专利名称：新的混合菌组合生产维生素c前体－2－酮基－l－古龙酸(2－klg)的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的混合菌组合，使用该混合微生物可从L-山梨糖发酵生产维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸(简称2-KLG)。
2-酮基-L-古龙酸(简称2-KLG)是生产维生素C(又称L-抗坏血酸)的重要前体，目前主要用两种方法生产。
1933年，德国化学家reichstein等用化学合成法(通常被称为“莱氏法”)制取维生素C获得成功，国外目前大多采用改良的“莱氏法”生产维生素C(
图1)。“莱氏法”合成维生素C反应途径主要包括葡萄糖高压加氢变成山梨醇，山梨醇发酵生成L-山梨糖，山梨糖经过酮化，氧化成2-KLG，再经化学转化生成维生素C。莱氏法工艺成熟，总转化率50％左右，但是该法需消耗大量有毒、易燃易爆化学品，生产工厂需要相对较高的投资，从生态与经济角度上看均不利。
我国在七十年代初期发明了“二步发酵法”制备维生素C新工艺，欧洲专利号NO0278447，是在“莱氏法”的基础上予以改进的(图2、图3)，这个技术主要是采用一株氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和一株巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)组成的混合菌组合，将山梨醇发酵产生的L-山梨糖发酵成为维生素C前体2-KLG，代替了化学氧化，产酸50-60g/L，但是该工艺仍不能完全令人满意，因为底物浓度和转化率未能进一步提高，发酵过程中亦容易发生染菌，提取及后处理工艺也有待改善。
本发明旨在寻找新的混合菌组合利用L-山梨糖发酵生成2-KLG，能耐受和利用更高浓度的底物山梨糖，比现有技术更高效率地产生2-KLG，有效地解决生产中易染菌的问题。
本发明主要是通过诱变育种技术筛选得到一株产酸能力强且稳定的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)，通过与另一株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)自然搭配混合发酵，在底物L-山梨糖浓度为80-140g/l左右时，能有效地转化生成2-KLG 70-130g/l，转化率可达到86％，新的发酵组合具有很强的抗染菌能力。
为了使本发明更好地被理解，下面对此进行一些细节描述氧化葡萄糖酸杆菌的诱变过程如下，将出发菌株1.945(氧化葡萄糖酸杆菌，本实验室保存)单菌落增殖后，紫外处理30分钟，避光培养过夜，平板分离与苏云金芽孢杆菌搭配通过发酵对比试验挑选产酸能力强且性状稳定的单菌落，其中一株具有代表性的菌株编号SCB329，其形态特征和生理生化特性与1.945均有显著差别。
利用本发明转化L-山梨糖产生2-KLG的特点在于所采用的是包含有氧化葡萄糖酸杆菌和苏云金芽孢杆菌或者它们的变异株所组成的混合菌株，其中效果最佳的是采用了氧化葡萄糖酸杆菌SCB329和苏云金芽孢杆菌SCB933的混合菌组合(存放标记为CCTCC M96012，中国·武汉·武汉大学校内·中国典型培养物保藏中心)。
把该混合菌体系培养在含有L-山梨糖以及适当的营养的培养基中，在通气条件下，微生物适宜于在液体培养。
发酵可以在摇瓶及5L、15L、147L罐中进行，甚至更大规模地实现转化。
发酵过程pH可以在5到8之间进行，最佳为6.8到7.0之间。
发酵过程合适温度在25到35℃之间，最好为28到32℃。
发酵周期取决于pH、温度和山梨糖浓度等，可以有所变化，一般为1.5到3天。
发酵中用作原料的L-山梨糖底物浓度可以在大约20g/l到200g/l之间变动，最适为80g/l到140g/l。山梨糖浓度在最初培养基中可以较低，而在发酵中间流加含一定量辅料的山梨糖溶液，因此2-KLG浓度可达130g/l或更高。
按本发明所得到的2-KLG可直接由发酵液中分离提取，并能通过化学方法转变成L-抗坏血酸(维生素C)。
本发明具有以下特点1.新的混合菌发酵技术采用产酸能力强且性状稳定的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans SCB329)的菌株以及另一株苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis SCB933)自然搭配，混合发酵生成2-KLG，转化率大大提高，可达到86％。
2.可以耐受较高的糖浓度，在底物浓度高达80-140g/l左右时，能有效地转化生成2-KLG达70-130g/l以上。
3.新的发酵体系搭配有苏云金芽孢杆菌，因而具有很强的抗染菌能力。
本发明可用下面的例子详细说明图1为莱氏法工艺流程示意图。图2为二步发酵法工艺流程示意图。图3为二步发酵法中L-山梨糖氧化反应原理图。图4为5L罐分批发酵残糖和产酸变化曲线图。其中
表示L-山梨糖残留量(g/l)
表示2-KLG生成量(g/l)图5为147L罐流加发酵残糖和产酸变化曲线图。其中
表示溶氧水平(％)
表示L-山梨糖残留量(g/l)
表示2-KLG生成量(g/l)实施例1、摇瓶发酵将氧化葡萄糖酸杆菌SCB329划线于种子固体培养基上，28℃培养24小时，再在此培养物上直接接种苏云金芽孢杆菌SCB933，28℃继续培养24小时，以无菌水将菌苔洗下得到菌悬液，接入种子摇瓶(装量25ml/250ml)，28℃下250rpm振荡培养12-14小时，产酸4-7g/l，以5％接种量接入发酵摇瓶(装量50ml/500ml)，28℃下250rpm振荡培养3天，所得发酵液产生2-KLG 70.5g/l。
种子培养基成分山梨糖(1.5％)，玉米浆(0.3％)，CaCO3(0.3％)，蛋白胨(1.0％)，酵母粉(0.5％)，尿素(0.4％)，KH2PO4(0.5％)，MgSO4.7H2O(0.02％)。摇瓶发酵培养基成分山梨糖(8％)，玉米浆(1％)，CaCO3(0.4％)。实施例2、5L罐分批发酵参见图4，SCB329于种子固体培养基上划线，28℃培养24小时，再划线接上SCB933继续培养24小时，以无菌水洗下，得到菌悬液接入种子摇瓶(装量80ml/500ml)，28℃培养12小时，产酸4-5g/l，以5％接种量接入5L发酵罐，发酵温度28-30℃，pH6.8-7.0，发酵周期30小时，产生2-KLG 71.35g/l，摩尔转化率89.99％。
罐发酵培养基成分山梨糖(8％)，玉米浆(2％)，CaCO3(0.2％)，尿素(0.05％)，KH2PO4(0.05％)，MgSO4.7H2O(0.01％)。实施例3、147L罐流加发酵参见图5，SCB329于种子固体培养基上划线，28℃培养24小时，再划线接上SCB933继续培养24小时，以无菌水洗下，得到菌悬液接入种子摇瓶(装量80ml/500ml)，28℃培养12小时，产酸4-5g/l，以5％接种量接入15L种子罐，培养温度28-30℃，pH6.8-7.0，经12小时后产酸达4-5g/l，以5％接种量接入147L发酵罐，初始培养基中山梨糖浓度4.52％，发酵温度28-30℃，pH6.8-7.0，发酵至16小时开始流加67.1％山梨糖溶液，使之终浓度达13.86％，38小时后流加结束并继续发酵4-8小时，产生2-KLG 130g/l，摩尔转化率87.04％。
权利要求
1.以L-山梨糖为底物，采用混合菌组合发酵制备维生素C前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)，其特征在于使用了以氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)或者它们的变异株所组成的混合菌组合。
2.按权项要求1所述的混合菌组合，其特征在于所述的氧化葡萄糖酸杆菌为SCB329。
3.按权项要求1所述的混合菌组合，其特征在于所述的苏云金芽孢杆菌为SCB933。
4.按权项要求1所述的采用混合菌组合发酵制备2-KLG的方法，其特征在于发酵中L-山梨糖底物浓度可从20-200g/l，最宜为80-140g/l。
5.按权项要求1，4中所述的方法，其特征在于发酵温度为25-35℃，最好为28-32℃。
6.按权项要求1，4中所述的方法，其特征在于发酵过程中pH为5.0-8.0，最适pH为6.8-7.0。
7.按权项要求1，4中所述的方法，其特征在于发酵周期为1.5-3天。
全文摘要
本发明采用一株产酸能力强且稳定的氧化葡萄糖酸杆菌与另一株苏云金芽孢杆菌搭配,以L－山梨糖为底物进行混合发酵,在底物浓度高达8—14%左右时,能有效地转化生成2－KLG达70—130g/l,转化率86%以上。新的发酵组合体系具有很强的抗染菌能力。
文档编号C12P17/04GK1174237SQ9611646
公开日1998年2月25日 申请日期1996年8月15日 优先权日1996年8月15日
发明者尹光琳 申请人:中国科学院上海生物工程研究中心