一种具有补钙功效的酶解骨粉制备方法与流程

1.本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种补钙功效的酶解磷骨粉的制备方法。


背景技术：

2.钙是人体中最丰富的无机元素，在人体生命活动中起着极为重要的作用。钙缺乏在我国居民膳食中较为突出。正常情况下，成人体内含钙总量约为1200克，约占人体成分的2％，其中约99％的钙存在于骨骼和牙齿中。钙的更新速度随着年龄的增长而减慢，幼儿的骨骼每1～2年更新一次，成年人的骨骼每10～12年才能更新一次，然而，根据全国营养调查数据显示，我国人均日摄入钙仅为360.06mg，占推荐量的50％左右。儿童、青少年、孕妇、乳母和绝经后妇女容易受到缺钙的威胁。随着人体年龄的增长，骨骼中的钙、磷等无机物质的含量逐渐减少，如不充分补充钙，就会出现骨质疏松症，故60岁以上女性骨质疏松症的患病率在60％～70％左右。另外我国的膳食组成以植物性食物为主，植酸盐，纤维素，糖醛酸，藻酸钠和草酸等含量较高，致使食物中钙的吸收率很低。
3.目前国内市场的钙制剂品种繁多，主要分为合成钙剂和天然钙制剂。从国际市场来看，碳酸钙因其元素钙量高而成为剂型最多、应用最广泛的补钙剂。但是碳酸钙本身呈碱性，且溶解度较低，必须在胃中与大量胃酸反应生产离子钙后才能被吸收，胃很难在有限的时间内分泌足够量的胃酸将其全部离子化，尤其是对于老年人、儿童和患有胃病的人来说更难。如今，钙的营养问题已引起人们越来越多的重视，寻找来源丰富、质优价廉、吸收率高的补钙产品，对于预防缺钙和骨质疏松症具有十分重要的意义。
4.我国每年约有近1000万吨的各类畜骨产生，绝大多数骨头都没有得到充分利用，不仅造成巨大的浪费，还会因骨头富含的营养物质易于腐败而造成严重的环境污染。本发明针对现有现状，提供一种补钙功效的酶解骨粉的制备方法，通过生物酶解技术将骨粉处理得到的产品，充分分离残留蛋白质中的钙，促进其吸收利用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有补钙功效的酶解骨粉的制备方法，其包括以下步骤：
6.(1)预处理：用碎骨机将骨渣进行粉碎，30-40目，用胶体磨研磨成浆，200-260目。
7.(2)酶处理：料液比1∶20，加入a酶(木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶中的一种)，按照固含量0.1％-1％添加。酶解条件：55-60℃，酶解6-8h，煮沸0.5h灭活。
8.(3)浓缩：单效浓缩，浓度20％-25％。
9.(4)干燥：喷雾干燥，进风温度180℃-200℃，出风温度70℃-90℃。
10.其中，步骤(1)所述骨渣为动物四肢骨骨渣；步骤(2)所述a酶活力单位为50-200万u/g，用量为0.1％-1％，其中最优的酶制剂为胰蛋白酶，用量0.5％，酶活力单位为100万u/g.
11.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
12.(1)本发明中所得酶解骨粉多肽分子量控制在200-5000道尔顿含量达75.0％以上，产品呈淡黄色粉末，产品气味清新，可直接服用，易于溶解，无膻味异味。
13.(2)本项目主要利用酶水解法促进骨骼中钙的转化，使骨钙充分分离出来，并与氨基酸作用生成可溶性氨基酸钙，能较好的促进机体对钙的利用。
14.(3)本发明工艺操作方法简单，原材料易于取材，制备过程中反应条件易于控制，生产成本相对低廉，适合工业化大规模生产。
具体实施方式
15.下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
16.实施例1一种酶解骨粉的制备方法
17.(1)预处理：用碎骨机将牛骨渣进行粉碎，过40目筛，用胶体磨研磨成浆，250目。
18.(2)酶处理：料液比1∶20，加入木瓜蛋白酶(酶活力单位为50万u/g)，按照固含量1.0％添加。酶解条件：55-60℃，酶解6h，煮沸0.5h灭活。
19.(3)浓缩：单效浓缩，浓度25％。
20.(4)干燥：喷雾干燥，进风温度180℃，出风温度75℃。
21.按以上工艺制得的酶解骨粉，呈淡黄色粉末、气味清新、无苦涩感。经取样、分析测试后，该酶解骨粉中多肽分子量控制在200-5000道尔顿达79.36％。
22.实施例2一种酶解骨粉的制备方法
23.(1)预处理：用碎骨机将羊骨渣进行粉碎，过20目筛，用胶体磨研磨成浆，200目。
24.(2)酶处理：料液比1∶20，加入胰蛋白酶(酶活力单位为100万u/g)，按照固含量0.8％添加。酶解条件：55-60℃，酶解6h，煮沸0.5h灭活。
25.(3)浓缩：单效浓缩，浓度20％。
26.(4)干燥：喷雾干燥，进风温度160℃，出风温度80℃。
27.按以上工艺制得的酶解骨粉，呈淡黄色粉末、气味清新、无苦涩感。经取样、分析测试后，该酶解骨粉中多肽分子量控制在200-5000道尔顿达82.59％。
28.实施例3一种酶解骨粉的制备方法
29.(1)预处理：用碎骨机将猪骨渣进行粉碎，过20目筛，用胶体磨研磨成浆，240目。
30.(2)酶处理：料液比1∶15，加入胃蛋白酶(酶活力单位为200万u/g)，按照固含量0.6％添加。酶解条件：55-60℃，酶解8h，煮沸0.5h灭活。
31.(3)浓缩：单效浓缩，浓度25％。
32.(4)干燥：喷雾干燥，进风温度170℃，出风温度85℃。
33.按以上工艺制得的酶解骨粉，呈淡黄色粉末、气味清新、无苦涩感。经取样、分析测试后，该酶解骨粉中多肽分子量控制在200-5000道尔顿达80.25％。
34.实施例4酶解骨粉对低钙大鼠的制备方法
35.1、实验动物
36.正常雄性sd大鼠60只，4周龄，体重(80
±
10)g，spf级，由中国食品药品检定研究院提供。许可证号：scxk(京)2017-0005。饲养温度为23
±
2℃，正常昼夜节律，保证充分的饮水
和进食，维持饲料饲养。
37.2、主要试剂与材料
38.药品和试剂：酶解骨粉(本发明制备方法所得)；碳酸钙(优级纯，石家庄西默科技有限公司)；水合氯醛(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；硝酸(优级纯，merck)。
39.试剂盒：钙(ca)测试盒、磷(pi)测试盒、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，alp)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tracp-5b)试剂盒(上海古朵生物技术公司)。
40.耗材：96孔板(南京建成生物工程研究所)；灌胃针(北京索莱宝科技有限公司)；一次性注射器(1ml和5ml)、手术器械(上海治宇医疗器械有限公司)等。
41.3、大鼠低钙模型构建及给药方案
42.3.1低钙饲料
43.酪蛋白10.0％，黄豆粉15.0％，小麦面粉54.0％，玉米油4.0％，纤维素2.0％，混合盐2.6％，混合维生素1.0％，氯化胆碱0.2％，d1-蛋氨酸0.2％，淀粉11.0％。
44.含钙量10～20ppm，购于北京互持生物科技有限公司。
45.3.2建模方法
46.4周龄健康雄性sd大鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组、低钙模型组、阳性药碳酸钙组、酶解磷骨粉低、中、高剂量组，每组10只。对照组饲以正常饲料，自由饮水，其余各组饲于低钙饲料，自由饮去离子水，进行6周饲养实验。
47.3.3药物与试剂配制
48.酶解磷骨粉混悬液的制备：分别将8g、16g、32g酶解磷骨粉粉末置于100ml去离子水中，继续加去离子水定容至400ml，配制成20、40、80mg/ml酶解磷骨粉混悬液(钙元素含量5、10、20mg/ml)。
49.碳酸钙混悬液的制备：将20g碳酸钙粉末置于100ml去离子水中，继续加去离子水定容至400ml，配制成50mg/ml碳酸钙混悬液(钙元素含量20mg/ml)。
50.3.4灌胃给药
51.第7周开始，连续4周对低、中、高剂量酶解磷骨粉组分别灌胃给予0.2、0.4、0.8g/kg酶解磷骨粉混悬液，阳性药组灌胃给予0.5mg/kg碳酸钙混悬液，低钙模型组和对照组大鼠灌胃给与等量去离子水，对照组饲以正常饲料，自由饮水，其余各组饲于低钙饲料，自由饮去离子水。
52.3.5钙代谢实验
53.灌胃给药最后3天进行钙代谢实验。将大鼠移入代谢笼，分笼喂养。记录3d进食量，收集72h粪便，80℃烘干，称重，记录粪便量。
54.3.6样本收集
55.末次给受试物后禁食24h，大鼠腹腔注射水合氯醛(0.3g/kg)，待大鼠麻醉后，剪开大鼠胸腔，从心尖部进针，穿刺进左心室，缓慢抽血，置于肝素化试管中，混匀，离心(4500r/min，10min，4℃)，分离血浆，-80℃冰箱中保存。心脏穿刺取血后，剪开大鼠腿部皮肤，将大鼠左右两侧股骨剥离干净，剔除胫骨上附着的肌肉组织和韧带，右股骨固定于组织固定液中，4℃保存；左股骨包裹于用生理盐水浸湿的纱布，-80℃冻存。
56.4、实验结果
57.4.1钙表观吸收率
58.大鼠的钙表观吸收率如表1所示。与对照组相比，模型组大鼠钙表观吸收率大幅度升高(p＜0.0001)。而相比模型组，酶解磷骨粉给药组大鼠的钙表观吸收率均有显著增加(p＜0.0001)，且随着给药剂量增加，大鼠体内的钙表观吸收率升高趋势渐缓。钙表观吸收率水平在高剂量组和阳性药组大鼠体内差异不显著。
59.表1钙表观吸收率
[0060][0061][0062]
4.2 he染色切片观察
[0063]
按照动物实验病理评价标准，对照组骨板厚度0.6mm，骨板轻度厚薄不一，骨细胞排列规整，骨基质轻微粘液变性，骨细胞无缺失，未见破骨细胞，骨母细胞无减少，骨小梁无减少和结构紊乱，骨髓腔无扩大，骨小梁占骨髓腔比例约40％。骨膜轻微增生，其内血管亦无增生。模型组骨板厚度0.3mm，骨板中度厚薄不一，骨细胞排列规整，骨基质中度粘液变性，骨细胞无缺失，未见破骨细胞，骨母细胞无减少，骨小梁重度减少和结构紊乱，骨髓腔重度扩大，骨小梁占骨髓腔比例约20％。骨膜中度增生，其内血管亦无增生。低剂量组骨板厚度0.35mm，骨板轻度厚薄不一，骨细胞排列规整，骨基质中度粘液变性，骨细胞无缺失，未见破骨细胞，骨母细胞无减少，骨小梁重度减少和结构紊乱，骨髓腔重度扩大，骨小梁占骨髓腔比例约20％。骨膜中度增生，其内血管亦无增生。中剂量组骨板厚度0.4mm，骨板中度厚薄不一，骨细胞排列规整，骨基质轻度粘液变性，骨细胞无缺失，未见破骨细胞，骨母细胞无减少，骨小梁轻度减少和结构紊乱，骨髓腔轻度扩大，骨小梁占骨髓腔比例约30％。骨膜中度增生，其内血管亦无增生。高剂量组骨板厚度0.5mm，骨板轻度厚薄不一，骨细胞排列规整，骨基质轻微粘液变性，骨细胞无缺失，未见破骨细胞，骨母细胞无减少，骨小梁无减少和结构紊乱，骨髓腔无扩大，骨小梁占骨髓腔比例约40％。骨膜中度增生，其内血管亦无增生。阳性药组骨板厚度0.45mm，骨板中度厚薄不一，骨细胞排列规整，骨基质轻度粘液变性，骨细胞无缺失，未见破骨细胞，骨母细胞无减少，骨小梁轻度减少和结构紊乱，骨髓腔轻度扩大，骨小梁占骨髓腔比例约30％。骨膜轻度增生，其内血管亦无增生。
[0064]
与对照组相比，模型组骨小梁显著减少且结构紊乱，骨髓腔明显扩大。低、中、高剂量组和阳性药组骨小梁结构变得更致密，骨髓腔面积减小。
[0065]
4.3骨密度、生物力学、干重、灰重以及骨钙骨磷含量测定
[0066]
实验选择大鼠股骨骨密度、生物力学(位移、斜率、强度)、干重灰重和骨钙骨磷作为补钙功效评价指标，测定结果如表2所示。对照组大鼠股骨骨密度为241.9
±
13g/cm2，模型组骨密度为199.5
±
28g/cm2。与对照组相比，模型组骨密度有显著的降低。低、中、高剂量组大鼠股骨骨密度分别为207.1
±
36、213.6
±
29、227.6
±
17g/cm2，与模型组相比有明显升
高，且随着剂量的增大，骨密度升高幅度越明显。其中高剂量组的大鼠股骨密度接近阳性药组。但每组之间的大鼠股骨生物力学指标没有显著的差异性。
[0067]
表2骨密度、生物力学指标检测
[0068][0069]
注：与对照组比较，
*
p＜0.05；与模型组比较，
#
p＜0.05
[0070]
大鼠股骨干重、灰重以及骨钙骨磷的测定结果如表3所示。与对照组相比，模型组大鼠股骨干重和灰重都有明显降低。相比模型组，酶解磷骨粉给药组大鼠的干重灰重均有升高，且随着给药剂量的提高有上升趋势。
[0071]
对照组大鼠骨钙、骨磷含量分别为382990
±
224和218141
±
77mg/g，模型组大鼠骨钙骨磷含量均有明显降低。酶解磷骨粉给药组大鼠骨钙骨磷含量则均有增加，其中低剂量给药组大鼠股骨钙磷含量升高最为显著，其含量和阳性药组相近。
[0072]
表3股骨干重、灰重及骨钙骨磷测定
[0073][0074]
4.4血液中钙、磷、alp、tracp-5b含量测定
[0075]
实验选择血钙、血磷、碱性磷酸酶(alp)和抗酒石酸酸性磷酸酶(tracp-5b)作为低钙大鼠补钙效果评价指标，检测结果如表4所示。与对照组相比，模型组大鼠体内的血液生化指标均没有显著性差异。低剂量组大鼠血浆钙含量表现出升高趋势，高剂量组大鼠血浆磷及alp水平升高较为明显，且高剂量大鼠血浆tracp-5b水平下降最为显著。
[0076]
表4血浆生化指标检测结果
[0077][0078]
注：与对照组比较，
*
p＜0.05；与模型组比较，
#
p＜0.05
[0079]
5、结论
[0080]
股骨经过灰化后的灰分主要由钙磷酸盐和其他矿物质组成。骨干灰重比反应了骨骼中有机质和无机盐的比例，其中钙和磷是无机盐中含量最高的代表性元素。骨骼中矿物质的含量是决定骨密度的因素之一，钙磷以羟磷灰钙的形式构成，增大骨密度。骨骼中钙与磷的比值大约为2∶1，并处于稳定状态。骨干灰重比越高，骨钙和骨磷含量越高，说明补钙剂的补钙效果越好。本实验结果表示，与低钙模型组相比，酶解磷骨粉组的骨干灰重以及骨钙骨磷含量均明显增加，且高剂量酶解磷骨粉组的增加幅度高于碳酸钙组，说明酶解磷骨粉能显著提高骨钙骨磷含量，补钙效果明显。
[0081]
钙经过肠道吸收后进入血液循环，少部分钙离子分布在血液、细胞外液、肌肉和其他组织器官中，大部分钙沉积于骨骼和牙齿中。骨骼是大型的循环钙池，在不断的形成和转换中维持动态平衡，转换的骨钙以补充血钙维持其浓度。血钙以离子钙、蛋白结合钙和小分子阴离子结合钙三种形式存在，其中只有离子钙有生理活性。血磷以无机磷酸盐的形式存在，血磷和血钙的浓度变化呈负相关，当血磷浓度增高时，血钙浓度降低，这与骨组织的钙化有关。alp是一种参与骨代谢的重要蛋白，可以通过分解磷酸酯中的无机磷促进基质矿化，是反映成骨细胞的重要标志。本实验结果表示，高剂量酶解磷骨粉组的血钙、血磷和alp含量显著增加，且增长幅度高于碳酸钙组，说明酶解磷骨粉能有效提高血浆中钙和磷的浓度，提高alp活性，并且补钙效果优于碳酸钙。
[0082]
综上，酶解磷骨粉对低钙大鼠具有效的补钙作用，不同剂量有一定程度的剂量依赖性，并且其效果优于碳酸钙，但其补钙机制还需深入研究。