本发明涉及一种多级逆流-复合酶解制备高效补肾壮阳提取液的方法，具体涉及一种以人参花和玛卡为原料利用纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、淀粉酶、蛋白酶中的一种或多种配合罐组式逆流提取工艺提取补肾壮阳提取液的方法，属于植物活性成分提取领域。
背景技术：
人参花又名神草花，是天然的补品，属世间珍贵药材，素有“绿色黄金”之称。本草纲目记载:人参花味道甘苦，性温和，适合阴虚火旺不宜用人参滋补者，人参花有特有的香气，饮用人参花茶可解渴，解毒，生津又不耗气，适合餐后热饮。它的营养成分是人参的3.2倍，人参花含有被医学界誉称为“神奇元素”的锗元素，含量丰富，是灵芝的3倍、卢荟的55倍。人参花具有极好的活性，抗氧化性。能帮助消除体内自由基、改善机体环境、使人体的新陈代谢更加旺盛、避免细胞老化、令人精力充沛、同时可增强机体免疫力、防治肿瘤。人参花其中的元素可使食用者气血旺盛，精力充沛，头脑益智，在提神、抗癌、调理胃肠功能、缓解更年期综合征等诸多方面的突出保健效果，现已经得到了世界许多权威机构的认定，被称之为“免疫保健的万能养生品”。
玛卡是一种纯天然食品，营养成份丰富，有“南美人参”之誉，对人体有滋补强身的功用。研究表明玛卡营养成分主要包括：蛋白质含量为10%以上，59%的碳水化合物；8.5%的纤维，内含丰富的锌、钙、铁、钛、铷、钾、钠、铜、锰、镁、锶、磷、碘等矿物质，并含有维生素c、b1、b2、b6、a、e、b12、b5，脂肪含量不高但其中多为不饱和脂肪酸，亚油酸和亚麻酸的含量达53%以上，天然活性成份包括生物碱、芥子油苷及其分解产物异硫氰酸苄酯、甾醇、多酚类物质等。1999年，美国科学家发现了玛卡中含有两类新的植物活性成份，玛卡酰胺和玛卡稀，并确定这两种物质对平衡人体荷尔蒙分泌有显著作用，所以玛卡又被称为天然荷尔蒙发动机。在玛卡产品的针对性研究中，又发现了几种特殊的玛卡生物碱，随着研究的深入，玛卡中还会有更多的具有活性的新物质被分离和鉴定。
随着社会发展与进步，生活节奏也变得日趋紧张，很多人精力与体力透支，逐步进入亚健康状态，容易出现面白无力、四肢发冷、烦躁盗汗、阳痿早泄、未老先衰等表现。实验表明，有多种传统中药材可以抗疲劳、提高机体耐受力和耐缺氧能力，从而起到补肾壮阳的作用。但中草药功效作用的发挥是建立在中草药活性成分提取的基础上，目前主要的活性成分提取包括煎煮、醇提、酶解、发酵等工艺，多存在中草药活性成分提取率不高、提取工艺复杂难以精准控制、功效活性成分难以发挥其协同功效、生产效率低等技术缺陷，制约了中草药功能性的发挥。
技术实现要素：
为了克服现有技术中中草药活性成分提取率不高、提取工艺复杂难以精准控制、功效活性成分难以发挥其协同功效、生产效率低等技术弊端，本发明的目的在于提供一种以人参花、玛卡为原料利用多级逆流-酶解耦合技术制备补肾壮阳提取液的方法。该方法中将多级逆流-酶解耦合技术应用于复方中草药制备补肾壮阳提取液，采用酶解配合罐组式多级逆流提取工艺提取得到酶解提取液，然后通过超滤法得到超滤浓缩液，除去杂质，浓缩液经干燥即可得到补肾壮阳提取液，该方法制备的补肾壮阳提取液集成人参花和玛卡增强免疫力、补肾壮阳、抗疲劳等功能活性，可显著提升提取液的补肾壮阳功效。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
本发明所述的以人参花、玛卡为原料利用多级逆流-酶解耦合技术提取补肾壮阳的方法，其包括原料预处理、多级逆流-酶解耦合提取、纯化、喷雾干燥四个步骤，所述的具体步骤如下：
1）原料预处理：将含水量30-50%的新鲜人参花（如含水量过低，可加入适量纯净水）打浆至呈糊状，加入粉碎至20目以下的玛卡，混合均匀后投入多级逆流罐组中进行多级逆流-酶解耦合提取；或者将干人参花和玛卡准确配伍后粉碎至20目以下，加入6-10倍重量的纯净水，投入多级逆流罐组中进行多级逆流-酶解耦合提取；
2）多级逆流-酶解耦合提取：设置3-5个浸泡提取罐连续逆流操作，在提取过程中，通过对提取水溶液的逆向转移实现提取相和提余相的逆向操作，将溶出的多糖及时移出，使各罐组之间形成浓度梯度；逆向提取过程中保持罐内温度40-60℃，ph6.0-8.0，反应0.5-2h，添加纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、蛋白酶、淀粉酶中的一种或多种的组合，通过酶解提高功能活性成分溶出率，最终提取液由第一级即投料罐中排出，提余相即提取后的残渣从最后一级即提取水的加入罐中排出，得到酶解提取液；
3）纯化：将酶解提取液过滤或离心，将得到的滤液或离心液通过截留分子量为2000-3500da的超滤膜，并达到脱盐、脱蛋白的目的，得到超滤浓缩液；
4）干燥：超滤浓缩液进一步浓缩至固形物达到25-35%，得到补肾壮阳提取液。
优选的，上述人参花和玛卡的配伍比例为10:5～7，以干物质质量比计算。
最优的，人参花和玛卡的配伍比例为5:3。
优选地，所述步骤2）中纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶的加入量为每千克干中草药原料500个酶活力单位，所述纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶的最佳酶解条件为：提取罐内ph为6.0，酶解温度为50℃，保温时间为1小时。
优选地，所述步骤2）中淀粉酶的加入量为每千克干中草药原料450个酶活力单位，所述淀粉酶的最佳酶解条件为：提取罐内ph为7.0，酶解温度为55℃，保温时间为2小时。
优选地，所述步骤2）中蛋白酶的加入量为每千克干中草药原料200个酶活力单位，所述蛋白酶的最佳酶解条件为：提取罐内ph为8.0，酶解温度为45℃，保温时间为1小时。
优选地，所述步骤3）中的过滤操作中滤布的目数为600-1000目；所述步骤3）中的离心操作中离心转速为5000转/分，离心时间为10min。
进一步优选的，所述步骤2）中添加一定量的柚苷酶，加入量为每千克干中草药原料200个酶活力单位。
申请人根据上述条件的组合对本发明的制备方法进行了深入研究，申请人发现，本发明最优选的一个实施方式中，所述的具体步骤如下：
1）预处理：将干人参花和玛卡按5:3比例混合，粉碎后过20目筛，投入多级逆流浸泡罐，加入6倍重量的水，进行多级逆流-酶解耦合提取；
2）多级逆流-酶解耦合提取：设置3级逆流提取罐连续逆流操作，一级罐保持温度40℃，二级罐温度50℃，三级罐温度60℃，调节各罐ph为7.0，按每千克干中草药原料500个酶活力单位加入纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶，450个酶活力单位加入淀粉酶，200个酶活力单位加入蛋白酶和柚苷酶，逆流提取1小时，升温至90℃以上，保温15分钟，灭酶活，最终提取液由第一级即投料罐中排出，残渣从三级罐即提取水的加入罐中排出，得到粗提取液；
3）纯化：将粗提取液过滤或离心，将得到的滤液或离心液通过截留分子量为2500da的超滤膜，达到脱盐、脱蛋白及其它杂质的目的，得到超滤浓缩液；
4）干燥：超浓缩液进一步浓缩至固形物达到30%即得补肾壮阳提取液。
本发明效果实施例显示，按照本发明方法制备的补肾壮阳提取液具有功能活性成分（多糖、皂甙、黄酮等）提取率高、能耗低等优势，具有显著的补肾壮阳功效。
本发明还请求保护按照上述方法制备得到的补肾壮阳提取液。
上述补肾提取液还可以进一步制备成保健食品、食品添加剂、饲料添加剂和功能型农业生物制品，用于保健食品、食品添加剂或饲料添加剂时可以显著提升补肾壮阳功效，增强机体的免疫力。
本发明与现有技术相比技术优势在于：
1）产品功效好。本发明效果实施例显示，按照本发明方法制备的补肾壮阳提取液具有显著的壮阳功效，通过多级逆流-酶解耦合技术显著提高了人参花和玛卡中功能活性成分的浸出率，并在酶解过程中对功能活性成分耦合，进一步提升了提取液的补肾壮阳功效；
2）中草药文化的精髓在于“方”，这表明中草药间的协同增效作用是中草药功效的基础。试验结果表明，本发明在提取液的酶解过程中将人参花和玛卡的功能活性成分进行了耦合，实现了其协同增效的保健功效；
3）生产过程中用水量低，减少了废水的排放，降低能耗，利于规模化生产；产品可以进一步制备成保健食品、食品添加剂、饲料添加剂和功能型农业制品，应用前景广阔。
具体实施方式
实施例1
一种多级逆流-复合酶解制备高效补肾壮阳提取液的方法，具体包括如下步骤：
1）预处理：将干人参花和玛卡按5:3比例混合，粉碎后过20目筛，投入多级逆流浸泡罐，加入6倍重量的水，进行多级逆流-酶解耦合提取；
2）多级逆流-酶解耦合提取：设置3级逆流提取罐连续逆流操作，一级罐保持温度40℃，二级罐温度50℃，三级罐温度60℃，调节各罐ph为7.0，按每千克干中草药原料500个酶活力单位加入纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶，450个酶活力单位加入淀粉酶，200个酶活力单位加入蛋白酶，逆流提取1小时，升温至90℃以上，保温15分钟，灭酶活，最终提取液由第一级即投料罐中排出，残渣从三级罐即提取水的加入罐中排出，得到粗提取液；
3）纯化：将粗提取液过滤或离心，将得到的滤液或离心液通过截留分子量为2500da的超滤膜，达到脱盐、脱蛋白及其它杂质的目的，得到超滤浓缩液；
4）干燥：超浓缩液进一步浓缩至固形物达到30%即得补肾壮阳提取液。
实施例2：
一种多级逆流-复合酶解制备高效补肾壮阳提取液的方法，具体包括如下步骤：
1）预处理：将干人参花和玛卡按2:1比例混合，粉碎后过20目筛，投入多级逆流浸泡罐，加入6倍重量的水，进行多级逆流-酶解耦合提取；
2）多级逆流-酶解耦合提取：设置3级逆流提取罐连续逆流操作，一级罐保持温度40℃，二级罐温度50℃，三级罐温度60℃，调节各罐ph为7.0，按每千克干中草药原料500个酶活力单位加入纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶，450个酶活力单位加入淀粉酶，200个酶活力单位加入蛋白酶，逆流提取1小时，升温至90℃以上，保温15分钟，灭酶活，最终提取液由第一级即投料罐中排出，残渣从三级罐即提取水的加入罐中排出，得到粗提取液；
3）纯化：将粗提取液过滤或离心，将得到的滤液或离心液通过截留分子量为2500da的超滤膜，达到脱盐、脱蛋白及其它杂质的目的，得到超滤浓缩液；
4）干燥：超浓缩液进一步浓缩至固形物达到30%即得补肾壮阳提取液。
实施例3
一种多级逆流-复合酶解制备高效补肾壮阳提取液的方法，具体包括如下步骤：
1）预处理：将干人参花和玛卡按10:7比例混合，粉碎后过20目筛，投入多级逆流浸泡罐，加入6倍重量的水，进行多级逆流-酶解耦合提取；
2）多级逆流-酶解耦合提取：设置3级逆流提取罐连续逆流操作，一级罐保持温度40℃，二级罐温度50℃，三级罐温度60℃，调节各罐ph为7.0，按每千克干中草药原料500个酶活力单位加入纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶，450个酶活力单位加入淀粉酶，200个酶活力单位加入蛋白酶，逆流提取1小时，升温至90℃以上，保温15分钟，灭酶活，最终提取液由第一级即投料罐中排出，残渣从三级罐即提取水的加入罐中排出，得到粗提取液；
3）纯化：将粗提取液过滤或离心，将得到的滤液或离心液通过截留分子量为2500da的超滤膜，达到脱盐、脱蛋白及其它杂质的目的，得到超滤浓缩液；
4）干燥：超浓缩液进一步浓缩至固形物达到30%即得补肾壮阳提取液。
实施例4
一种多级逆流-复合酶解制备高效补肾壮阳提取液的方法，具体包括如下步骤：
1）预处理：将干人参花和玛卡按5:3比例混合，粉碎后过20目筛，投入多级逆流浸泡罐，加入6倍重量的水，进行多级逆流-酶解耦合提取；
2）多级逆流-酶解耦合提取：设置3级逆流提取罐连续逆流操作，一级罐保持温度40℃，二级罐温度50℃，三级罐温度60℃，调节各罐ph为7.0，按每千克干中草药原料500个酶活力单位加入纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶，450个酶活力单位加入淀粉酶，200个酶活力单位加入蛋白酶、柚苷酶，逆流提取1小时，升温至90℃以上，保温15分钟，灭酶活，最终提取液由第一级即投料罐中排出，残渣从三级罐即提取水的加入罐中排出，得到粗提取液；
3）纯化：将粗提取液过滤或离心，将得到的滤液或离心液通过截留分子量为2500da的超滤膜，达到脱盐、脱蛋白及其它杂质的目的，得到超滤浓缩液；
4）干燥：超浓缩液进一步浓缩至固形物达到30%即得补肾壮阳提取液。
实施例5
一种多级逆流-复合酶解制备高效补肾壮阳提取液的方法，具体包括如下步骤：
1）预处理：将干人参花和玛卡按2:1比例混合，粉碎后过20目筛，投入多级逆流浸泡罐，加入6倍重量的水，进行多级逆流-酶解耦合提取；
2）多级逆流-酶解耦合提取：设置3级逆流提取罐连续逆流操作，一级罐保持温度40℃，二级罐温度50℃，三级罐温度60℃，调节各罐ph为7.0，按每千克干中草药原料500个酶活力单位加入纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶，450个酶活力单位加入淀粉酶，200个酶活力单位加入蛋白酶、柚苷酶，逆流提取1小时，升温至90℃以上，保温15分钟，灭酶活，最终提取液由第一级即投料罐中排出，残渣从三级罐即提取水的加入罐中排出，得到粗提取液；
3）纯化：将粗提取液过滤或离心，将得到的滤液或离心液通过截留分子量为2500da的超滤膜，达到脱盐、脱蛋白及其它杂质的目的，得到超滤浓缩液；
4）干燥：超浓缩液进一步浓缩至固形物达到30%即得补肾壮阳提取液。
实施例6
一种多级逆流-复合酶解制备高效补肾壮阳提取液的方法，具体包括如下步骤：
1）预处理：将干人参花和玛卡按10:7比例混合，粉碎后过20目筛，投入多级逆流浸泡罐，加入6倍重量的水，进行多级逆流-酶解耦合提取；
2）多级逆流-酶解耦合提取：设置3级逆流提取罐连续逆流操作，一级罐保持温度40℃，二级罐温度50℃，三级罐温度60℃，调节各罐ph为7.0，按每千克干中草药原料500个酶活力单位加入纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶，450个酶活力单位加入淀粉酶，200个酶活力单位加入蛋白酶、柚苷酶，逆流提取1小时，升温至90℃以上，保温15分钟，灭酶活，最终提取液由第一级即投料罐中排出，残渣从三级罐即提取水的加入罐中排出，得到粗提取液；
3）纯化：将粗提取液过滤或离心，将得到的滤液或离心液通过截留分子量为2500da的超滤膜，达到脱盐、脱蛋白及其它杂质的目的，得到超滤浓缩液；
4）干燥：超浓缩液进一步浓缩至固形物达到30%即得补肾壮阳提取液。
实施例7补肾壮阳功效研究
试验动物：雄性icr小鼠，体质量（20±2）g；
分组与给药：110只icr雄性小鼠，在实验条件下适应5天后，分为11个试验组，每组10只。其中实施例1-6试验组给予本发明补肾壮阳提取液，对照1组和对组2组分别给予人参花提取液和玛卡提取液（制备工艺同实施例1），对照3组和对组4组分别给予人参花提取液和玛卡提取液（制备工艺同实施例4），空白对照组ig小鼠灌胃等体积省里盐水，灌胃剂量均为2g.kg-1。30天后测定各项指标；
负重游泳实验：参照《保健食品检验与评价技术规范》要求对雄性小鼠进行负重游泳实验和常压耐缺氧实验。将小鼠末次灌胃给药30min后，在小鼠尾根部1/3～2/3处负荷体重的5%铅皮，在水深30cm水温（30±2）℃的水中游泳，同时准备多个60cm×40cm×50cm水槽，并用秒表记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，小鼠头部沉入水中7s不起为计时终止时间；
常压耐缺氧实验:参照《保健食品检验与评价技术规范》要求对雄性小鼠进行常压耐缺氧实验。将小鼠末次灌胃给药1h后，5g钠石灰用纱布包裹放入250ml的广口瓶中，将小鼠放入瓶中（每瓶1只），瓶口立即涂抹凡士林盖严，用秒表记录小鼠自放入瓶中开始至出现全身痉挛症状的时间，并迅速将小鼠取出。
血清no和睾酮（t）值测定:将小鼠经常压耐缺氧实验后休息60min，摘眼球取血存于1.5ml离心管中，4000r/min离心5min后取上层血清，按照no和睾酮试剂盒说明书操作处理样品并用酶标仪测定含量;
试验结果如下表所示：
上述实验结果表明，本发明补肾壮阳提取液具有显著的补肾壮阳功效。比较实施例补肾壮阳效果，实施例4为本发明最佳实施例。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。