一种红法夫酵母液体复合制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及微生物及其应用领域，具体涉及一种红法夫酵母液体复合制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.红法夫酵母（phaffia rhodozyma）属于半知菌亚门、隐球酵母科、红法夫酵母属，其不仅富含蛋白质、氨基酸、维生素等多种营养物质，还富含胡萝卜素和虾青素等天然色素，能显著提高动物免疫力、净化环境和减少抗生素用量，是生态养殖的优良添加剂，具有很高的应用价值。
3.在海参、中华绒螯蟹等幼体育苗中可直接投喂红法夫酵母作为开口或幼体培育的饵料，主流产品分为发酵后的液体剂型和将发酵液喷雾干燥后的粉剂，虽然已在水产养殖中使用多年，但一直面临一些产品问题：粉剂产品遇水成团、融水慢、现场使用时操作效率低的问题。虽然液体产品更受养殖者的青睐，但遇到易变质的问题，一般需要低温储藏，需要在养殖区域配备冰箱或者恒温储藏，给养殖者带来很多不便。
4.因此，在常温下能稳定储存的液体酵母产品成为一种迫切需求。


技术实现要素：

5.为了解决和克服现有技术中的问题和不足，本发明提供了一种红法夫酵母液体复合制剂及其制备方法和应用，该复合制剂具有稳定性好、常温货架期长，能提高养水产殖动物幼体的活力和抗应激能力。
6.为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：本发明提供一种红法夫酵母液体复合制剂，所述红法夫酵母液体复合制剂包括红法夫酵母发酵液、杜仲提取物、葡萄糖氧化酶、海藻酸钠。
7.进一步的，所述红法夫酵母液体复合制剂中红法夫酵母发酵液的质量占比为95%~98%，杜仲提取物的质量占比为1%~2%，葡萄糖氧化酶的质量占比为1%~2%，海藻酸钠的质量占比为0.1
‰
~0.3
‰
。
8.优选的，所述红法夫酵母液体复合制剂由97.97%红法夫酵母发酵液、1%杜仲提取物、1%葡萄糖氧化酶、0.3
‰
海藻酸钠组成。
9.进一步的，所述红法夫酵母发酵液由保藏编号为cgmcc no.22504的红法夫酵母goy1经培养发酵获得，其活菌含量≥8
×
10
10 cfu/ml。
10.进一步的，所述葡萄糖氧化酶的酶活含量为≥10000u/g。
11.本发明还提供了所述的红法夫酵母液体复合制剂的制备方法，步骤具体为：将红法夫酵母接种到液体培养基中，培养至对数生长期，按8%~10%的接种量转接到二级生产罐中，29℃~31℃，通气量1.9 vvm ~2.1 vvm，转速220 rpm/min ~260 rpm/min继续培养40h~48h，获得红法夫酵母发酵液后，停止发酵后加热至45℃，保温20min后停止加热，冷却至≤30℃，依次加入杜仲提取物、葡萄糖氧化酶、海藻酸钠，混合均匀，得到红法夫酵母液体复合
制剂。
12.本发明还提供了所述的红法夫酵母液体复合制剂在用于制备促进水产动物生长及提高抗应激能力的饲料添加剂中的应用。
13.进一步的，所述红法夫酵母液体复合制剂的用量为投喂饵料重量的10%~15%。
14.进一步的，将所述红法夫酵母液体复合制剂与水产动物的投喂饵料混合后，按照水产动物的正常投喂规律投喂5天~30天，从而到达明显促进水产动物生长，提高水产动物的抗应激能力，减少动物体内弧菌数量的作用。
15.进一步的，所述水产动物包括对虾、海参或河蟹的幼体。
16.与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：由于常规的液体酵母产品常温下保存易变质、分层、产气，本发明通过优化生产工艺和添加葡萄糖氧化酶，克服了以上技术难题，获得了常温存放高稳定的红法夫酵母液体复合制剂，该产品长时间放置不分层、不变质。其中，还通过添加杜仲提取物，在不影响产品稳定性前提下，提升了复合制剂在调理消化道和保护肝胰腺方面的作用。所以，本发明制备的红法夫酵母液体复合制剂不仅存放稳定，且能够明显促进水产动物生长，提高水产动物的抗应激能力，减少动物体内弧菌数量，且成本低，制备方法简单，具有广阔的使用前景。
附图说明
17.图1为红法夫酵母在培养基上的菌落、菌体镜检图。
18.图2为添加不同比例黄原胶对红法夫酵母发酵液分层的影响。
19.图3为添加不同比例瓜尔豆胶对红法夫酵母发酵液分层的影响。
20.图4为添加不同比例羧甲基纤维素钠对红法夫酵母发酵液分层的影响。
21.图5为添加不同比例海藻酸钠对红法夫酵母发酵液分层的影响。
22.图6为添加1%杜仲提取物对红法夫酵母发酵液颜色外观影响。
23.图7为添加2%杜仲提取物对红法夫酵母发酵液颜色外观影响。
24.图8为添加不同比例葡萄糖氧化酶对红法夫酵母发酵液颜色外观影响。
25.图9为添加所有成分后试验前后外观对比。
26.图10添加红法夫酵母复合制剂对对虾幼苗体长的影响。
27.图11为添加红法夫酵母复合制剂对对虾幼苗离水死亡率的影响。
28.图12为添加红法夫酵母复合制剂对对虾幼苗淡水应激死亡率的影响。
29.图13为添加红法夫酵母复合制剂对对虾幼苗肝胰腺和肠道弧菌数量的影响。
具体实施方式
30.结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
31.实施例1：红法夫酵母goy1的获取及发酵液的制备1、红法夫酵母goy1的筛选、分离和鉴定取青岛胶州海参养殖水，梯度稀释后涂布于ypd培养基上，多次分离纯化后得到单菌落，命名为goy1，保存。
32.菌株goy1的菌落形态如图1a所示，菌落大而湿润，隆起，橙色至红色，表面光滑无褶皱；其菌体如图1b均为不规则椭圆形，互相独立分散。
33.以红法夫酵母goy1的dna为模板，使用18s rrna通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株goy1的18s rdna测序结果与genbank中的序列进行比对分析，结果显示菌株goy1与phaffia rhodozyma同源性最高，因此确定该菌株goy1为红法夫酵母。
34.将筛选到的菌株goy1进行菌种保藏，所述红法夫酵母goy1的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2021年05月11日；红法夫酵母phaffia rhodozyma的保藏编号为cgmcc no.22504。
35.2、红法夫酵母goy1发酵液的制备将红法夫酵母goy1活菌斜面接种到种子培养基（蔗糖36g/l、硫酸铵3.2g/l、酵母提取物1.7g/l、cacl
2 0.1g/l、kh2po
4 2g/l、mgso
4 0.5g/l、na2cl 0.1g/l，蒸馏水配制）中，培养至对数生长期，按8~10%接种量转接到发酵罐（发酵培养基配方为麦芽糊精340~350 g/l、马铃薯汁液215~220 g/l、破壁蜂花粉2.5~3 g/l、nacl 2.5~3 g/l、醋酸铵2.5~3 g/l、甘氨酸0.8~1 g/l、天门冬酰胺0.5~0.6 g/l、维生素b1 0.2~0.3 g/l，初始ph 8.1~8.2）中，继续培养40~48h，获得红法夫酵母发酵液。发酵罐内维持发酵温度介于29℃~31℃，罐内通气量1.9~2.1 vvm，罐内转速220~260 rpm/min。
36.实施例2：红法夫酵母goy1防胀瓶试验由于酵母发酵液在发酵过程中易产生二氧化碳等气体，增加液体产品胀瓶风险性，为解决这一问题，设置以下13个试验组（如表1），将实施例1制备的红法夫酵母发酵液按照表1进行处理，对照不做任何处理，均在30℃存放6个月观察其胀瓶情况。试验结果如表1所示，将发酵液ph调至酸性、碱性，以及添加不同比例nacl、柠檬酸均未能解决红法夫酵母胀瓶问题，但发酵液经过热处理或是ph=8.5+8%nacl，发酵液不会出现胀瓶问题。考虑产品最终使用效果，选择的方案为45℃处理20min，此处理并不会影响发酵液功能。
37.表1：不同处理方式解决胀瓶问题
实施例3：红法夫酵母goy1防分层试验因酵母细胞密度较大，存放过程中易沉降至底部导致产品分层，为提升外观性状，试验组设置为12组，分别在实施例1制备的红法夫酵母发酵液中添加0.1
‰
、0.2
‰
、0.3
‰
的黄原胶、瓜尔豆胶、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠；对照组不做任何处理。如图2-5所示，对照组静置存放2个月，上清体积占总体积的50%；试验组均静置存放6个月，添加海藻酸钠能够改善分层问题，其中添加0.3
‰
海藻酸钠的防分层效果最好，静置存放6个月上清占总体积的5%左右（图5）。而添加瓜尔豆胶、黄原胶、羧甲基纤维素钠对分层问题没有改善（图2-4）。
38.实施例4：红法夫酵母goy1添加植物提取物试验杜仲提取物主要含有很多的绿原酸。这种绿原酸具有消炎利胆、抗菌、抗病毒、降低胆固醇、提高白细胞及兴奋中枢的作用。本实施例通过添加杜仲提取物来提升保肝护胆作用，但前提是确保添加的杜仲提取物不改变原有发酵液的外观稳定性，且对养殖动物的肝脏健康有明显提升作用。试验组设置为2个组，在实施例1制备的红法夫酵母发酵液中分别添加1%、2%杜仲提取物，存放一段时间后，观察其颜色变化。如图6-7所示，发现添加1%提取物不改变发酵液颜色，外观性状较好。
39.实施例5：红法夫酵母goy1添加葡萄糖氧化酶试验因对虾、海参免苗期易受弧菌的感染，为提升复合产品抑制弧菌效果且不影响产品原有的外观性状，故在红法夫酵母发酵液中添加抑制弧菌的酶制剂-葡萄糖氧化酶，依据葡萄糖氧化酶抑制弧菌的最低浓度，设置10000u/g葡萄糖氧化酶的添加量分别为1%、2%、3%，加入到实施例1制备的红法夫酵母发酵液中，静置6个月观察其颜色外观变化。
40.如图8所示，表明添加1%葡萄糖氧化酶对红法夫酵母发酵液颜色外观没有影响，而添加2%、3%葡萄糖氧化酶其颜色外观发生明显变化；添加葡萄糖氧化酶的发酵液存放6个
月，发酵液并未变质，而对照组存放2个月气味发生明显变化，此结果表明添加1%葡萄糖氧化酶不仅能够抑制弧菌而且对红法夫酵母发酵液具有防腐败的功能。
41.实施例6：红法夫酵母复合制剂的制备将红法夫酵母goy1接种到液体培养基中，培养至对数生长期，按8~10%接种量转接到二级生产罐中，29℃~31℃，通气量1.9~2.1 vvm，转速220~260 rpm/min继续培养40~48h，获得红法夫酵母发酵液，此时活菌含量为≥8
×
10
10 cfu/ml；停止发酵后加热至45℃，保温20min后停止加热，冷却至≤30℃，按重量比依次加入1%葡萄糖氧化酶、1%杜仲提取物、0.3
‰
海藻酸钠，搅拌均匀后，即制成红法夫酵母复合制剂。
42.其中，葡萄糖氧化酶酶活含量为≥10000u/g，最适酶活温度为20~30℃。杜仲提取物为市售饲料原料，绿原酸含量≥5%。
43.将复合制剂在温度低于37℃下，存放180天，如图9所示，上清液占总体积的比例低于10%、无产气、无臭味，镜检观察细胞完整。
44.实施例7：添加红法夫酵母复合制剂对南美白对虾幼苗生长和抗应激的影响选择条件相同，体积为20m3的10个南美白对虾养殖池，养殖密度为10万/m3，虾苗规格为5.0
±
0.3mm，虾片与丰年虫轮流投喂，两小时投喂一次，每天投喂6次。10个池塘分为5组，每组两个池塘，红法夫酵母复合制剂投喂量分别为0、10%、15%、17.5%、20%（占虾片投喂量的重量比），每天丰年虫投喂3餐，虾片+红法夫酵母复合制剂投喂3餐，每次投喂量以1小时吃完略有剩余为宜，虾苗吃饱程度由养殖场师傅取样观察虾肠道确定。幼虾入池后即开始投喂饵料。试验持续5天，试验结束后测定打样测定虾苗长度、离水活力和适应淡水能力以及对虾肠道及肝胰腺中弧菌数量。
45.结果如图10所示，对照组虾苗平均体长为7.48 mm，随着红法夫酵母复合制剂添加量的提高，虾苗平均体长有所提高，且15%以上的添加量体长变化不明显，结合考虑生产成本等问题，15%的添加量较为适宜，说明投喂红法夫酵母复合制剂可以有效促进虾苗的生长。
46.此外，通过测定离水25分钟（每组100尾虾苗，离水后用拧干的湿毛巾包裹）后的死亡率（图11）可以看出，10%~15%添加量下死亡率最低，说明投喂适量红法夫酵母复合制剂可显著提高对虾幼苗的抗离水应激能力。
47.试验中还测试了盐度的剧烈变化对虾苗成活的影响。在玻璃缸内进行，每缸装进 400 ml 淡水，并且每缸投放40尾虾苗，通过观察15min死亡率。如图12所示，投喂适量红法夫酵母复合制剂可显著提高对虾幼苗的抗盐度变化应激能力死亡率，最高可降低70%。
48.测定对虾肠道和肝胰腺的组织液中弧菌数量，结果如图13表明，红法夫酵母复合制剂投喂量为10-15%时，对虾幼苗肝胰腺和肠道中弧菌数量较低，肠道中弧菌数量相较于对照组弧菌数量降低25%左右，肝胰腺中弧菌数量相较于对照组弧菌数量降低40%左右。
49.由此说明，本发明的红法夫酵母复合制剂能够有效促进对虾的生长，提高其体长，显著降低离水死亡率、淡水应激死亡率和肝胰腺和肠道弧菌数量，进而提高对虾的抗离水应激能力、抗盐度变化应激能力以及促进肠道菌群平衡。
50.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替
换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。