包含罗汉果提取物作为有效成分的用于预防、改善或治疗呼吸系统疾病的组合物的制作方法

[0001]
本发明涉及包含罗汉果残渣提取物作为有效成分的用于预防、改善或治疗呼吸系统疾病的组合物。


背景技术：

[0002]
哮喘、慢性阻塞性肺疾病、过敏性鼻炎、镇咳祛痰、急慢性支气管炎、细支气管炎、咽喉炎、扁桃体炎、喉炎等为呼吸系统疾病的代表性疾病。哮喘(asthma)是指在呼吸道，尤其在支气管发生的慢性炎症。由哮喘引发的炎症可通过煤烟、过敏性抗原、凉风、运动、呼吸道感染等诸多因素而恶化，持续的炎症会引起呼吸道的变形及呼吸道的高反应性(hyper-responsiveness)。通过这些原因会发生哮鸣(wheezing，因呼吸道变得狭窄而发出呼呼或呜噜呜噜的呼吸音的症状)或者气喘咳嗽、排出过多咳痰等的一般症状。
[0003]
呼吸道大体上由黏膜和称为支气管平滑肌的肌肉构成，黏膜有许多分泌腺，因此持续分泌所需的分泌物，若平滑肌收缩，则呼吸道变得狭窄。若因煤烟、过敏性抗原、凉风、运动、呼吸道感染等诸多因素引起炎症反应，则分泌腺中分泌的分泌物增加，该分泌物堵塞呼吸道，黏膜向呼吸道内侧肿起，使呼吸道更加狭窄。由此，出现严重的伴随哮鸣的阵发性咳嗽和呼吸困难，发作时会发出干咳并感到胸部压迫感。没有哮鸣而只有慢性咳嗽和胸部压迫感的不明原因的呼吸困难症状的哮喘也很多，这些症状具有在日常生活中突然出现的倾向。
[0004]
另外，罗汉果(siraitia grosvenori)是中国广东、广西省高寒地区栽培的葫芦科多年生草本植物，果实为直径4～5cm的鸡蛋形或球形，原本在中国桂林地区当做清凉饮料的原料或调味料来使用，民间在嗓子疼或咳嗽、胃或肠不舒服的时候使用。
[0005]
作为与罗汉果提取物有关的已知现有技术的一例，在韩国公开专利第2015-0051369号公开了包含罗汉果作为有效成分的用于预防及治疗哮喘及特应症的药学组合物，但到目前为止，尚无已知的有关本发明的包含罗汉果残渣提取物作为有效成分的用于预防、改善或治疗呼吸系统疾病的组合物的发明。


技术实现要素：

[0006]
技术问题
[0007]
本发明由上述要求导出，本发明提供包含罗汉果残渣提取物作为有效成分的用于预防、改善或治疗呼吸系统疾病的组合物，通过确认罗汉果残渣提取物在由卵清蛋白(ova)诱导的哮喘动物模型中的呼吸道高反应性减少、支气管肺泡灌洗液内炎症细胞抑制及支气管肺泡灌洗液内th2细胞因子(白细胞介素4(il-4)、白细胞介素5(il-5)及白细胞介素13(il-13))减少、肺组织的炎症及组织损伤减少、呼吸道平滑肌收缩及呼吸道炎症抑制效果，在肺组织中的白细胞介素13、胸腺活化调解趋化因子(tarc)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素17及黏液基因黏蛋白5ac(muc5ac)的表达抑制效果，血清内卵清蛋白特异免疫球蛋
白e(ige)含量减少效果，减少通过微尘增加的肺泡细胞中的活性氧簇(ros)的效果及罗汉果残渣提取物和罗汉果提取物的超高效液相色谱(uplc)的曲线图不同，从而完成本发明。
[0008]
技术方案
[0009]
为了实现上述目的，本发明提供包含罗汉果残渣提取物作为有效成分的用于预防或改善呼吸系统疾病的保健功能食品组合物。
[0010]
并且，本发明提供包含罗汉果残渣提取物作为有效成分的用于预防或治疗呼吸系统疾病的药学组合物。
[0011]
发明的效果
[0012]
本发明涉及包含罗汉果残渣提取物作为有效成分的用于预防、改善或治疗呼吸系统疾病的组合物，本发明的罗汉果残渣提取物具有如下的效果：在由卵清蛋白诱导的哮喘动物模型中的呼吸道高反应性减少、支气管肺泡灌洗液内炎症细胞抑制及支气管肺泡灌洗液内th2细胞因子(白细胞介素4、白细胞介素5及白细胞介素13)减少、肺组织的炎症及组织损伤减少、呼吸道平滑肌收缩及呼吸道炎症抑制效果，在肺组织中的白细胞介素13、胸腺活化调解趋化因子、肿瘤坏死因子α、白细胞介素17及黏液基因黏蛋白5ac的表达抑制效果、血清内卵清蛋白特异免疫球蛋白e含量减少效果，减少因微尘增加的肺泡细胞中的活性氧簇的效果。本发明的罗汉果残渣提取物的炎症抑制活性比作为可用部分的罗汉果提取物更加优秀，因此可以更加有用地使用。
附图说明
[0013]
图1为利用哮喘动物模型的根据罗汉果残渣提取物的给药的呼吸道高反应性(airway hyperresponsiveness)分析结果。**、***表示在给药本发明的罗汉果残渣提取物的组中的penh值相对于对照组在统计学上显著减少，其中，**为p＜0.01，***为p＜0.001。
[0014]
图2为向哮喘动物模型给药罗汉果残渣提取物后确认支气管肺泡灌洗液(balf)内炎症细胞的减少效果的结果。###表示使用卵清蛋白处理的对照组的支气管肺泡灌洗液内炎症细胞数量及嗜酸性粒细胞数量相对于正常组在统计学上显著增加，其中，p＜0.001，*、**表示在阳性对照组(mon)及使用本发明的罗汉果残渣提取物处理的组中的支气管肺泡灌洗液内炎症细胞数量及嗜酸性粒细胞数量相对于对照组在统计学上显著增加，其中，*为p＜0.05，**为p＜0.01。
[0015]
图3为向哮喘动物模型给药罗汉果残渣提取物后通过苏木精-伊红染色法(h&e)确认肺组织的炎症减少效果的结果。
[0016]
图4为向哮喘动物模型给药罗汉果残渣提取物后通过mt染色确认肺组织的胶原沉积增加导致的组织损伤减少效果的结果。
[0017]
图5为向哮喘动物模型给药罗汉果残渣提取物后通过苏木精-伊红染色法确认呼吸道炎症的减少效果的结果。
[0018]
图6为向哮喘动物模型给药罗汉果残渣提取物后通过ab/pas染色法确认呼吸道平滑肌的收缩导致的呼吸道阻塞及呼吸道炎症的减少效果的结果。
[0019]
图7为向哮喘动物模型给药罗汉果残渣提取物后在肺组织中确认炎症诱发因子(白细胞介素13、胸腺活化调解趋化因子、肿瘤坏死因子α、黏蛋白5ac、白细胞介素17)的减少效果的结果。##、###表示使用卵清蛋白处理的对照组的炎症诱发因子(白细胞介素13、胸
腺活化调解趋化因子、肿瘤坏死因子α、黏蛋白5ac、白细胞介素17)相对于正常组在统计学上显著增加，其中，##为p＜0.01、###为p＜0.001，*、**、***表示在阳性对照组及使用本发明的罗汉果残渣提取物处理组中的炎症诱发因子(白细胞介素13、胸腺活化调解趋化因子、肿瘤坏死因子α、黏蛋白5ac、白细胞介素17)相对于对照组在统计学上显著减少，其中，*为p＜0.05，**为p＜0.01，***为p＜0.001。
[0020]
图8为向哮喘动物模型给药罗汉果残渣提取物后确认血清中的卵清蛋白特异免疫球蛋白e的含量减少的结果。###表示使用卵清蛋白处理的对照组的卵清蛋白特异免疫球蛋白e含量相对于正常组在统计学上显著增加，其中，p＜0.001，*、**表示在阳性对照组(mon)及使用本发明的罗汉果残渣提取物处理的组中卵清蛋白特异免疫球蛋白e的含量相对于对照组在统计学上显著减少，其中，*为p＜0.05，**为p＜0.01。
[0021]
图9为通过使用本发明的罗汉果残渣提取物处理因微尘而导致活性氧簇增加的mh-s细胞来确认减少活性氧簇的结果。###表示使用微尘(cf)处理的对照组的活性氧簇含量相对于正常组在统计学上显著增加，其中，p＜0.001，**、***表示在使用本发明的罗汉果残渣提取物处理的组中的活性氧簇含量相对于对照组在统计学上显著减少，其中，**为p＜0.01，***为p＜0.001。
[0022]
图10本发明的罗汉果残渣提取物(a)、罗汉果乙醇提取物(b)以及罗汉果水提取物(c)的超高效液相色谱曲线图。
具体实施方式
[0023]
本发明涉及包含罗汉果残渣提取物作为有效成分的用于预防或改善呼吸系统疾病的保健功能食品组合物。
[0024]
优选地，上述罗汉果残渣提取物通过包括如下步骤的方法制备：步骤(1)，向干燥的罗汉果添加提取溶剂来提取及过滤并去除上清液；以及步骤(2)，向去除上清液后剩余的上述罗汉果残渣添加乙醇来获得罗汉果残渣提取物，但不限于此。优选地，上述提取溶剂为水、c1～c4的低级醇或它们的混合物，更优选地，提取溶剂为水，但不限于此。优选地，上述呼吸系统疾病选自由哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支气管炎、咽喉炎、扁桃体炎以及喉炎组成的组中，但不限于此。上述呼吸系统疾病可以通过微尘诱发，但不限于此。
[0025]
本发明的保健功能食品组合物可以制备为选自粉末、颗粒、丸、片剂、胶囊、糖果、糖浆以及饮料中的任一种剂型，但不限于此。
[0026]
当将本发明的保健功能食品组合物用作食品添加物时，可以直接添加上述保健功能食品组合物，或者与其他食品或食品成分一同使用，可以根据常规方法适当的使用。有效成分可以根据其使用目的(预防或改善)来适当的使用。通常，当制备食品或饮料时，相对于原料，可添加15重量份以下的本发明的保健功能食品组合物，优选地，可以添加10重量份以下的量。然而，若以健康为目的来长期摄取，则可以使用上述范围以下的量，而且由于在安全性上没有任何问题，有效成分也能够以上述范围以上的量来使用。
[0027]
上述保健功能食品的种类没有特别限制。作为可以添加上述保健功能食品组合物的食品的例，可例举肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、小食品、饼干、披萨、拉面、其他面类、口香糖、包括冰激凌的奶制品、各种汤类、饮料、茶饮品、酒精饮料及维生素复合剂等，可以包括通常意义的所有保健食品。并且，本发明的保健功能食品组合物可以制备为食品，尤其可
以制备为功能食品。本发明的功能食品可以包含通常添加的成分。例如，包含蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素以及调味剂。例如，当制备为饮剂时，除有效成分以外还可以包含天然碳水化合物或香味剂作为追加成分。优选地，上述天然碳水化合物为单糖(例如葡萄糖、果糖等)、二糖(例如麦芽糖、蔗糖等)、低聚糖、多糖(例如糊精、环糊精等)或者糖醇(例如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等)。上述香味剂可以使用天然香味剂(例如索马甜、甜叶菊提取物等)和合成香味剂(例如糖精、阿巴斯甜等)。除上述保健功能食品组合物外还可以含有多种营养剂、维生素、电解质、风味剂、着色剂、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph值调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。以上添加的这些成分的比例不是很重要，但通常可以在相对于100重量份的本发明保健功能食品组合物的0.01重量份～0.1重量份的范围内选择。
[0028]
并且，本发明涉及包含罗汉果残渣提取物作为有效成分的用于预防或治疗呼吸系统疾病的药学组合物。
[0029]
上述呼吸系统疾病可以通过微尘诱发，但不限于此。
[0030]
优选地，本发明的包含罗汉果残渣提取物的药学组合物可以为选自胶囊剂、散剂、颗粒剂、片剂、悬浊液、乳剂、糖浆剂喷剂中的任一种剂型，但不限于此。除上述罗汉果残渣提取物外，还可以包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，作为可以包含于包含罗汉果残渣提取物的药学组合物中的载体、赋形剂或稀释剂，可例举乳糖、葡萄糖、蔗糖、低聚糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、褐藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油。当制剂化时，可以使用通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂。本发明的罗汉果残渣提取物的优选剂量可以根据患者的状态及体重、疾病程度、药物形态、给药途径及时间而不同，但可以通过普通技术人员进行适当的选择。但为了优选的效果，本发明的包含罗汉果残渣提取物的药学组合物能够以一日0.0001～100mg/kg的量给药，优选地，能够以0.001～10mg/kg的量给药。可以一日给药一次，也可以分为多次给药。上述剂量不在任何方面限制本发明的范围。
[0031]
以下，利用实施例更加详细地说明本发明。这些实施例仅用于更加具体地说明本发明，本发明并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言是显而易见的。
[0032]
实施例1.制备罗汉果提取物
[0033]
粉碎200g的干燥罗汉果后，添加2l的水进行3小时的回流提取。过滤提取液后，向对剩下的残渣进行干燥后的50g干燥残渣添加1l的70％(v/v)乙醇后，进行3小时的回流提取。过滤提取液后，通过浓缩、干燥来制备罗汉果残渣提取物。
[0034]
实施例2.利用哮喘动物模型的根据给药罗汉果残渣提取物的呼吸道高反应性分析。
[0035]
使用通过卵清蛋白诱发支气管哮喘的动物模型进行实验。实验动物为jackson laboratory公司(巴尔港(bar harbor)，缅因州(me)，美国(usa))提供的7周龄的balb/c小鼠，使其适应1周后用于实验。向驯化1周的小鼠以2周的间隔向腹腔注入悬浮有0.26mg的氢氧化铝(a8222，sigma-aldrich公司，密苏里州(mo)，美国)和12.5μg(a5503，sigma-aldrich
公司)的卵清蛋白的0.25ml的磷酸缓冲溶液来使其致敏。在第一次向腹腔内给药卵清蛋白后的第3日、第10日向小鼠气管内注射(intratracheal injection)2mg的卵清蛋白后，从第21日开始的4周内，使用超声波喷雾器(ne-u12，omron公司，东京(tokyo)，日本(japan))使小鼠每天吸入30分钟的卵清蛋白(1周～3周：暴露在1％的卵清蛋白，4周：暴露在2％的卵清蛋白)。在最后一次暴露在卵清蛋白后的48小时后，对其进行麻醉后采集血液及解剖来观察病理学变化。
[0036]
将实验组设定为正常组(normal，未给药并吸入卵清蛋白的组)、哮喘诱发组(ova-control，给药并吸入卵清蛋白的组)、阳性对照组(ova-mon，给药10mg/kg的孟鲁司特钠(montelukast)+给药并吸入卵清蛋白的组)、试样给药组1(200mg/kg的卵清蛋白-罗汉果残渣、200mg/kg的罗汉果残渣提取物+给药并吸入卵清蛋白的组)、试样给药组2(100mg/kg的卵清蛋白-罗汉果残渣、100mg/kg的罗汉果残渣提取物+给药并吸入卵清蛋白的组)来进行实验。
[0037]
药物及试样在第一次给药卵清蛋白后的第21日开始经口服给药4周。每个组使用10只小鼠。
[0038]
为了分析呼吸道高反应性，在最后暴露在卵清蛋白后经过24小时的时间点，使用buxco system(biosystems xa，dsi公司，明尼苏达州(mn)，美国)检测因哮喘发生引起的呼吸道高反应性。呼吸道阻力的程度通过检测呼气间歇(enhanced pause(penh))来评价。将乙酰甲胆碱(a2251，sigma-aldrich公司)以6.25mg/ml、12.5mg/ml及25mg/ml的浓度逐渐增加后使小鼠吸入，使用数学式1来测定penh值。
[0039]
数学式1：penh＝pause
×
pef/pif，pause＝(t
e
－t
r
)/t
r
[0040]
(pif：最大吸气流量(peak inspiratory flow)，pef：最大呼气流量(peak expiratory flow)，t
e
：e时间(e time)，t
r
：放松时间(relaxation time))。
[0041]
其结果如图1所示，哮喘诱发组的penh值与乙酰甲胆碱(methacholine)的浓度成比地显著增加，与此相比，当以100mg/kg或200mg/kg的浓度处理本发明的罗汉果残渣提取物时，检测出比哮喘诱发组低的penh值。尤其，相比于使用25mg/kg的乙酰甲胆碱处理的组，显出统计学上的显著差异。
[0042]
实施例3.向哮喘动物模型给药罗汉果残渣提取物后支气管肺泡灌洗液内炎症细胞的减少效果确认
[0043]
在暴露在卵清蛋白的动物模型最后暴露在卵清蛋白后经过48小时的时间点，将小鼠麻醉后切开支气管。使用1.0ml的冰冷(ice-cold)dmem培养基清洗支气管肺泡并收集清洗液。每个个体的支气管肺泡清洗液在回收后马上进行离心分离来分离血细胞，使用0.04％的台盼蓝(trypan blue)染色后，使用血细胞计数器(hematocytometer)来计算总细胞数后，使用细胞离心涂片器(cytospin)进行标本涂片后，实施迪夫快速(diff-quick)染色(罗曼诺夫斯基染色剂(romanowsky stain))，通过400倍的光学显微镜(light microscope，尼康(nikon)公司，日本)来鉴别计算嗜酸性粒细胞和其他炎症细胞。
[0044]
其结果如图2所示，确认哮喘诱发组的支气管肺泡灌洗液内的炎症细胞在统计学上显著增加，而给药本发明的罗汉果残渣提取物的组的支气管肺泡灌洗液内炎症细胞在统计学上显著减少。
[0045]
实施例4.向哮喘动物模型给药罗汉果残渣提取物后支气管肺泡灌洗液内th2细胞
因子(白细胞介素4、白细胞介素5及白细胞介素13)生成抑制效果确认
[0046]
使用市面上出售的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)试剂盒(kit)(r&d system公司，美国)检测从每个个体分离的支气管肺泡灌洗液中的白细胞介素(interleukin)4、白细胞介素5及白细胞介素13的生成量。对各细胞因子的分析根据制造公司的实验方法来实施，使用酶联免疫吸附测定判读器在450nm的吸光度下进行检测。
[0047]
其结果如表1所示，确认哮喘诱发组的支气管肺泡灌洗液内的白细胞介素4、白细胞介素5、白细胞介素13的生成量在统计学上显著增加，而给药本发明的罗汉果残渣提取物的组中的支气管肺泡灌洗液内白细胞介素4、白细胞介素5、白细胞介素13的生成量相对于哮喘诱发组在统计学上显著减少。
[0048]
表1支气管肺泡灌洗液内炎症细胞数量
[0049][0050][0051]
#、###：表示哮喘诱发组的炎症细胞数量相对于正常组在统计学上显著增加，其中，#为p＜0.05，###为p＜0.001。*、**、***：表示阳性对照组及使用本发明的罗汉果残渣提
取物处理的组的炎症细胞数量相对于哮喘诱发组在统计学上显著减少，其中，*为p＜0.05，**为p＜0.01，***为p＜0.001。
[0052]
实施例5.向哮喘动物模型给药罗汉果残渣提取物后的组织病理学检查(苏木精-伊红染色、mt染色、阿利新蓝-过碘酸-雪夫(ab/pas)染色)
[0053]
为了观察肺和呼吸道(trakea)组织的病理损伤程度，摘出肺组织后经过使用10％的中性福尔马林溶液(neutral buffered formalin)固定和使用石蜡进行包埋制备成块(block)后，制备为4μm厚度的组织切片。之后，为了观察肺和呼吸道组织内的炎症，进行苏木精-伊红(h&e，hematoxylin&eosin)染色，作为胶原(collagen)沉积(deposition)染色的mt(masson's trichrome)染色，为了观察因黏液分泌及呼吸道平滑肌收缩而导致的呼吸道阻塞而进行阿利新蓝-过碘酸-雪夫(ab-pas)染色。使用光学显微镜观察肺和呼吸道的病理变化。
[0054]
其结果如图3至图6所示，确认在哮喘诱发组中显出的肺组织的炎症及组织损伤减少、呼吸道平滑肌收缩及呼吸道炎症在给药本发明的罗汉果残渣提取物的组中得到缓解。
[0055]
实施例6.向哮喘动物模型给药罗汉果残渣提取物后在肺组织中的炎症诱发因子(白细胞介素13、胸腺活化调解趋化因子、肿瘤坏死因子α、黏蛋白5ac、白细胞介素17)的减少效果确认
[0056]
摘出肺组织，利用rnazol b reagent(tel-test公司，奥斯丁(austin)，得克萨斯州(tx)，美国)提取总核糖核酸(total rna)，使用revertraace-a-cdna synthesis kit(toyobo公司，大阪(osaka)，日本)将3μg的总核糖核酸合成为互补脱氧核糖核酸(cdna)。合成的互补脱氧核糖核酸使用applied biosystems 7500型实时聚合酶链式反应系统(real-time pcr system)(applied biosystems公司，美国)进行实时聚合酶链式反应(real-time pcr)来分析白细胞介素13、肿瘤坏死因子α、白细胞介素17、胸腺活化调解趋化因子、黏蛋白5ac的表达。实时聚合酶链式反应的条件如下，即，预变性(pre-denaturation)在50℃的温度下进行2分钟，在94℃的温度下进行10分钟，以及40个循环在94℃的温度下进行1分钟、在60℃的温度下进行1分钟。磷酸甘油醛脱氢酶探针(gapdh probe)使用catcctgcaccaccaactgcttagcc(vic)(序列11)(探针为applied biosystems公司提供的产品)，试样给药组和对照组将磷酸甘油醛脱氢酶用作内标物(internal standard)，利用下述数学式2检测相对定量(rq，relative quantitative)。
[0057]
数学式2
[0058]
目标组的定量聚合酶链式反应(quantitative pcr)y＝x(1+e)n
[0059]
以x＝开始的量(starting quantity)，y＝产量(yield)，n＝循环数(number of cycles)，e＝效率(efficiency)进行计算来检测相对定量。
[0060]
表2
[0061]
elution)。流速调节为0.4ml/min，注入的溶液的量为2μl，检测仪器使用四极杆飞行时间质谱仪(qtof ms)，在负离子(negative ion)模式下进行分析。
[0073]
其结果如图10所示，确认罗汉果的水提取物及罗汉果的乙醇提取物显出相似的曲线图，但本发明的罗汉果残渣乙醇提取物与上述罗汉果的水或乙醇提取物不同，从而判断两个发明的有效成分不同。
[0074]
统计处理
[0075]
所有检测结果都以平均值(mean)和平均值的标准误差(standard error of the mean；se)表示，实验组之间的差异通过学生t检验(student's t-test)进行统计学分析，若p＜0.05，则判定为具有统计学上的显著性。