一种驴脾蛋白补铁口服液及其制备方法

1.本发明属于功能食品领域，具体涉及一种驴脾蛋白补铁口服液及其制备方法。


背景技术：

2.铁是生物体必需的微量元素之一，而缺铁性贫血则是世界范围内最为普遍的一种营养素缺乏症，严重影响着人类的营养与健康，其主要原因在于铁摄入不足或过大消耗，因此科学家们在不断探索高效且安全的补铁制剂。目前，市场上常见的补铁剂主要是以硫酸亚铁或葡萄糖酸亚铁为代表，该类补剂虽然铁含量高、价格便宜，但性质不稳定易受到食物其他组分的影响，同时容易对人体产生一定副作用，带来腹泻、呕吐、生长迟缓等病症产生。因此，生物活性稳定且吸收效率高的天然补铁制剂亟待开发。
3.在驴肉加工的过程中，驴脾通常作为下脚料而被丢弃。然而，驴脾中含有丰富的蛋白质资源和矿物元素铁。其中能够与铁元素有效结合的蛋白质有血红蛋白和铁蛋白。相较而言，铁蛋白含量高，热稳定性高，且铁装载率极高。铁蛋白由24个相似的亚基自组装形成一种中空笼状分子，内外径分别约为8nm和12nm。含有h型(重链，分子量约为21kda)和l型(轻链，分子量约为19.5kda)两种亚基。h型亚基包含一个亚铁氧化中心，可将二价铁离子氧化成三价铁离子，一个亚铁氧化中心能够同时结合两个二价铁离子。因此，铁蛋白不仅可以将体内过量的fe
2+
转化为fe
3+
，进而消除fe
2+
所诱发的自由基，而且可以将铁以铁核的形式储存在蛋白质内部空腔，进而有效降低食物中膳食因子的干扰。同时，由于铁蛋白的稳定性很高，在食品加工过程中能够有效地防止热处理等极端条件对蛋白质结构的破坏，从而更好的维持铁元素含量，提高产品稳定性。还有非常重要的一点，铁蛋白在人体肠道的小肠绒毛上皮细胞表面有天然受体，可以特异性吸收铁蛋白，通过这一过程也可以促进铁元素的吸收。
4.基于以上驴脾蛋白中丰富的铁含量以及铁蛋白的相关特性，驴脾蛋白可以作为一种极具潜力的补铁制剂。本发明以畜产品加工中被废弃的驴脾作为原料，制备蛋白质提取液，再优化配方组成，制备成一种天然来源、吸收率高的补铁口服液。


技术实现要素：

5.为实现上述目的，本发明提供了一种驴脾蛋白补铁口服液的制备方法，所述方法包括以下步骤：
6.(1)分离纯化驴脾蛋白，制备浓度为0.5～3mg/ml的驴脾蛋白溶液；
7.(2)取配方量的所述驴脾蛋白、蔗糖、乳酸、香精和羟苯乙酯，制成驴脾蛋白补铁口服液。
8.2、根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(1)包括以下步骤：
9.(a)得到无成块组织的驴脾；
10.(b)得到均质液；
11.(c)将所述均质液水浴加热，离心后得到上清液；
12.(d)将所述上清液进行盐析制备驴脾蛋白溶液。
13.3、根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述步骤(a)为：去除脾脏外的脂肪组织，剪切为小碎块，以1.5～2ml水/组织(g)的比例加入去离子水后用匀浆机破碎、搅拌至无成块组织。
14.4、根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述步骤(b)为:用纱布过滤上述无成块组织，收集滤液以每200ml均质1～2min进行均质，得到均质液。
15.5、根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述步骤(c)为：将上述均质液煮沸5～10min，在4℃以8000g离心30min，弃沉淀，取上清液。
16.6、根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述步骤(d)为：在上述上清液中加入40～60％氯化镁盐析，于4℃静置过夜，次日将样品以8000g离心30min，弃上清，沉淀水溶液复溶，透析除去盐得到驴脾蛋白提取液。
17.7、根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(2)的配方量为：每100ml0.5～3mg/ml的驴脾蛋白溶液中，加入8～10g蔗糖、0.3～0.4g乳酸、0.05～0.1g香精，0.03g羟苯乙酯。随后调节ph值为4.0～4.8。再次进行均质，随后灭菌即得。
18.根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤(2)的配方量为：每100ml0.5～20μmol/l的驴脾铁蛋白中，加入8～10g蔗糖、0.3～0.4g乳酸、0.05～0.1g香精，0.03g羟苯乙酯。随后调节ph值为4.0～4.8。
19.在一个具体的实施方式中，所述碱液选自稀氢氧化钠溶液。
20.与现有技术相比，本发明具有下列有益技术效果：
21.i)本发明的驴脾蛋白补铁口服液治愈率高、不良反应率低且生物利用度良好；
22.ii)本发明的原料易得，且充分对驴肉生产加工中的下脚料进行回收利用，增加了其应用价值。
23.iii)本发明的制备方法简单易行，重复性好；设备成本低且无污染；可产生巨大的社会效益和经济效益，适合普遍推广使用。
附图说明
24.图1为经分离纯化后的驴脾蛋白溶液。
具体实施方式
25.下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
26.通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的范围。
27.实施例1：
28.一种驴脾蛋白补铁口服液，制备方法如下：
29.(1)取净重为500g左右的驴脾，去除脾脏外的脂肪组织，剪切为小碎块，以1.5ml水/组织(g)的比例加入去离子水后用匀浆机破碎、搅拌至无成块组织。
30.(2)用纱布过滤上述无成块组织，收集滤液以每200ml均质2min进行均质，得到均
质液。
31.(3)将上述均质液煮沸10min，在4℃以8000g离心30min，弃沉淀，取上清液。
32.(4)在上述上清液中加入50％氯化镁盐析，于4℃静置过夜，次日将样品以8000g离心30min，弃上清，沉淀用水溶液复溶，透析除去盐得到驴脾蛋白提取液。由图一可知，制得的驴脾蛋白为澄清透明的红褐色溶液。
33.(5)向每100ml2mg/ml的驴脾蛋白溶液中，加入9g蔗糖、0.3g乳酸、0.1g香精，0.03g羟苯乙酯。最后滴加少量稀氢氧化钠溶液调节ph为4.5，搅拌均匀，灭菌，灌封，得到实施例1的驴脾蛋白补铁口服液。
34.实施例2：
35.一种驴脾蛋白补铁口服液，制备方法同实施例1，不同之处在于：均质时所用溶液为500ml，均质时间为2min。
36.实施例3：
37.一种驴脾蛋白补铁口服液，制备方法同实施例1，不同之处在于：将均质液煮沸5min，在4℃以5000g离心30min，弃沉淀，取上清液。
38.实施例4：
39.一种驴脾蛋白补铁口服液，制备方法同实施例1，不同之处在于：向每100ml2mg/ml的驴脾蛋白溶液中，加入20g蔗糖、0.2g乳酸。
40.对比例1：
41.一种驴脾蛋白补铁口服液，制备方法同实施例1，不同之处在于：在上清液中加入50％氯化钠盐析，于4℃静置过夜。
42.对比例2：
43.一种驴脾蛋白补铁口服液，制备方法同实施例1，不同之处在于：省略蔗糖的加入。
44.对比例3：
45.一种驴脾蛋白补铁口服液，制备方法同实施例1，不同之处在于：省略乳酸的加入。
46.对比例4：
47.一种驴脾蛋白补铁口服液，制备方法同实施例1，不同之处在于：省略香精的加入。
48.对比例5：
49.一种驴脾蛋白补铁口服液，制备方法同实施例1，不同之处在于：省略羟苯乙酯的加入。
50.性能考察
51.1不同处理条件对驴脾蛋白补铁口服液感官特性的影响
52.将实施例1～4和对比例1～5制得的驴脾蛋白补铁口服液，交由来自不同地区、不同年龄、不同性别和不同职业的10名评价员组成的评审组进行感官评价。所有评价员具有一定的专业知识、良好的感官敏锐性，掌握基本的感官评价知识与技巧，并在评定之前，对评价员做评价培训。由评审组依据色泽、香味、口感及组织形态等感官综合评定，感官评价标准见表1
53.表1不同处理条件对产品品质的影响
[0054][0055]
由表1的结果可知，驴脾蛋白提取时的均质体积、煮沸时间以及盐析介质的不同，会造成驴脾蛋白补铁口服液颜色变浅；香精的添加与否会对气味造成显著影响；蔗糖与乳酸的添加比例会对产品的滋味造成一定的影响；羟苯乙酯作为防腐剂，对产品的颜色及透明度有较大的影响。
[0056]
2驴脾蛋白补铁口服液体外吸收性实验
[0057]
2.1caco-2细胞培养
[0058]
caco-2细胞培养基：dmem(hyclone,sh30022)+10％fetalbovine serum(hyclone,sv30087)+neaa(sigma)；0.05％胰蛋白酶(amresco,0458)；非必须氨基酸(sigma)；pbs；hbss。
[0059]
从液氮中取出冻存的caco-2细胞，立即放入37℃水浴中振荡使其在1min内融化。将细胞悬液用移液器移入15ml离心管中，加入5ml细胞培养基，混匀，在1000rpm离心5min，弃去上清，再加入5ml细胞培养基，混匀，同样条件离心，弃去上清，加入5ml培养基，混匀，将此细胞悬浮液移入25cm培养瓶中，放入37℃，5％co2培养箱中培养。
[0060]
当细胞达到约80％汇合时，进行传代。弃去培养瓶中的培养基，用pbs缓冲液漂洗两次。加入胰酶，轻轻转动培养瓶，使胰酶覆盖上所有细胞，放入37℃培养箱中培养5min左右，在显微镜下观察消化情况，当细胞变圆隆起，向培养瓶中加入少量培养基，终止胰酶消化，用弯头吸管将消化下的细胞吹散，计数细胞密度并向新的培养瓶中接种细胞。
[0061]
将消化后的细胞悬液向transwell板的各孔上室加0.5ml，下室各加入1.5mlhank's液，然后将transwell板放入37℃，5％co2培养箱中培养。第2天换液，先吸去transwell板各孔下层的培养基,再小心吸去上层培养基,在上层加0.5ml,下层加1.5ml培养基,然后将transwell板放入37℃,5％co
2,
培养箱中培养。第3、5、7天时，重复第二天的换液操作，第8天开始，每天更换上层培养基，隔天更换下层培养基。
[0062]
2.2供试品
[0063]
实施例1～4和对比例1～5制得的驴脾蛋白补铁口服液；去离子水作为空白对照。
[0064]
2.3药物的caco-2细胞单层模型转运实验
[0065]
当caco-2细胞在transwell板上培养到一周后,隔天测定其单层电阻值,如果大于500ω
·
cm-2
,表明其已具有足够的紧密性和完整性，可用来进行吸收实验。电阻值＝(各个孔的电阻值-对照孔的电阻值)
◇
transwell膜面积
[0066]
吸取上层和下层的培养基，用pbs缓冲液将各孔上下层各清洗三遍，上层加入0.5ml待吸收的样品溶液，下层加入1.5mlhank's液，将transwell板置于培养箱中，2h后取出，弃掉上层液体，并用0.5mlstop solution清洗三次，均弃掉，收集下层液体；各孔下层用1ml stop solution清洗一次，清洗液体与下层液体收集在一起；最后用0.5ml1m naoh清洗细胞层三次，单独收集，作为上层，各孔所收集的上、下层液体混合后于-20℃冷冻保存，采用湿法微波消化，再用电感耦合等离子体原子发射光谱(icp-aes)进行铁含量的检测。
[0067]
2.4表观渗透系数的计算：药物在caco-2细胞单层模型中的表观渗透系数(p
app
)的计算:
[0068]
p
app
＝(dq/dt)/(a
◇co
)
[0069]
p
app
单位为cm/s,q是积累运转量,代表化合物在接收端出现的总量,单位为ug；dq/dt是速率,单位为ug/min；co是化合物在给予端的初始浓度,单位为ug/l；a是聚碳酯膜的表面积,单位为cm2。
[0070]
2.5实验结果
[0071]
表2：驴脾铁蛋白补铁口服液caco-2细胞转运实验结果
[0072][0073]
注：同一列不同字母代表具有显著性差异p＜0.05。
[0074]
p
app
大于1
◇
10-4
cm/s表示药物在肠道吸收良好,小于1
◇
10-7
cm/s表示药物在肠道不被吸收。从结果来看，实验组的对铁的吸收明显大于空白组，说明制备的驴脾蛋白补铁口服液为一种良好的补铁制剂。经过对比实验可以发现，驴脾蛋白提取时的均质体积的扩大、煮沸时间的缩短以及盐析介质的不同，都可能对产品中血红蛋白以及铁蛋白的含量造成影响；此外羟苯乙酯的添加，可能会抑制蛋白的讲解，从而增强产品的补铁效果。
[0075]
上述施例的结果表明，本发明提供的制备方法得到的驴脾蛋白补铁口服液，不仅具有天然良好的色泽、协调柔和的滋味以及澄清透明的阻滞状态，且具有良好的补铁性能；
同时，本发明的原料易得，充分对驴肉生产加工中的下脚料进行回收利用，增加了其应用价值；本发明的制备方法简单易行，重复性好；设备成本低且无污染；可产生巨大的社会效益和经济效益，适合普遍推广使用。
[0076]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。