功率为300～600w，超声时间5～40min。
优选地，温度40℃，超声条件为：超声功率300～600w，频率为20、40、60khz相互组合，超声时间为5～40min。
优选地，温度50℃，超声条件为：超声功率600w，频率20+60khz时，超声时间40min。
优选地，接入黄豆酱中的大肠杆菌为处于对数生长期的细菌。
本发明的有益效果是：本发明提供的热耦合多频超声对黄豆酱的杀菌效果好，对豆酱色泽与营养品质影响小；而且超声设备及技术成本低、能源消耗低、有利于进行工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一、黄豆酱杀菌样品制备
从大肠杆菌菌种保藏管中挑取一环菌液于lb培养基中平板划线获得大肠杆菌单菌落(15h)。取单菌落到50mllb培养基中，37℃、180r/min摇床振荡培养24h。取1ml种子培养液到装有50mllb培养基的锥形瓶中(2％接种量)培养至对数生长期(4h)，使菌液中活菌数量达到107～108cfu/ml。
无菌条件下分别称取9g黄豆酱装入灭菌的聚乙烯小袋，每袋中加1ml培养好的大肠杆菌菌液，热封并贮藏于4℃，待测。
二、热耦合超声杀菌处理
使用江苏大学自制的发散式三频超声反应器(无探头)进行黄豆酱的超声处理。具体操作：将装有含菌酱料的聚乙烯小袋用夹子固定悬挂在铁架台，放至超声槽中心并没过水面。使用蠕动泵控制超声槽中的水温将其保持在所需值。
方案a：设置超声温度40℃，超声功率300w，超声频率20khz，间歇比10/5s，杀菌处理5min。
方案b：设置超声温度50℃，超声功率300w，超声频率20+60khz，间歇比10/5s，杀菌处理40min。
方案c：设置超声温度40℃，超声功率600w，超声频率20khz，间歇比10/5s，杀菌处理5min。
方案d：设置超声温度50℃，超声功率600w，超声频率20+60khz，间歇比10/5s，杀菌处理40min。
三、微生物计数
对处理后的黄豆酱进行大肠杆菌的测定。菌落总数的检测根据gb4789.2-2010《食品微生物学检验菌落总数测定》，采用lb固体平板，37℃下培养24h，计数。重复三次，取平均值。杀菌效果采用残存率的对数值log(n/n0)表示。
结果如表1所示，由表可以看出，热耦合超声可显著降低黄豆酱中的大肠杆菌数。当超声温度50℃，超声功率600w，超声频率20+60khz，间歇比10/5s，处理40min后，大肠杆菌可以减少高达5.35个对数值。
表1热耦合超声对黄豆酱中大肠杆菌杀菌效果影响
四、黄豆酱品质测定
(1)颜色的测定
颜色采用分光测色计来测定l，a和b值，每个条件下测量3个样品，以此来求平均值。然后根据l，a和b来计算样品颜色的变化情况。
(2)质地分析
采用ta.xtplus物性仪分析样品的质构(tpa)。样品的制备：将各样品分别装入25ml烧杯中，抹平表面。
测定参数如下：探头p25；量程＝25kg测试前速度：1.0mm/s；测试速度：1.0mm/s；测试后速度：1.0mm/s；测试距离：5mm。
(3)ph和总酸的测定
ph测定：称取样品5.00g置于100ml小烧杯内，加入蒸馏水30ml，用均质机打碎样品，另用20ml蒸馏水冲洗均质机，将洗液并入匀浆，静置澄清后用ph计测定。
总酸测定：参照中华人民共和国国家标准gb/t5009.40-2003中的4.4进行测定。称取研磨后样品5g置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20ml，置于200ml烧杯中，加60ml水，开动磁力搅拌器，用naoh标准溶液[c(naoh)＝0.05mol/l]进行滴定至ph为8.2，记下消耗的naoh标准溶液的毫升数，可计算总酸，以乳酸计。
(4)氨基酸态氮含量的测定
取5g研磨均匀的样品加50ml蒸馏水，充分混匀加至100ml容量瓶中并定容，取10ml于200ml烧杯中，加入60ml水，参照gb5009.40-2003《酱卫生标准的分析方法》，测定采用甲醛滴定法，结果保留三位有效数字，同一样品测定三次取平均值。
(5)还原糖含量的测定
称取研磨后的样品5g，加入50ml水，经均质后转移至250ml容量瓶中，慢加热5ml乙酸锌溶液及5ml亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，续滤液备用。采用直接滴定法(参照国家标准gb/t5009.7-2016)测定还原糖含量，用干燥至恒重的葡萄糖为标准曲线。每个样品做3个平行，结果取平均值。计算每10ml(碱性酒石酸甲、乙液各5ml)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量(mg)。
结果如表2、表3所示，由表可以看出，热耦合超声对黄豆酱色泽与营养品质影响很小。超声波与热耦合杀菌可以促进黄豆酱的杀菌效果，而且对黄豆酱品质影响小，说明热耦合多频超声技术能够应用于黄豆酱的杀菌中。
表2热耦合超声对黄豆酱品质影响
表3热耦合超声对黄豆酱品质影响
<对比例1>
一、黄豆酱杀菌样品制备
与实施例1中的步骤一方法相同。
二、热杀菌处理
使用电热恒温水槽进行黄豆酱的热处理。加热水浴达到处理温度，将样品放入水浴中加热。
方案a：设置温度为40℃，进行热杀菌处理5min。
方案b：设置温度为40℃，进行热杀菌处理40min。
方案c：设置温度为50℃，进行热杀菌处理5min。
方案d：设置温度为50℃，进行热杀菌处理40min。
每组样品重复处理三次。
三、微生物计数
与实施例1中的步骤三方法相同。结果如表4所示，由表可以看出，热处理可以杀灭大肠杆菌。对比案例1，在相同温度和时间下，单独热处理的杀菌效果不如热耦合超声杀菌，当温度为40～50℃，减少大肠杆菌0.213～2.666个对数值；而热耦合超声可以减少0.258～5.354个对数的大肠杆菌。
表4热处理对黄豆酱中大肠杆菌杀菌效果影响
四、黄豆酱品质测定
与实施例1中的步骤四方法相同。结果如表5，表6所示，40℃～50℃热处理对黄豆酱品质影响不明显。
表5热处理对黄豆酱品质影响
表6热处理对黄豆酱品质影响
<对比例2>
一、黄豆酱杀菌样品制备
与实施例1中的步骤一方法相同。
二、单独超声波杀菌处理
与实施例1中步骤二方法类似，仅设置超声温度为25℃，超声功率600w。超声频率20+60khz，间歇比10/5s进行杀菌处理40min。
每组样品重复处理三次。
三、微生物计数
与实施例1中的步骤三方法相同。本案例实施结果显示单独超声减少大肠杆菌0.981个对数值，对比实施例1中相同功率时间下，单独超声杀菌效果远不如热耦合超声，说明超声可以联合热处理提高杀菌效果。
四、黄豆酱品质测定
与实施例1中的步骤四方法相同。结果如表7、表8所示，单独超声处理对黄豆酱品质影响不大。
表7单独超声处理对黄豆酱品质影响
表8单独超声处理对黄豆酱品质影响
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。