双重响应性牛蒡纳米膳食纤维皮克林乳液及其制备方法

本发明涉及一种双重响应性牛蒡纳米膳食纤维皮克林乳液及其制备方法，属于食品加工技术领域。

背景技术：

皮克林乳液是固体颗粒稳定的乳液，与传统乳液相比，皮克林乳液的稳定性和生物相容性更高。更重要的是，利用固体颗粒的刺激响应行为，如剪切响应性、ph响应性、温度响应性、光响应性、磁响应性、多重响应性等制备对特定环境因素敏感的皮克林乳液，从而实现对包封芯材的释放控制，提高其生物利用度并促进活性功效的发挥，在食品和药学领域中的应用前景十分广阔。

专利cn104127335a公开了一种uv控释药用成分且易清洗的皮克林乳液型防晒霜的制备工艺。通过有机化学反应制备烷基硅烷稳定的tio2纳米颗粒，将其加入油相后与水相高速匀浆后获得w/o型乳液。在uv照射下，tio2纳米颗粒性质发生变化，导致破乳和水相中护肤成分的快速释放；专利201811541742.x公布了一种sio2@pnipam粒子稳定性皮克林乳液制备方法，利用高温条件下pnipam的构象转变，实现芯材的温敏性控释；在另外一项专利（201710381045.1）中，研究人员通过ugi缩合反应将海藻酸钠枝接在sio2表面，使其成为具备ph响应性的皮克林乳化剂，因此，通过改变环境ph可以有效控制海藻酸钠-sio2皮克林乳液中芯材的释放。

纳米纤维素是直径小于100nm的纤维聚集体，它们用于优良的机械性能、巨大的比表面积、高结晶度以及良好的生物相容性。此外，纳米纤维素表面存在大量的羟基，是开展化学、酶法改性的理想位点。目前，纳米纤维素可以用于保证皮克林乳液的稳定性，但是关于具备刺激响应性的纳米纤维素皮克林乳液鲜有报道。营养素和药物成分的缓释递送目前也没有良好的解决方案。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种双重响应性牛蒡纳米膳食纤维皮克林乳液及其制备方法，其具体技术方案如下：

一种双重响应性牛蒡纳米膳食纤维皮克林乳液的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：牛蒡不溶性膳食纤维的提取在超声条件下，打浆后的牛蒡切片依次用α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶分三步酶解除杂，

取新鲜牛蒡切片，放入开水中烫漂灭酶，取出灭酶后的牛蒡切片后按照料液质量比为1:4~1:10加入蒸馏水进行打浆，分别按低温α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的顺序在超声条件下对打浆后的牛蒡切片进行分步酶解除杂，每步酶解除杂后都用沸水浴灭酶处理，除杂好后进行离心，收集沉淀，用60~70℃的温水洗涤，接着用体积占比80%的乙醇洗涤，再次进行离心，收集沉淀，再在40~50℃的条件下烘干，得到牛蒡不溶性膳食纤维；

步骤2：牛蒡不溶性膳食纤维的羧甲基化改性

将步骤1中制得的牛蒡不溶性膳食纤维和体积占比50~80%的乙醇溶液按照料液比1：50（g/ml）混合并通过磁力搅拌均匀后加入牛蒡不溶性膳食纤维质量10~20%的氢氧化钠，在室温条件下反应完全后得到溶液a，将牛蒡不溶性膳食纤维质量20~40%的氢氧化钠和牛蒡不溶性膳食纤维质量40~60%的氯乙酸分散在质量为牛蒡不溶性膳食纤维质量20~40%的氢氧化钠和牛蒡不溶性膳食纤维质量40~60%的氯乙酸的总质量1~2倍的乙醇中，再加入溶液a中，在40~70^oc条件下进行醚化反应完全，将反应完的溶液冷却至室温，加入乙酸调至中性后离心得到残渣，用无水乙醇冲洗至无残留，再在40~50^oc条件下烘干，得到羧甲基化改性的牛蒡不溶性膳食纤维；

步骤3：高压微射流均质和超声破碎制备羧甲基化牛蒡纳米膳食纤维

将步骤2中得到的羧甲基化改性的牛蒡不溶性膳食纤维按照料液质量比为1:10~1:20与超纯水充分混合，在12000~18000psi的高压微射流均质条件下处理，将处理后的溶液在800~1200w条件下超声破碎，再离心去除沉淀，收集上清液并冻干，得到羧甲基化牛蒡纳米膳食纤维；

步骤4：采用原位共沉淀法制备fe3o4@bdnf纳米颗粒

将步骤3得到的羧甲基化牛蒡纳米膳食纤维分散于水中，使得浓度达到0.02~0.08wt%，加入七水硫酸亚铁溶液和六水三氯化铁溶液，使溶液中的fe²⁺和fe³⁺分别达到0.15mol/l和0.30mol/l；在持续搅拌状态下，再逐滴加入氢氧化铵，使氢氧化铵最终的浓度达到0.5mol/l，溶液中开始生成黑色沉淀至反应完全，用磁铁吸附分离fe3o4@bdnf纳米颗粒，并分别用水和乙醇清洗，再进行离心，收集沉淀后烘干；

步骤5：皮克林乳液的制备

将步骤4中得到的fe3o4@bdnf纳米颗粒在超声条件下均匀分散在水中并达到最终浓度为0.2~0.5wt%；取2~5倍体积的fe3o4@bdnf纳米颗粒溶液与油脂混合，使用高压均质机在12000rpm条件下处理形成乳液。

进一步的，所述步骤1中α-淀粉酶的加入牛蒡质量的0.15%，酶解温度为60℃，ph为4.5，超声功率为160w，超声酶解时间为40min；糖化酶的加入量为0.2%，酶解温度为60℃，ph为6.0，超声功率为200w，超声酶解时间为40min；木瓜蛋白酶的加入量为牛蒡质量的1%，酶解温度为50℃，ph为6.0，超声功率为160w，酶解超声时间为60min。

进一步的，所述步骤2中加入的乙醇溶液为体积比为60%的乙醇，加入的氢氧化钠质量分数为16%。

进一步的，所述步骤2为将步骤1中制得的牛蒡不溶性膳食纤维和60%的乙醇溶液按照料液比1：50混合并通过磁力搅拌均匀后加入牛蒡不溶性膳食纤维质量分数为16%的氢氧化钠，在室温条件下反应1h20min，得到溶液a1，将牛蒡不溶性膳食纤维质量分数35%的氢氧化钠和牛蒡不溶性膳食纤维质量分数50%的氯乙酸分散在质量为牛蒡不溶性膳食纤维质量分数35%的氢氧化钠和牛蒡不溶性膳食纤维质量分数50%的氯乙酸总质量1~2倍的乙醇中，再加入溶液a1中并在42^oc条件下进行反应。

进一步的，所述步骤3中将羧甲基化改性的牛蒡不溶性膳食纤维与超纯水充分混合后在16000pis的高压均质条件下处理3次，将处理后的溶液在800~1200w条件下超声破碎1.5h，离心条件为1000g下离心10min。

进一步的，所述步骤4中羧甲基化牛蒡纳米膳食纤维分散到水中的浓度为0.06wt%。

进一步的，所述步骤5中的油脂为液态油、固态油或两者混合，油脂中有固态油时，混合油脂在熔融状态下与fe3o4@bdnf纳米颗粒溶液混合并均质，再自然冷却至室温；油脂为非固态油脂时，在室温条件下制备乳液。

一种双重响应性牛蒡纳米膳食纤维皮克林乳液，由所述方法中任一方法制成。

本发明的有益效果是：本发明选择木质素含量低、半乳糖醛酸含量较高的牛蒡不溶性膳食纤维为原料，在温和条件下对其进行进一步的羧甲基化改性，提高分子中羟基含量和对ph的敏感性。在此基础上，合成fe3o4@bdnf纳米颗粒，通过高速匀浆制备刺激响应性的皮克林乳液，成本可控并且环境友好。本发明的乳液具备磁响应和ph响应性，从而起到对荷载功效性成分控释的效果。

附图说明

图1是本发明的技术路线流程图；

图2是实施例1中皮克林乳液对包封姜黄素的控释效果；

图3是实施例2中皮克林乳液对包封紫杉醇的控释效果。

具体实施方式

本发明的方法中，步骤1为使得牛蒡不溶性膳食纤维的提取在超声条件下，打浆后的牛蒡切片依次用α-淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶分三步酶解除杂，通过此步骤将原料中大部分杂质除净并得到牛蒡不溶性膳食纤维，为后续加工步骤做准备。

步骤2为将牛蒡不溶性膳食纤维进行羧甲基化改性，更有利于后续进行原位共沉淀法制备羧甲基化牛蒡纳米膳食纤维。在温和条件下对其进行进一步的羧甲基化改性，提高分子中羟基含量和对ph的敏感性。

步骤3为通过高压微射流均质和超声破碎制备羧甲基化牛蒡纳米膳食纤维，方便后续步骤制备纳米颗粒。

步骤4为采用原位共沉淀法制备fe3o4@bdnf纳米颗粒。纳米纤维素湿润性好，表面含有大量羧基和羟基。可以用于保证皮克林乳液的稳定性，利于后续的稳定乳液生成，利于营养素和药物成分的缓释递送。

步骤5为制备皮克林乳液，即本发明中的双重响应性牛蒡纳米膳食纤维皮克林乳液。通过高速匀浆制备刺激响应性的皮克林乳液，成本可控并且环境友好。具备磁响应和ph响应性，从而起到对荷载功效性成分控释的效果。制成的皮克林乳液通过改变环境ph可以有效控制皮克林乳液中不同芯材的释放。

下面用几个具体实施例来验证本发明所达到的技术效果：

实施例1

（1）牛蒡不溶性膳食纤维（idf）的提取制备

将新鲜牛蒡切成3~5mm的薄片后，在沸水中漂烫6s灭酶。随后加入5倍体积的蒸馏水，在果蔬打浆机中打碎备用；按照新鲜牛蒡质量的0.15%加入低温α-淀粉酶，在60℃、ph=4.5、超声功率160w条件下，酶解40min，沸水浴处理5min灭酶；按照新鲜牛蒡质量的0.2%加入糖化酶，在60℃、ph=6.0以及超声功率200w的条件下水解40min，沸水浴处理5min灭酶；按照新鲜牛蒡质量的1%加入木瓜蛋白酶，在酶解温度50℃、ph=6.0以及超声功率160w条件下超声酶解60min，沸水浴处理5min灭酶。将酶解液在5000g条件下离心，收集沉淀，用60~70℃的温水洗涤2次，再用80%的乙醇洗涤2~3次，5000g离心收集沉淀，40~50℃条件下烘干；

（2）牛蒡idf的羧甲基化改性

准确称取牛蒡idf，按照料液比1：50（g/ml）向其中加入60%浓度的乙醇溶液，并搅拌均匀；向上述溶液中加入idf质量16%的固体氢氧化钠，并搅拌至完全溶解，室温条件下反应80min；向上述碱化后的溶液加入idf质量35%的氢氧化钠，以及idf质量50%的乙酸溶解于少量乙醇中，加入上述反应液中，搅拌完全后，在42℃条件下进行醚化反应，反应4h；反应结束后，将溶液调至室温，用乙酸调至中性，产物在5000g条件下离心分离得到残渣，并用无水乙醇冲洗至无残留，40~50℃条件下烘干，得到羧甲基化改性的idf产品。

（3）羧甲基化牛蒡纳米膳食纤维的制备（burdockdietarynanofiber，bdnf）

将上述羧甲基化改性idf按照料液比1:15与超纯水充分混合，在16000pis高压均质条件下处理3次；将处理后的溶液在1000w条件下超声破碎1.5h，随后在1000g条件下离心10min去除沉淀，收集上清液并冻干，得到羧甲基化bdnf。

（4）fe3o4@bdnf纳米颗粒的制备

取上述羧甲基化的bdnf分散于水中，达到0.06wt%浓度，在超声作用下分散完全，然后，向上述溶液中滴加七水硫酸亚铁（fe3so4·7h2o）溶液和六水三氯化铁溶液（fecl3·6h2o），使溶液中的fe²⁺和fe³⁺分别达到0.15和0.30mol/l；在持续搅拌状态下，向混合溶液中逐滴加入氢氧化铵，使其最终浓度达到0.5m，此时溶液中开始生成黑色沉淀，反应12h后，用磁铁吸附分离fe3o4@bdnf纳米颗粒，并分别用水和乙醇清洗3次，离心收集后，在35℃中烘干。

（5）皮克林乳液的制备

取上述fe3o4@bdnf纳米颗粒，在超声条件下均匀分散在水中，达到最终浓度为0.5wt%；向90℃条件下预热熔融的三硬脂酸甘油酯/中链甘油三酯混合脂质（质量比1：2）中加入0.1%w/v的姜黄素，磁力搅拌条件下使其溶解完全；相同温度条件下将溶解姜黄素的玉米油与3倍体积的fe3o4@bdnf纳米颗粒混合，12,000rpm均质处理10min形成皮克林乳液，自然冷却至室温。

实施例2

（1）牛蒡idf的提取制备

将新鲜牛蒡切成3~5mm的薄片后，在沸水中漂烫6s灭酶。随后加入4倍体积的蒸馏水，在果蔬打浆机中打碎备用；按照新鲜牛蒡质量的0.15%加入低温α-淀粉酶，在60℃、ph4.5、超声功率160w条件下，酶解40min，沸水浴处理5min灭酶；按照新鲜牛蒡质量的0.2%加入糖化酶，在60℃、ph6.0以及超声功率200w的条件下水解40min，沸水浴处理5min灭酶；按照新鲜牛蒡质量的1%加入木瓜蛋白酶，在酶解温度50℃、ph6.0以及超声功率160w条件下超声酶解60min，沸水浴处理5min灭酶。将酶解液在5000g条件下离心，收集沉淀，用60~70℃的温水洗涤2次，再用80%的乙醇洗涤2~3次，5000g离心收集沉淀，40~50℃条件下烘干；

（2）牛蒡idf的羧甲基化改性

准确称取牛蒡idf，按照料液比1：50（g/ml）向其中加入70%浓度的乙醇溶液，并搅拌均匀；向上述溶液中加入idf质量16%的固体氢氧化钠，并搅拌至完全溶解，室温条件下反应80min；向上述碱化后的溶液加入idf质量35%的氢氧化钠，以及idf质量50%的乙酸溶解于少量乙醇中，加入上述反应液中，搅拌完全后，在42℃条件下进行醚化反应，反应4h；反应结束后，将溶液调至室温，用乙酸调至中性，产物在5000g条件下离心分离得到残渣，并用无水乙醇冲洗至无残留，40~50℃条件下烘干，得到羧甲基化改性的idf产品。

（3）牛蒡纳米膳食纤维的制备（burdockdietarynanofiber，bdnf）

将上述羧甲基化改性idf按照料液比1:20与超纯水充分混合，在高压均质条件下16000pis处理3次；将处理后的溶液在1200w条件下超声破碎1.5h，1000g条件下离心10min去除沉淀，收集上清液并冻干，得到羧甲基化bdnf。

（4）fe3o4@bdnf纳米颗粒的制备

取上述羧甲基化的bdnf分散于水中，达到0.06wt%的浓度，在超声作用下分散完全；然后，向上述溶液中加入七水硫酸亚铁（fe3o4·7h2o）溶液和六水三氯化铁溶液（fecl3·6h2o），使溶液中的fe²⁺和fe³⁺分别达到0.15和0.30mol/l；在持续搅拌状态下，向混合溶液中逐滴加入氢氧化铵，使其最终浓度达到0.5m，此时溶液中开始生成黑色沉淀，反应12h后，用磁铁吸附分离fe3o4@bdnf纳米颗粒，并分别用水和乙醇清洗3次，离心收集后，在35℃中烘干。

（5）皮克林乳液的制备

取上述fe3o4@bdnf纳米颗粒，在超声条件下均匀分散在水中，达到最终浓度为0.2%；向60℃条件下预热的玉米油中加入0.1%w/v的紫杉醇，磁力搅拌条件下使其溶解完全,并冷却至室温；室温条件下，将溶解紫杉醇的玉米油与9倍体积的fe3o4@bdnf纳米颗粒混合，12,000rpm均质处理10min形成皮克林乳液。

为验证乳液中活性成分的刺激响应性，开展了如下实验：

取实施例1中荷载姜黄素的fe3o4@bdnf纳米颗粒稳定皮克林乳液10ml，与等体积的ph=2.6的甘氨酸-盐酸冲液混合（150mm），密封于透析袋（截留分子量：3000da），在透析膜外侧加入相同的甘氨酸盐酸缓冲液200ml，并加入0.1%的吐温20。在摇床震荡条件下，每间隔特定时间取1ml透析液检测姜黄素的释放量，并补充相同体积的新鲜缓冲液；

取实施例1中的荷载姜黄素的fe3o4@bdnf纳米颗粒稳定皮克林乳液10ml，与等体积的ph=7.2的pbs缓冲液混合（150mm），密封于透析袋（截留分子量：3000da），在透析膜外侧加入相同的pbs缓冲液200ml，并加入0.1%的吐温80。在摇床震荡条件下，每间隔特定时间取1ml透析液检测姜黄素的释放量，并补充相同体积的新鲜缓冲液；

在上述试验的基础上，在反应容器的外侧铁壁放置磁铁，余下操作相同。

姜黄素释放率的计算公式为：

从图2可以看出，在ph=2.6条件下，皮克林乳液中的姜黄素释放率较低，48h后仅为20%左右，而在ph=7.0条件下，姜黄素在各检测时间点的释放率均显著高于ph=2.6条件下，在第48h时达到了35%左右，这与中性条件下纳米颗粒的水溶性增加、导致油滴表面的暴露有关；外加磁场后，磁力的吸引进一步加剧了纳米颗粒的解析附，在48h后，姜黄素的释放率在ph=2.6和ph=7.0条件下的释放率可以分别达到25%和60%左右。由此可知，使用本发明乳液的荷载姜黄素对于ph和磁场具备明显的双重响应性，ph和磁场均能影响。

为进一步验证乳液中活性成分的刺激响应性，开展了如下试验：

取实施例2中荷载紫杉醇的fe3o4@bdnf纳米颗粒稳定皮克林乳液10ml，与等体积的ph=2.6的甘氨酸-盐酸冲液混合（150mm），密封于透析袋（截留分子量：3000da），在透析膜外侧加入相同的甘氨酸盐酸缓冲液200ml，并加入0.1%的吐温80。在摇床震荡条件下，每间隔特定时间取1ml透析液检测紫杉醇的释放量，并补充相同体积的新鲜缓冲液；

取实施例2中的荷载紫杉醇的fe3o4@bdnf纳米颗粒稳定皮克林乳液10ml，与等体积的ph=7.2的pbs缓冲液混合（150mm），密封于透析袋（截留分子量：3000da），在透析膜外侧加入相同的pbs缓冲液200ml，并加入0.1%的吐温80。在摇床震荡条件下，每间隔特定时间取1ml透析液检测紫杉醇的释放量，并补充相同体积的新鲜缓冲液；

在上述试验的基础上，在反应容器的外侧铁壁放置磁铁，余下操作相同。

紫杉醇释放率的计算公式为：

从图3可以看出，在ph=2.6条件下，皮克林乳液中紫杉醇的释放率在50h内只能达到10%左右；当ph上升至7.0左右时，由于界面纳米颗粒的水溶性增强，油滴暴露，释放量相对于ph=2.6条件下提升3倍；外加磁场后，ph=2.6和7.0条件下的紫杉醇释放量又有不同幅度的升高，这与磁力吸引导致了界面纳米颗粒的解析附有关。从而通过本方法制得的皮克林乳液为营养素和药物成分的缓释递送提供了新的解决方案。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。