一种具有抑菌和抗病毒功能的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一种具有抑菌和抗病毒功能的枯草芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.目前饲料工业中应用最广、需求量最大的绿色饲料添加剂是生物酶制剂和微生态制剂。微生态制剂又名益生素、促生素、生菌剂以及活菌剂，是从自然界或动物上分离、鉴定或生物组建的有益微生物，经培养、发酵、干燥、加工等特殊工艺制成。微生态制剂能有效促进动物体调节肠道微生态平衡，增强机体免疫功能，并能高效转化饲料，改善生产性能。
3.由多种益生菌复合配制而成复合微生态制剂具有促进生长、调整正常菌群平衡、提高免疫力、提高饲料转化率等多种功效。1989年美国食品及药品管理局公布了可以用作饲料添加剂的微生物种类，共有如下４２种：米曲霉、黑曲霉、凝结芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜淀粉拟杆菌、多毛拟杆菌、栖瘤胃拟杆菌、产琥珀酸拟杆菌、青春双岐杆菌、动物双岐杆菌、两歧双岐杆菌、婴儿双岐杆菌、长双岐杆菌、嗜热双岐杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸乳杆菌、胚芽乳杆菌、罗氏乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸片球菌、啤酒片球菌、戊糖片球菌、费氏丙酸杆菌、谢氏丙酸杆菌、酿酒酵母、乳脂链球菌、双醋酸乳链球菌、粪链球菌、中链球菌、乳链球菌、嗜热链球菌。目前，应用于微生态制剂的菌种主要有乳酸杆菌、链球菌、双歧杆菌、酵母菌、某些芽孢杆菌等。
4.我国开始饲用微生态制剂的研究起步于20世纪70年代。1989年我国农业部公布了可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种12个，即干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪链球菌、乳链球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、乳酸片菌、沼泽红假单孢菌、啤酒酵母、产假丝酵母、曲霉。2001年又公布地衣芽孢杆菌为可直接使用的菌种。2013年公布的《饲料添加剂品种目录(2013)》中涉及动物养殖与饲料的微生物添加剂已增至30余种。
5.针对饲料微生态制品的研究也有大量公开报道，例如，齐情等观察微生态制剂对绿壳蛋鸡生产性能的作用效果，发现微生态制剂可以提高蛋鸡的产蛋率及蛋清浓度，蛋黄颜色没有明显变化；可以提高蛋鸡对粗纤维的分解能力；能够防治绿壳蛋鸡脂肪肝的发生。陈家祥等在肉鸡日粮中添加地衣芽孢杆菌后，结果发现肉鸡日增重显著提高。戴荣国报道，通过对断奶仔猪饲喂酵母菌、乳酸菌及芽孢杆菌复合微生态制剂，能在不同程度上对料重比、平均日增重及腹泻率有所改善。张红艳等研究报道，液体复合微生态制剂可提高断奶仔猪对饲料的利用率，平均日增重较对照组提高41.12%~51.78%。张双等试验结果说明，日粮中添加微生态制剂（100g/头）对奶牛热应激的预防和调节效果明显。高堂亮等研究微生态制剂对肉牛生长性能和血清生化指标的影响，分别饲喂全混合日粮和微生态制剂，结果表明，与对照组相比，平均日增重、平均日采食量显著提高（ｐ＜0.05），料重比显著降低（ｐ＜0.05），对血清生化指标没有显著影响（ｐ＞0.05）。
6.随着养殖业规模的扩大，饲料工业得到了迅猛发展。抗生素的滥用引起动物内源
性感染或继发二次感染，耐药菌株的产生，畜禽细胞免疫、体液免疫功能的下降，动物肠道菌群失调以及它们在畜禽产品中的残留等等。基于这些原因，很多国家反对将抗生素过量使用，甚至通过立法对愈来愈多的药物品种加以限制。随着人民对食品安全及畜牧产业的重视程度越来越高，微生态制剂势必会为我国畜牧行业带来良好的经济效益及广阔的发展前景。


技术实现要素：

7.本发明为解决现有技术问题，提供了一种新型枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis），并提供了该菌株在畜禽养殖中的应用。所述枯草芽孢杆菌能有效防控常见肠道致病菌和猪流行性腹泻病毒（pedv），提高饲料利用率，应用前景广泛。
8.本发明一方面提供了一株枯草芽孢杆菌db243（bacillus subtilis db243），已于2020年11月16日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2020742。
9.本发明另一方面提供了一种微生物制剂，包含上述枯草芽孢杆菌db243。
10.所述微生物制剂还包含地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、丁酸梭菌、屎肠球菌、乳酸菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中的任意一种或多种的组合。
11.所述微生物制剂为菌粉。
12.所述微生物制剂中枯草芽孢杆菌db243的活菌量不低于109cfu/g。
13.本发明还提供了一种饲料添加剂，包含上述微生物制剂。
14.所述饲料添加剂还包含酶制剂、中草药、乳化剂、多糖中的任意一种或多种的组合。
15.本发明还提供了所述饲料添加剂在畜禽养殖中的应用。
16.本发明所述枯草芽孢杆菌db243对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等多种病原菌均具有显著的抑菌效果，尤其是对k88大肠杆菌、o78大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径达到23mm，效果非常显著。该菌株还能有效抑制猪流行性腹泻病毒的复制，具有较强的抗病毒能力，与对照组相比，接种枯草芽孢杆菌db243上清液的实验组vero细胞的ct值提高了93.8%，病毒含量显著低于对照组。
17.枯草芽孢杆菌db243对人工胃肠液有很强的耐受性，在人工胃液中1h和2h后的存活率均为100%；在人工肠液中1h和2h后的存活率也均为100%。该菌株能够显著提高饲料利用率，改善仔猪生产性能，并能有效预防仔猪腹泻，提高仔猪的成活率。与对照组相比，饲喂枯草芽孢杆菌db243菌粉的实验组仔猪的平均日增重提高了22.5%，料肉比降低了15.4%；实验组仔猪的腹泻率和死淘率分别降低了59.9%和76.0%。
18.本发明提供的枯草芽孢杆菌db243可单独或与其他微生物、酶制剂、中草药、乳化剂、多糖类进行组合，作为饲料添加剂广泛应用于畜禽养殖，效果显著。
19.说明书附图图1为db243菌株的菌落形态图；图2 为db243菌株蛋白质谱峰图。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
21.本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。
22.实施例1 菌株的分离与筛选1、样品来源：山东省潍坊市高密养殖场猪的肠道粪便。
23.2、菌株分离与筛选：称取1g猪肠道粪便，置于9ml无菌生理盐水中，得到菌悬液；将菌悬液置于80℃水浴锅中，处理10min，取出，迅速冷却；将处理过菌悬液以10倍梯度稀释至合适浓度，取100ul于营养琼脂平板上，涂抹均匀，37℃培养16
‑
24h。挑取营养琼脂平板上已培养好的不同单菌落，进一步划线2次，挑取单菌落进行纯化培养。申请人挑选其中的5株菌，分别命名为a，b，c，d，e。
24.将5株菌株通过牛津杯法对大肠杆菌（k88、o1、o2、o78）进行平板抑菌试验；将vero细胞传代至96孔细胞培养板中，将5株菌液上清过滤器处理后，与猪流行性腹泻病毒等体积混合后接种至长满单层的细胞培养板中，孵育90分钟后弃去，换维持液继续培养24小时，冻融两次收毒后进行ct值的测定。具体结果见表1。
25.ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，病毒含量越多，荧光到达域值的循环数越少，即ct值越小，相反病毒含量越低，ct值越大。
26.表1 不同菌株抑菌圈及猪流行性腹泻病毒ct值测定结果菌株k88o1o2o78猪流行性腹泻病毒ct值a17.9mm19.6mm19.6mm20.3mm31.6b21.6mm20.5mm19.6mm18.5mm27.5c22.6mm21.2mm22.3mm23.4mm32.08d17.8mm17.3mm19.6mm18.5mm26.3e19.6mm19.6mm17.5mm19.6mm28.7从表1的结果可以看出，本发明筛选获得的c菌株的抗病毒效果最好，猪流行性腹泻病毒的含量最低（ct值最高）；同时，c菌株对大肠杆菌也具有较好的抑菌功效。
27.申请人将c菌株命名为db243，并对其作进一步评价。
28.实施例2 菌株的鉴定1、菌落形态鉴定db243菌株的菌落形态如图1所示：菌落呈微黄色，表面粗糙不透明，无粘液。
29.、16s rrna分子鉴定采用试剂盒提取菌株db243的dna。利用引物对其16s rrna进行扩增。 pcr体系包括：0.7μl 27f，0.7μl 1492r，4μl模板dna，17.5μl supermix 和12.1μl 水。pcr反应条件设置为：（1）94℃ 5min；（2）94℃预变性30s；（3）55℃ 30s；（4）72℃ 1min；执行步骤（2）至（4）35循环；（5）72℃ 10min。pcr产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测并测序得到该菌株16s rrna序列。经blast比对鉴定结果为枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）。
30.、maldi
‑
tof
‑
ms蛋白质谱鉴定
取少量db243单菌落以薄膜的形式涂布于靶板上；加1μl质谱样本预处理试剂盒中的裂解液，室温下自然晾干；加1μl质谱样本预处理试剂盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干；将样品靶放入质谱仪进行鉴定。结果如图2所示，经与蛋白质图谱库中标准菌株比对鉴定结果为枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）。
31.综上，利用16s rrna测序、maldi
‑
tof
‑
ms蛋白质谱等分子生物学手段对菌株db243进行鉴定，鉴定结果一致。再结合菌株db243的菌落形态特征，申请人确定该菌株为枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis），命名为枯草芽孢杆菌db243（bacillus subtilis db243）。
32.申请人已于2020年11月16日将上述枯草芽孢杆菌db243（bacillus subtilis db243）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2020742。
33.实施例3枯草芽孢杆菌db243的抑菌能力1、抑菌能力评价将枯草芽孢杆菌db243先在平板上培养，将培养好的枯草芽孢杆菌db243取1接种环接种到营养肉汤培养基中，37 ℃，220r/min培养14h，制备成供试菌液，菌量为108~109cfu/ml备用。
34.2、病原菌的准备将收集到的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等病原菌甘油管或斜面接种于营养肉汤培养基中，37℃，220r/min 培养 16~18h后备用。
35.取无菌平皿，倾注无菌营养琼脂培养基 18~20ml，使其在平皿内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层，将平板倒置平均划分区域并标记待添加物。另取适量无菌半固体营养琼脂培养基（琼脂含量为 1%），放冷至 48~50 ℃，每 50~100ml 培养基加入病原菌菌悬液 1~2ml，在每个平皿中分别加入5ml半固体营养琼脂培养基，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。放置在水平台上冷却后，在每 1 平皿中以等距离均匀安置牛津杯 4~6个。每个双层平皿中的牛津杯中分别滴装扩培好的枯草芽孢杆菌db243菌液0.2ml，37℃培养24h后，测量各抑菌圈直径，枯草芽孢杆菌db243对6种病原菌的抑菌效果如表2所示。
36.表2 枯草芽孢杆菌db243对不同病原菌的抑菌效果病原菌抑菌圈直径mm大肠杆菌k8823
±
1.0大肠杆菌o121
±
1.0大肠杆菌o221
±
1.0大肠杆菌o7823
±
1.0金黄色葡萄球菌23
±
1.0沙门氏菌22
±
1.0从表2的结果可以看出，本发明筛选到的枯草芽孢杆菌db243对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等多种病原菌均具有显著的抑菌效果，尤其是对k88大肠杆菌、o78大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径达到23mm，效果非常显著。
37.实施例4 枯草芽孢杆菌db243抗猪流行性腹泻病毒能力的评价1、供试菌液离心液的制备将枯草芽孢杆菌db243取1接种环接种到lb培养基中，37 ℃，220r/min培养48h，镜
检成孢率在90%以上，10000r/min离心5分钟，将db243离心液过0.22μm滤器备用。
38.2、vero细胞96孔板的制备将长势良好的t25瓶的vero细胞用胰酶消化后，经含10%胎牛血清的dmem吹散后接种到96孔细胞培养板中，37℃ 5%co2培养箱中培养24h。
39.3、枯草芽孢杆菌db243抗猪流行性腹泻病毒能力的评价将猪流行性腹泻病毒种毒用pbs稀释成100 tcid
50
/0.1 ml，与枯草芽孢杆菌db243离心液等体积混合后，取200μl加入到长满vero细胞的96孔细胞板中，同时设立猪流行性腹泻病毒与无菌水作为病毒对照组，置于37℃ 5%co2培养箱中孵育90min弃去，用pbs清洗后，换1%胎牛血清的dmem维持液，置于37℃ 5% co2培养箱中培养24h。反复冻融两次后，进行收毒，用针对猪流行性腹泻病毒（pedv）的荧光定量pcr试剂盒进行ct值的测定。
40.ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，病毒含量越多，荧光到达域值的循环数越少，即ct值越小，相反病毒含量越低，ct值越大。
41.表3 枯草芽孢杆菌db243抗猪流行性腹泻病毒能力的评价组别接种样品接种细胞接种条件ct值实验组菌液上清+猪流行性腹泻病毒vero细胞孵育90min32.07对照组无菌水+猪流行性腹泻病毒vero细胞孵育90min16.55从表3的结果可以看出，与对照组相比，接种枯草芽孢杆菌db243上清液的实验组vero细胞的ct值提高了93.8%，说明实验组vero细胞中病毒含量显著低于对照组。从而证实，本发明筛选到的枯草芽孢杆菌db243能够有效抑制猪流行性腹泻病毒的复制，具有较强的抗病毒能力。
42.实施例4枯草芽孢杆菌db243产酶能力评价1、供试菌液的制备将枯草芽孢杆菌db243先在平板上培养，将培养好的枯草芽孢杆菌db243取1接种环接种到lb培养基中，37 ℃，220r/min培养14h，制备成供试菌液备用。
43.2、枯草芽孢杆菌 db243产淀粉酶能力评价将培养好的枯草芽孢杆菌 db243的菌液接种到含有淀粉的琼脂培养基上，37℃培养48h，可以看到菌株db243周围有透明圈产生，透明圈直径为21 mm，枯草芽孢杆菌 db243可以产生一定的淀粉酶。
44.3、枯草芽孢杆菌 db243产蛋白酶能力评价将培养好的枯草芽孢杆菌 db243的菌液接种到含有脱脂奶粉的琼脂培养基上，37℃培养48h，可以看到菌株db243周围有透明圈产生，透明圈直径为22 mm，枯草芽孢杆菌 db243可以产生一定的蛋白酶。
45.实施例5 枯草芽孢杆菌db243对人工胃液、肠液的耐受性测试1、供试菌液的制备将枯草芽孢杆菌db243先在平板上培养，将培养好的枯草芽孢杆菌 db243取1接种环接种到lb培养基中，37 ℃，220r/min培养14h，分装于试管中，做为供试菌液。
46.2、胃液、肠液耐受性测定取一个含供试菌试管用盐酸溶液调整ph为2.5，加入胃蛋白酶使其终浓度为1%，模拟人工胃液；取一个含供试菌试管调整ph为7.2，加入胰蛋白酶使其终浓度为1%，模拟人工
肠液。37℃震荡培养，分别于1h和2h后取样，10倍比稀释后进行菌落计数，同时设立正常对照组，计算存活率（%）。
47.结果显示，本发明提供的枯草芽孢杆菌db234在人工胃液中1h和2h后的存活率均为100%；在人工肠液中1h和2h后的存活率也均为100%。从而表明枯草芽孢杆菌db243对人工胃肠液有很强的耐受性。
48.实施例6枯草芽孢杆菌db243对保育仔猪生长性能及腹泻率的影响1、试验地点：山东德州养殖场。
49.2、试验设计：试验选择生长情况正常、公母比例相同、体重接近、食欲良好的30日龄健康断奶仔猪120头，按照每组60头分为实验组与对照组，对照组饲喂基础日粮，实验组在基础日粮的基础上按照2公斤/吨添加枯草芽孢杆菌db243菌粉（109cfu/g），试验周期为20天，试验开始及结束清晨进行空腹称重，记录开始和期末的采食量，进行日增重、料肉比的计算，统计仔猪换料后仔猪腹泻的数量，计算腹泻率及死淘率。具体结果见表4。
50.3、试验结果表4 枯草芽孢杆菌db243对仔猪生产性能的影响分组平均日增重（g）料肉比腹泻率死淘率对照组492.71.698.33%6.67%实验组603.61.433.34%1.6%从表4的数据可以看出，与对照组相比，饲喂枯草芽孢杆菌db243菌粉的实验组仔猪的平均日增重提高了22.5%，料肉比降低了15.4%。从而说明枯草芽孢杆菌db243能够显著提高饲料利用率，改善仔猪的生产性能。
51.与对照组相比，饲喂枯草芽孢杆菌db243菌粉的实验组仔猪的腹泻率和死淘率分别降低了59.9%和76.0%。从而说明枯草芽孢杆菌db243能有效预防仔猪腹泻，提高仔猪的成活率。
52.综上所述，本发明提供的枯草芽孢杆菌db243能有效防控大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等常见肠道致病菌以及猪流行性腹泻病毒（pedv），同时能够促进消化，提高饲料利用率，进而提高养殖动物的生产性能。
53.枯草芽孢杆菌db243可单独或与其他微生物、酶制剂、中草药、乳化剂、多糖类进行组合，作为饲料添加剂广泛应用于畜禽养殖，效果显著。