一种淀粉基双负载功能纳米颗粒、其制备方法及应用

1.本发明涉及一种淀粉基双负载功能纳米颗粒、其制备方法及应用，属于农产品深加工技术领域。


背景技术：

2.蛋白质具有资源丰富、价格低廉、富含营养等特点，同时还具有某些生物活性，是蛋白基纳米输送载体的首选原料。但蛋白质多为球形蛋白结构，其疏水核心多被掩埋在紧凑的三级结构内部，不利其与疏水性活性物质结合。此外，不同蛋白源对其纳米材料形成机制及其功能也不同。通过生物酶法对蛋白质进行处理制备的多肽不仅具有蛋白所不具备的诸多生理活性(如抗氧化、抗高血压、抗菌等)，其水分散性也明显增加，在较宽的ph值范围内均可分散且稳定。同时，作为介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，多肽还具有生物两亲性。多肽中存在的疏水基团仍具有较高的反应活性，容易和疏水性活性因子发生相互作用，具有作为新型食品功能因子包埋载体的巨大潜力。
3.目前，研究人员提出了多种利用多肽制备功能纳米材料的方法。例如，其中一种较为常用的方法是ph驱动方法，其也称为ph循环或ph转移法，通常是指将系统的ph值从中性调节到极酸性或碱性条件，然后将ph值调回中性或使ph值达到中性的过程。通过混合极端酸性和碱性分散体，使最终系统接近中性，诱导分子发生结构变化并相互作用。cn112273654a公开了一种ph驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法，其制备的纳米颗粒具有稳定性好，荷载量高、生物相容性好等优点。但现有的多肽基功能纳米材料制备工艺在实施过程中往往需要涉及有机溶剂、化学处理和复杂的工艺和设备，成本高，难以推广应用，而且制备的产品大多功能单一，稳定性等也待改善。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的在于提供一种淀粉基双负载功能纳米颗粒、其制备方法及应用，以克服现有技术的不足。
5.为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
6.本发明实施例提供了一种淀粉基双负载功能纳米颗粒的制备方法，其包括：
7.(1)以蛋白酶对鸡蛋高密度脂蛋白进行限制性水解处理，之后利用透析以及乙醇沉淀法分离纯化获得多肽；
8.(2)使包含所述多肽及槲皮素的混合体系在碱性条件下进行自组装，形成胶束纳米颗粒；
9.(3)使包含所述胶束纳米颗粒及花青素的混合体系于碱性环境进行共价接枝反应，形成接枝物；
10.(4)使羧甲基糊精与所述接枝物复合，获得淀粉基双负载功能纳米颗粒。
11.在一些实施方式中，步骤(1)包括：采用胰蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶中的任一种或多种对鸡蛋高密度脂蛋白进行所述的限制性水解处理。在所述的限制性水解处理
完成后，将水解产物于0～4℃透析，透析时间为48h以上，采用的透析袋截留的分子为5000道尔顿以上，之后与乙醇混合，使混合物中乙醇的最终浓度为10～25％，离心后去除沉淀，将上清液冷冻干燥，于75～90℃烘箱处理5～20min，获得所述多肽。
12.在一些实施方式中，步骤(2)包括：将所述多肽及槲皮素分散于水中形成混合体系，并加入nacl调节混合体系的离子强度，之后调节该混合体系至碱性，并搅拌反应，使所述多肽与槲皮素自组装形成胶束纳米颗粒。
13.在一些实施方式中，步骤(3)包括：将所述胶束纳米颗粒的溶液与花青素溶液混合形成混合体系，并调节该混合体系至碱性，之后持续搅拌进行共价接枝反应，从而形成所述的接枝物。
14.在一些实施方式中，步骤(4)包括：将所述接枝物的溶液与羧甲基糊精的溶液搅拌混合，同时调节该混合体系至中性，从而获得淀粉基双负载功能纳米颗粒。
15.在一些实施方式中，所述羧甲基糊精采用取代度为0.3～0.7且均一的羧甲基糊精。
16.本发明实施例中通过使用胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶的任一种或多种限制性水解鸡蛋高密度脂蛋白，使其内部疏水基团暴露，并且形成了具有更好的溶解度、表面疏水性、乳化特性的多肽(命名为eht)，所述多肽可以在不同条件下自组装，并可以与槲皮素(que)在碱性条件下通过疏水相互作用结合，不涉及有机溶剂，简单安全；进而，由所述多肽与槲皮素复合形成的自组装槲皮素
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多肽复合胶束纳米颗粒(即前述胶束纳米颗粒，如下亦称que
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eht复合胶束纳米颗粒)可以与花青素(c3g)在碱性环境中共价接枝，过程简单环保，所获槲皮素
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多肽
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花青素接枝物(如下简称为que
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eht
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c3g接枝物)可以负载不同极性的生物活性物质，例如，所述槲皮素
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多肽
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花青素接枝物可以在中性条件下与羧甲基糊精(cmd)通过疏水相互作用复合，得到具有核壳结构的双负载功能的自组装胶体纳米颗粒(即前述淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒)。
17.本发明实施例还提供了由所述方法制备的淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒。
18.本发明实施例还提供了所述淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒在制备抗氧化递送系统或食品中的应用。
19.与现有技术相比，本发明提供的淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒制备工艺的原料均是天然来源的，无需任何有机试剂，仅需调节ph值即可获得性能良好自组装胶体纳米颗粒，工艺简单、高效、安全，易于规模化生产，并且所获淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒具有显著提高的抗环境应力稳定性和优异抗氧化活性，在营养物质的递送、生物活性物质的稳定等领域具有广泛用途。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1a是实施例1中一种鸡蛋高密度脂蛋白及多肽(eht)的sds－page测试图。
22.图1b是实施例1中一种鸡蛋高密度脂蛋白的水解度与水解时间的关系示意图。
23.图2a是实施例1中一种多肽eht在ph值＝7的条件下的溶解度测试图。
24.图2b是实施例1中一种多肽eht在ph值＝7的条件下的表面疏水性测试图。
25.图3a是实施例1中一种多肽eht在ph值＝7的条件下的临界胶束浓度测试图。
26.图3b是实施例1中一种多肽eht在ph值＝7的条件下的透射电镜(tem)图。
27.图4是实施例1中采用不同添加比例的羧甲基糊精时所获淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒的粒径变化图。
28.图5是实施例1中采用不同添加比例的羧甲基糊精时所获淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒的电位变化图。
29.图6是实施例1中淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒对槲皮素和花青素的负载效率的变化图。
30.图7是实施例1中一种淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒的槲皮素和花青素的dpph自由基清除率变化测试图。
31.图8是实施例1中一种淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒在储存14天过程中的槲皮素和花青素的保留率变化测试图。
具体实施方式
32.鉴于现有技术存在的技术问题，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。
33.本发明实施例的一个方面提供的一种淀粉基双负载功能纳米颗粒的制备方法包括：
34.(1)以蛋白酶对鸡蛋高密度脂蛋白(hdl)进行限制性水解处理，之后利用透析以及乙醇沉淀法分离纯化获得多肽；
35.(2)使包含所述多肽及槲皮素的混合体系在碱性条件下进行自组装，形成胶束纳米颗粒；
36.(3)使包含所述胶束纳米颗粒及花青素的混合体系于碱性环境进行共价接枝反应，形成接枝物；
37.(4)使羧甲基糊精与所述接枝物复合，获得淀粉基双负载功能纳米颗粒。
38.在一些实施方式中，步骤(1)包括：采用胰蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶中的任一种或多种对鸡蛋高密度脂蛋白进行所述的限制性水解处理，所述限制性水解处理的温度为30～55℃，时间为0.5～4.5h，水解反应体系的ph值为8.0～9.0，其中蛋白酶的添加量为20～100u/g鸡蛋高密度脂蛋白。
39.在一些实施方式中，步骤(1)还包括：在所述的限制性水解处理完成后，将水解产物于0～4℃透析，透析时间为48h以上，采用的透析袋截留的分子为5000道尔顿以上，之后与乙醇混合，使混合物中乙醇的最终浓度为10～25％，离心后去除沉淀，将上清液冷冻干燥，于75～90℃烘箱处理5～20min，获得所述多肽。
40.进一步的，所述透析的时间为48h以上，采用的透析袋截留的分子为5000道尔顿以上。
41.进一步的，将透析后所获产物与乙醇混合搅拌30min，再以4000g离心20分钟。
42.进一步的，步骤(1)中经所述限制性水解处理后，所获鸡蛋高密度脂蛋白水解物的
水解度为6.7％～10％。
43.进一步的，所述多肽的分子量为5～20kda。
44.在一些较为具体的实施方式中，eht可以采用如下方式制备：准确称取1g鸡蛋高密度脂蛋白，分散于20ml去离子水中，调节溶液ph值为8.0，置于37℃水浴锅中加热至温度恒定。加入一定量胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶(50u/g鸡蛋高密度脂蛋白)搅拌均匀；于37℃恒温水浴条件下水解处理0.5～4.5h，所述水解物的水解度为6.7％～10％，所述鸡蛋高密度脂蛋白水解物的分子量为5～10kda。进一步的，可以将水解产物于0～4℃透析48h，所用纤维素透析袋规格为5000道尔顿；将获得的水解产物和乙醇混合，离心后去除沉淀，将上清液冷冻干燥，于80℃烘箱中处理10min。
45.本发明中所采用的鸡蛋高密度脂蛋白(hdl)是鸡蛋中的第二大类脂蛋白，具有较高的蛋白含量以及优良的凝胶性。在本发明中，经所述的限制性水解处理后，hdl分子的大小、构象及分子间/内作用力发生改变，功能基团更好地暴露出来，溶解性、表面疏水性、乳化性等性质均有明显改善。
46.在一些实施方式中，步骤(2)包括：将所述多肽及槲皮素分散于水中形成混合体系，使其中多肽的浓度为10～50mg/ml，槲皮素与多肽的质量比为1:100～1:10，并加入nacl调节混合体系的离子强度为80～120mmol/l，之后调节该混合体系的ph值为10～12，并搅拌30～60min，使所述多肽与槲皮素自组装形成胶束纳米颗粒。
47.所述槲皮素是一种天然类黄酮，具有抗氧化、抗癌、抗炎和抗动脉粥样硬化的活性。然而，由于其水溶性低、化学不稳定和生物利用度差，其在许多食品中的广泛应用受到限制。在短时间强碱处理中，槲皮素可以去质子化，水溶性显著增加，降解可忽略不计。基于槲皮素的ph依赖性溶解度和多肽的自组装特性，可制备了负载槲皮素的多肽基自组装胶束纳米颗粒。
48.在一些实施方式中，步骤(3)包括：将所述胶束纳米颗粒的溶液与花青素溶液混合形成混合体系，并调节该混合体系的ph值为9.0～9.5，以300～600rpm的速度持续搅拌进行共价接枝反应，反应时间为20～30h，从而形成所述的接枝物。
49.进一步的，所述槲皮素与花青素的质量比为1:2～2：1。
50.在一些实施方式中，步骤(3)还包括：在所述的共价接枝反应完成后，调节反应混合物的ph值为中性，再于0～4℃透析20～24h，所述透析袋截留的分子为3500～4000道尔顿，获得所述的接枝物。
51.在一些较为具体的实施方式中，可以采用如下方式实现槲皮素
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多肽
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花青素接枝物的制备：将槲皮素粉末以及eht以质量比1:100～1:10分散于水中，其中eht的浓度为10～50mg/ml，并加入nacl调节混合体系的离子强度为80～120mmol/l，再调节ph值为12，搅拌混合30～60min。加入一定质量的花青素粉末于上述混合溶液中，使槲皮素和花青素的质量比为1:2～2：1。调节溶液的ph值为9.0，以500rpm的转速搅拌反应24h；使用1m hcl溶液调节所述混合液的ph值为7。在所述改性处理完成后，将反应体系透析20～24h，所述透析袋截留的分子为3500～4000道尔顿。
52.花青素存在于一大类天然植物中，被认为是一种理想的天然着色剂，并且可以提供多种健康益处，例如抗氧化、抗癌,抗突变和抗炎效果。然而，天然花青素的利用仍受一些物理和化学因素的限制，例如ph值、温度等。本发明通过将花青素与多肽共价结合可以增加
其物理稳定性，抗氧化活性和生物利用度。
53.在一些实施方式中，步骤(4)包括：将所述接枝物的溶液与羧甲基糊精的溶液搅拌混合，同时加入酸性溶液，以调节该混合体系至中性，从而获得淀粉基双负载功能纳米颗粒。
54.进一步的，所述多肽与羧甲基糊精的质量比为4：1～1：4。
55.在一些较为具体的实施方式中，可以将包含槲皮素
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多肽
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花青素接枝物的溶液体系与羧甲基糊精溶液混合，其中多肽与羧甲基糊精的质量比为4：1～1：4，边搅拌边滴加hcl溶液调节所获混合溶液的ph值至7，冷冻干燥即可获得具有核壳结构的淀粉基双负载功能纳米颗粒。
56.本发明通过在中性条件下使带负电的羧甲基糊精分子经疏水相互作用与槲皮素
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多肽
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花青素接枝物结合，形成具有核壳结构的淀粉基双负载功能纳米颗粒。外部羧甲基糊精层可以增强纳米粒子的刚性，且多糖侧链可以为复合颗粒提供更大空间位阻，增强颗粒的稳定性及对包埋生物活性成分的保护作用。
57.在一些实施方式中，所述羧甲基糊精的制备方法包括：
58.在35～40℃对聚合度均一的糊精进行碱化反应3～5h，获得碱化糊精；
59.在ph值为6.5～7.5的条件下，使包含质量比为1:0.3～1的所述碱化糊精和一氯乙酸的混合体系于40～45℃进行醚化反应4～6h，获得取代度为0.3～0.7且均一的羧甲基糊精。
60.在一些实施方式中，所述聚合度均一的糊精的制备方法包括：
61.将大米淀粉分散于ph值为5.5的磷酸缓冲液中，加热糊化冷却至50～55℃，之后加入普鲁兰酶进行脱支处理20～24h，所述普鲁兰酶的添加量为50～100u/g大米淀粉，其后对所获脱支处理产物于30～60℃进行水浴处理，之后采用乙醇逐步沉淀法对所获水浴处理产物进行分级，获得聚合度均一的糊精，所述糊精的聚合度为60～80。
62.在一些较为具体的实施方式中，羧甲基糊精可以通过如下方式制备：
63.使10g大米淀粉分散于200ml ph值5.5的磷酸缓冲液中，加热糊化1h后冷却至50～55℃，之后加入50u/g大米淀粉普鲁兰酶，进行脱枝处理20～24h，对所获产物于30～60℃进行水浴处理，再采用乙醇逐步沉淀法对水浴处理所获产物进行分级，获得聚合度均一的糊精；
64.于35～40℃对聚合度均一的糊精进行碱化反应3～5h，之后在ph值为6.5～7.5的条件下，使包含所述糊精和一氯乙酸投料比为1:0.3～1，且混合体系于40～45℃进行醚化反应4～6h，获得取代度高且均一的羧甲基糊精，将其烘干后于干燥器中保存。
65.本发明中通过简单地将多肽eht和槲皮素在ph值＝12的条件下溶解后复合，并加入nacl调节混合体系的离子强度以促进多肽自组装，并重新调节至ph值＝9，再使所获复合物与花青素在碱性条件下共价接枝，之后调节至ph值＝7，其后使接枝后的复合颗粒与羧甲基糊精通过疏水相互作用复合形成具有核壳结构的淀粉基双负载功能纳米颗粒，整个过程不涉及有机溶剂、化学处理或复杂的工艺和设备。并且，本发明中采用双负载技术在复合系统中实现对两种不同极性成分的生物活性成分运载，分子性质不同的成分可以分布在复合颗粒的核壳体系各个区域，形成层级结构，具有对每个活性成分的保护和释放作用，增强成分之间的生物稳定性，同时通过将不同的生物活性化合物复合，还可以使之产生协同效应，
从而达成更有效地促进健康的目的。
66.在本发明的一个较为具体的实施方案中，一种淀粉基双负载功能纳米颗粒是基于ph驱动方法实现的，包括如下步骤：
67.(1)采用胰蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶中的任一种或多种对鸡蛋高密度脂蛋白进行限制性水解处理形成具有特定分子量的多肽eht，其中水解(酶解)反应的温度为37℃，水解处理时间为0.5～4.5h(优选为3.5h)，酶解反应体系ph值＝8.0～9.0(优选为8.0)，之后可以将水解产物于0～4℃透析48h，所用纤维素透析袋规格为5000道尔顿，将获得的水解产物和乙醇混合，离心后去除沉淀，将上清液冷冻干燥，再于80℃烘箱中处理10min；所获鸡蛋高密度脂蛋白水解物(即eht)的水解度为6.7％～10％，分子量为5～20kda，
68.(2)将eht、槲皮素粉末分散于水中，并加入nacl调节混合体系的离子强度为80～120mmol/l；使eht浓度为10～50mg/ml(优选为20mg/ml)，槲皮素粉末与eht的质量比为1:100～1:10(优选为1:10)，并可以使用naoh溶液调节混合体系的ph值为10.0～12.0(优选为ph值＝12)，在此条件下持续搅拌进行自组装形成槲皮素
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多肽胶束纳米颗粒；
69.(3)将槲皮素
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多肽胶束纳米颗粒的溶液与花青素溶液混合并于ph值＝9.0～9.5(优选为ph值＝9.0)的碱性环境持续搅拌进行共价接枝反应20～30h(优选为24h)，形成槲皮素
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多肽
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花青素接枝物，其中槲皮素和花青素的质量比为1:2～21(优选为1:1)，之后可以采用边搅拌混合溶液边滴加hcl溶液的方式调节所获混合液的ph值＝7，在所述改性处理完成后，再将所获反应混合物透析20～24h，所述透析袋截留的分子为3500～4000道尔顿；
70.(4)使羧甲基糊精通过疏水相互作用与槲皮素
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多肽
‑
花青素接枝物复合，获得淀粉基双负载功能纳米颗粒。具体的，可以将槲皮素
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多肽
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花青素接枝物的溶液与羧甲基糊精溶液混合，边搅拌边滴加hcl溶液调节混合溶液的ph值＝7，使槲皮素
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多肽
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花青素接枝物与羧甲基糊精复合，其中多肽与羧甲基糊精的质量比为4：1～1：4(优选为1：1)。
71.进一步地，步骤(1)中鸡蛋高密度脂蛋白在水解反应体系中的浓度为5wt％。所述胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶的添加量为20～100u/g鸡蛋高密度脂蛋白，优选为50u/g鸡蛋高密度脂蛋白。
72.进一步地，步骤(2)所述的持续搅拌是指以300～600rpm的速度搅拌30～60min，优选为在500rpm搅拌30min。
73.进一步地，步骤(3)采用的搅拌转速为300～600rpm，优选为300rpm。
74.进一步地，步骤(4)还包括：
75.i、将大米淀粉分散于ph值为5～6的磷酸缓冲液中形成质量百分比浓度为5％左右的大米淀粉分散液，加热糊化1h后冷却至50～55℃，之后加入普鲁兰酶，进行脱支处理20～24h，对所获产物于30～60℃进行水浴处理，再采用乙醇逐步沉淀法(乙醇:水＝1:2～2:1，体积比)对水浴处理所获产物进行分级，获得聚合度均一的糊精；优选的，磷酸缓冲液ph为5.5；优选的，普鲁兰酶添加量为50～100u/g大米淀粉，更优选为50u/g大米淀粉；优选的，所述糊精的聚合度为60～80，更优选为65～80。
76.ii、于35～40℃(优选为40℃)对聚合度均一的糊精进行碱化反应3～5h，其中naoh添加量优选为0.6g/g糊精，反应时间优选为4h，之后在ph值为6.5～7.5的条件下，使所述糊精和一氯乙酸投料比为1:0.3～1(优选为1:0.6)，且混合体系于40～45℃进行醚化反应4～
6h(优选为4h)，获得取代度高且均一的羧甲基糊精(cmd)；优选的，所述cmd中一氯乙酸的取代度为0.3～0.7。
77.本发明实施例的另一个方面提供了由所述方法制备的淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒，其具有纳米级粒径，易转运吸收，提高疏水性生物活性物质吸收效率，兼具较高的抗氧化活性、抗环境应力(ph、离子强度)稳定性等优点。
78.进一步的，所述淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒为球形并具有核壳结构，粒径为189～259nm，ζ
‑
电位绝对值为26.1～35.2mv。
79.进一步的，所述淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒中槲皮素的包封效率可以达到95.83％，花青素的包封效率可高达90.95％。
80.本发明实施例的另一个方面提供了所述淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒在制备抗氧化递送系统或食品中的应用。
81.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。所述原料如无特殊说明，均为能从商业途径获得的产品。所述测试方法均为常规方法。
82.如下实施例所用的鸡蛋高密度脂蛋白主要通过如下方法获得：
83.将新鲜的鸡蛋打破，将蛋清与蛋黄分离，在滤纸上滚动蛋黄以除去蛋清蛋白，用刀片破坏卵黄膜，并将卵黄汇集在烧杯中。然后将等体积的氯化钠溶液(0.17m)添加到蛋黄中，并将混合物搅拌1h，然后在10,000g下于4℃离心45分钟，获取上清液和沉淀。将沉淀用0.17m nacl溶液洗涤3次。将洗涤的沉淀糊状物重新溶解在0.2m nacl溶液中，然后通过添加硫酸铵溶液(15％，w/v)搅拌，并沉降30分钟之后，4℃下以10,000g离心15分钟。使用8kda截止膜将其上清液对蒸馏水透析过夜，在头四个小时内每小时更换一次蒸馏水，以消除氯化钠和硫酸铵。然后将脱盐溶液在4℃下以10,000g离心30分钟。离心后沉淀则富含鸡蛋高密度脂蛋白。使用冷冻干燥机将鸡蛋高密度脂蛋白冷冻干燥脱水后保存在干燥器中。
84.槲皮素包封效率(％)＝(离心后上清液中的槲皮素含量/总的槲皮素含量)
×
100；
85.花青素包封效率(％)＝(离心后上清液中的花青素含量/总的花青素含量)
×
100。
86.以下通过若干实施例及附图并进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。
87.实施例1一种淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
88.(1)鸡蛋高密度脂蛋白多肽eht的制备
89.准确称取1g鸡蛋高密度脂蛋白，分散于20ml去离子水中，调节溶液ph值为8.0，置于37℃水浴锅中加热至温度恒定。加入胰蛋白酶(50u/g鸡蛋高密度脂蛋白)搅拌均匀；于37℃恒温水浴条件下水解处理一定时间，将水解产物于0～4℃透析48h，所用纤维素透析袋规格约为5000道尔顿，将获得的水解产物和乙醇混合，使其中乙醇最终浓度为20％，4000g离心20min后去除沉淀，将上清液冷冻干燥，冻干的多肽于80℃烘箱中处理10min。
90.请参阅图1a～图1b所示，泳道1～7分别代表蛋白质marker，高密度脂蛋白(hdl)，胰蛋白酶水解0.5h(胰0.5)、1.5h(胰1.5)、2.5h(胰2.5)、3.5h(胰3.5)、4.5h(胰4.5)后水解产物的分子量分布。随着水解时间的增加，eht分子量逐渐降低，水解度逐渐升高。
91.再请参阅图2a～图2b所示分别为具有不同水解时间的eht在ph值为7的溶解度。从图2a中可以看出，本实施例中eht较之鸡蛋高密度脂蛋白，溶解度显著增加，且随着水解时间的增加而呈现先增加后降低的趋势，在水解3.5h后达到最大溶解度。图2b中可以看出，本
实施例中eht较之鸡蛋高密度脂蛋白，表面疏水性显著增加，且随着水解时间的增加而呈现先增加后降低的趋势，在水解1.5h后达到最大表面疏水性。由于经胰蛋白酶水解，鸡蛋高密度脂蛋白分子量降低，结构趋于松散，导致分子间作用力降低，其溶解度有所提高，由于内部疏水基团暴露，表面疏水性显著增加。
92.请参阅图3a所示为经过胰蛋白酶水解3.5h后eht在不同浓度下的荧光强度关系曲线，在浓度高于0.3mg/ml时，eht可自组装形成球状胶束纳米颗粒。图3b所示为经过胰蛋白酶水解3.5h后eht在ph值7的透射电镜图像，由此可进一步证实eht可以自组装形成球状胶束纳米颗粒。
93.(2)槲皮素
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多肽
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花青素接枝物的制备
94.将槲皮素粉末以及eht以质量比1:50分散于水中，使其中eht的浓度为50mg/ml，并加入nacl调节体系的离子强度100mmol/l，再调节ph值为12，搅拌混合30min。加入一定质量的花青素粉末于上述混合溶液中，使槲皮素和花青素的质量比为1:2。调节溶液的ph值为9.0，以500rpm的转速搅拌反应24h；使用1m hcl溶液调节所述混合液的ph值为7。在所述改性处理完成后，将反应体系透析24h左右，所述透析袋截留的分子为3500～4000道尔顿。
95.(3)羧甲基糊精的制备：将10g大米淀粉分散于200ml ph值5.5的磷酸缓冲液中，加热糊化1h后冷却至50℃左右，之后加入50u/g大米淀粉的普鲁兰酶，进行脱枝处理24h左右，对所获产物于60℃进行水浴处理，再采用乙醇逐步沉淀法对水浴处理所获产物进行分级，乙醇与水的体积比为1:1，获得聚合度均一的糊精。于35℃左右对聚合度均一的糊精进行碱化反应3h，之后在ph值为7.5的条件下，使包含所述糊精和一氯乙酸投料比为1:0.6，且混合体系于40℃进行醚化反应4h，获得取代度高且均一的羧甲基糊精，将其烘干后于干燥器中保存。
96.(4)包含槲皮素
‑
多肽
‑
花青素接枝物的溶液体系与羧甲基糊精溶液混合，其中多肽与羧甲基糊精质量比为4：1～1：4。边搅拌边滴加hcl溶液调节上述混合溶液的ph值至7，冷冻干燥即可获得具有核壳结构的淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒。
97.请参阅图4所示为eht及不同eht：羧甲基糊精质量比下淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒的粒径。从图4中可以看出，在加入槲皮素后，槲皮素复合纳米颗粒粒径增加，证明eht成功负载槲皮素。与花青素共价接枝后，槲皮素
‑
多肽
‑
花青素接枝物粒径略有增加。随着羧甲基糊精添加比例的增加，淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒的粒径显著增加。
98.请参阅图5所示为eht及不同eht：羧甲基糊精质量比下淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒的电位。从图5中可以看出，在加入槲皮素后，槲皮素复合纳米颗粒电位没有明显变化，可能归因于槲皮素是包封在eht自组装形成球状胶束纳米颗粒的内部疏水区域。与花青素共价接枝后，槲皮素
‑
多肽
‑
花青素接枝物电位略有增加。随着羧甲基糊精添加比例的增加，带有更多负电荷的羧甲基糊精吸附在颗粒表面，淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒的电位显著增加。
99.请参阅图6所示为本实施例中淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒对槲皮素和花青素的负载效率的变化图。从图6中可以看出，在同时包埋槲皮素与花青素时，包封效率会有所增加。在加入不同比例的羧甲基糊精后，包封效率进一步增加，在eht与羧甲基糊精质量比1：1时具有最大包封效率。
100.请参阅图7所示为本实施例中淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒的槲皮素和花青素
的dpph自由基清除率的变化情况。从图7中可以看出，eht具有较低的dpph自由基清除率，较低的抗氧化活性。在包埋负载槲皮素和花青素后，dpph自由基清除率显著增加。在加入不同比例的羧甲基糊精后，由于包封效率进一步增加，包埋负载槲皮素和花青素的含量增加，具有更高抗氧化活性。
101.请参阅图8所示为本实施例中储存14天过程中淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒(eht：羧甲基糊精质量比为1:1)的槲皮素和花青素的保留率变化情况。从图8中可以看出，单独的槲皮素和花青素在环境中易于降解，在储存14天后，仅可保留20％左右。在槲皮素和花青素被eht包埋后，保留率有显著增加，可分别保留56.9％及44.5％。在槲皮素和花青素同时被包埋于淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒(eht：羧甲基糊精质量比为1:1)后，保留率有显著增加，可分别保留81.9％及74.9％。保留率的显著增加证明淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒可以有效地保护槲皮素和花青素免于降解。
102.实施例2一种淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
103.(1)鸡蛋高密度脂蛋白多肽eht的制备
104.准确称取1g鸡蛋高密度脂蛋白分散于20ml去离子水中，调节溶液ph值为8.0，置于37℃水浴锅中加热至温度恒定。加入一定量中性蛋白酶(20u/g鸡蛋高密度脂蛋白)搅拌均匀；于37℃恒温水浴条件下水解处理3.5h，将水解产物于0～4℃透析48h，所用纤维素透析袋规格为5000道尔顿，将获得的水解产物和乙醇混合，使其中乙醇最终浓度为10％，4000g离心20min后去除沉淀，将上清液冷冻干燥，冻干的多肽于80℃烘箱中处理10min。
105.(2)槲皮素
‑
多肽
‑
花青素接枝物的制备
106.将槲皮素粉末以及鸡蛋eht以质量比1:20分散于水中，其中eht的浓度为50mg/ml，并加入nacl调节体系的离子强度为80mmol/l，再调节ph值为12，搅拌混合30min。加入一定质量的花青素粉末于上述混合溶液中，使槲皮素和花青素的质量比为1:1。调节溶液的ph值为9.0，以500rpm的转速搅拌反应24h；使用1m hcl溶液调节所述混合液的ph值为7。在所述改性处理完成后，将反应体系透析20～24h。
107.(3)羧甲基糊精的制备：使10g大米淀粉分散于200ml ph值5.5的磷酸缓冲液中，加热糊化1h后冷却至55℃左右，之后加入50u/g大米淀粉普鲁兰酶，进行脱枝处理20～24h，对所获产物于60℃进行水浴处理，再采用乙醇逐步沉淀法对水浴处理所获产物进行分级，乙醇与水的体积比为2:1，获得聚合度均一的糊精。于40℃左右对聚合度均一的糊精进行碱化反应5h，之后在ph值为7.5的条件下，使包含所述糊精和一氯乙酸投料比为1:0.5，且混合体系于45℃进行醚化反应5h，获得取代度高且均一的羧甲基糊精，将其烘干后于干燥器中保存。
108.(4)包含槲皮素
‑
多肽
‑
花青素接枝物的溶液体系与羧甲基糊精溶液混合，其中多肽与羧甲基糊精质量比为1:1。边搅拌边滴加hcl溶液调节上述混合溶液的ph值至7，冷冻干燥即可获得具有核壳结构的淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒。
109.实施例3一种淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
110.(1)鸡蛋高密度脂蛋白多肽eht的制备
111.准确称取1g鸡蛋高密度脂蛋白，分散于20ml去离子水中，调节溶液ph值为8.0，置于37℃水浴锅中加热至温度恒定。加入一定量碱性蛋白酶(100u/g鸡蛋高密度脂蛋白)搅拌均匀；于37℃恒温水浴条件下水解处理2.5h，将水解产物于0～4℃透析48h，所用纤维素透
析袋规格为5000道尔顿，将获得的水解产物和乙醇混合，使其中乙醇最终浓度为25％，4000g离心20min后去除沉淀，将上清液冷冻干燥，冻干的多肽于80℃烘箱中处理10min。
112.(2)槲皮素
‑
多肽
‑
花青素接枝物的制备
113.将槲皮素粉末以及鸡蛋eht以质量比1:10分散于水中，使其中eht的浓度为20mg/ml，再加入nacl调节体系的离子强度120mmol/l，并调节ph值为12，搅拌混合30min。加入一定质量的花青素粉末于上述混合溶液中，使槲皮素和花青素的质量比为1:1。调节溶液的ph值为9.0，以500rpm的转速搅拌反应30h；使用1m hcl溶液调节所述混合液的ph值为7。在所述改性处理完成后，将反应体系透析24h。
114.(3)羧甲基糊精的制备：使10g大米淀粉分散于200ml ph值5.5的磷酸缓冲液中，加热糊化1h后冷却至52℃左右，之后加入100u/g大米淀粉普鲁兰酶，进行脱枝处理20h，对所获产物于60℃进行水浴处理，再采用乙醇逐步沉淀法对水浴处理所获产物进行分级，乙醇与水的体积比为1:1，获得聚合度均一的糊精。于38℃左右对聚合度均一的糊精进行碱化反应5h，之后在ph值为7的条件下，使包含所述糊精和一氯乙酸投料比为1:0.6，且混合体系于45℃进行醚化反应6h，获得取代度高且均一的羧甲基糊精，将其烘干后于干燥器中保存。
115.(4)包含槲皮素
‑
多肽
‑
花青素接枝物的溶液体系与羧甲基糊精溶液混合，其中槲皮素
‑
鸡蛋多肽
‑
花青素接枝物与羧甲基糊精质量比为1:1。边搅拌边滴加hcl溶液调节上述混合溶液的ph值至7，冷冻干燥即可获得具有核壳结构的淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒。
116.对比例1：该对比例1提供的一种淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒的制备方法与实施例1基本相同(多肽与羧甲基糊精质量比为1:1)，区别在于：步骤(1)的胰蛋白酶添加量为10u/g鸡蛋高密度脂蛋白。
117.该对比例中基本没有能形成淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒，其原因可能在于：所获多肽水解度不足，蛋白质分子量较高，致密的核心结构仍然存在，内部疏水基团暴露不足，多肽无法实现亲水
‑
亲油平衡，不能有效自组装成胶束纳米颗粒，进而对于疏水性生物活性成分槲皮素的包封效率显著降低。
118.对比例2：该对比例1提供的一种淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒的制备方法与实施例2基本相同(多肽与羧甲基糊精质量比为1:1)，区别在于：步骤(1)的胰蛋白酶添加量为150u/g鸡蛋高密度脂蛋白。
119.该对比例中也基本没有能形成稳定的淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒，其原因可能在于：所获多肽水解度过高，产生大量具有较小分子量的多肽，内部疏水基团暴露。小分子量的多肽之间由于较强的疏水相互作用重新聚集，造成疏水基团重新掩埋在聚集体内部，且溶解度有所降低，不利于多肽实现亲水
‑
亲油平衡，进而对其自组装成胶束纳米颗粒的能力有负面影响，对于槲皮素的包封效率也显著降低，不利于双负载功能淀粉基胶体纳米颗粒的形成。小分子多肽的重新聚集同样不利于羧甲基糊精通过疏水相互作用与多肽复合，不能有效利用多糖的侧链为淀粉基胶体纳米颗粒提供空间位阻作用，不利于淀粉基胶体纳米颗粒的稳定性。
120.对比例3：该对比例3提供的一种淀粉基胶体纳米颗粒的制备方法与实施例1基本相同，区别在于：
121.步骤(2)包括：将鸡蛋分散于水中，使鸡蛋eht的浓度为20mg/ml，调节ph值为12，搅拌30min，再加入花青素粉末，使花青素与鸡蛋eht的质量比为1:1。调节溶液的ph值为9.0，
以500rpm的转速搅拌反应30h；使用1m hcl溶液调节所述混合液的ph值为7，之后将反应体系透析24h。
122.该对比例所获产品的粒径比实施例1的相应产品有明显减小，且dpph自由基清除率也明显降低。
123.对比例4：该对比例4提供的一种淀粉基胶体纳米颗粒的制备方法与实施例1基本相同，区别在于：
124.步骤(2)包括：将槲皮素粉末以及鸡蛋eht以质量比1:10分散于水中，鸡蛋eht的浓度为20mg/ml，调节ph值为12，搅拌混合30min，之后直接将所获产物应用于步骤(4)。
125.该对比例所获产品的粒径比实施例1的相应产品略有减小，但其抗氧化能力显著降低，抗环境应力稳定性(特别是热稳定性)也明显降低。
126.对比例5：该对比例5提供的一种淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒的制备方法与实施例1基本相同，区别在于：省略了步骤(3)，并在步骤(4)中采用市售羧甲基
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β
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环糊精替代了所述羧甲基糊精，其中槲皮素
‑
鸡蛋多肽
‑
花青素接枝物与羧甲基糊精质量比为1:1。
127.该对比例中基本没有能有效形成淀粉基双负载功能胶体纳米颗粒，其原因可能在于：市售羧甲基
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β
‑
环糊精由7个d
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葡萄糖单元通过α
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1,4糖苷键连接而成，β
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cd有着特殊的上宽下窄的圆锥体空腔结构，其c
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2和c
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3位仲羟基位于空腔的较宽端，c
‑
3和c
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5位非极性的氢和类醚氧基团位于环形分子的内部，其所含有的表面亲水性的羟基与内部疏水性基团使分子外部亲水内部疏水，与槲皮素
‑
多肽
‑
花青素接枝物之间的疏水相互作用较弱，无法有效形成复合纳米颗粒。
128.此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
129.本发明以上实施例评估了鸡蛋高密度脂蛋白多肽的分子量分布、水解度、溶解度以及表面疏水性，通过zeta
‑
电位仪测定了多肽以及复合纳米颗粒的粒径和电位。本发明在多肽与羧甲基糊精质量比为4：1～1：4的条件下制备了复合纳米颗粒。由于鸡蛋高密度脂蛋白多肽与槲皮素通过疏水相互作用结合，花青素可与多肽的氨基和巯基侧链反应，形成c
‑
n和c
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s键，反应产物在很大程度上保持了多酚的抗氧化活性。在中性环境下，带负电的羧甲基糊精分子可以通过疏水相互作用与槲皮素
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多肽
‑
花青素接枝物结合，形成具有核壳结构的复合颗粒。外部羧甲基糊精层可以增强纳米粒子的刚性，且多糖侧链可以为复合颗粒提供更大空间位阻。
130.本发明的淀粉基双负载功能纳米颗粒的制备方法使用天然来源的原料，无需使用任何有机试剂，调节ph值即可获得性能良好自组装胶体纳米颗粒，方法简单、高效、安全，易于生产，所获产品具有纳米级粒径，包埋两种不同极性的生物活性物质，兼具较高的抗氧化活性、抗环境应力(ph值、离子强度)稳定性等优点，允许高效递送，在营养物质的递送、药物的控释、生物活性物质的稳定等领域具有广泛用途。
131.尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。