用于鉴定与部位偏爱性癌转移形成有关的基因的免疫-磁性细胞分离技术的制作方法

专利名称：用于鉴定与部位偏爱性癌转移形成有关的基因的免疫-磁性细胞分离技术的制作方法
技术领域：
本发明的目的是提供一种新颖的技术，用于检测存在于不同组织的肿瘤细胞中的具有部位特异性表达模式的新基因。
众所周知，很多类型癌表现出典型的扩散模式，因此此过程中，转移通常有序地优先出现在某些组织或器官中。例如，乳腺癌的转移通常首先在腋下淋巴结中形成，而骨髓和骨转移是首先最常见(50％)的远隔扩散部位。其它组织中，肝，肺和中枢神经系统(最高达20％)也成为乳腺癌转移的宿主。类似地，前列腺癌表现出骨髓转移，结肠癌扩散至淋巴结和肝脏，骨肉瘤扩散至肺，恶性黑素瘤扩散至淋巴结，肝、肺和脑，对于决定这种组织偏爱性癌扩散的因素所知甚少，但是肯定涉及肿瘤细胞的神经特征，借助于例如，使肿瘤细胞能寄宿于靶器官，能转移并侵入宿主组织，能应答于当地的生长因子，能诱导血管形成，或者通过其它迄今未知的方式起作用。这些特征必定同已知或未知基因表达的的特定蛋白质表达相关连。因此，鉴定这样一些基因，对于了解转移的机理，并从而对诊断和治疗提供新的指导或线索具有重要的意义。
有几种方式正在用于研究在某些细胞群能高度表达、而在其它细胞群不能表达的基因，包括例如扣除杂交克隆技术，以及应用差示显示法(differential display)。这些克隆方案的绝大多数都涉及使用体外细胞株，或者使用克隆作为起始物。但是，已经知道，这些细胞株可能明显不同于产生它们的肿瘤细胞，并且体外培养条件下也可能增量或减量调节涉及决定细胞侵入细胞外基质和基质组织的能力，以及它们的总体转移能力的基因的表达。
用于比较基因转录物或所需蛋白质表达的细胞株的另一种合理的选择是使用来自病人原发肿瘤和转移肿瘤的肿瘤组织样品。但是，这种方法的确包括几种错误的可能性，并且还存在技术困难，当使用来自不同病人的肿瘤细胞时，在对与本研究有关的基因表达模式进行比较之前，必须扣除体现每个病人特征的基因表达。这就使这种基因克隆增加了极大的复杂性。因此，能够对从位于同一个病人不同部位的肿瘤表现形式得到的癌细胞比较其表现形式将是有利的。通过如下方式收集肿瘤组织可达到此目的从原发性肿瘤和经检查并作外科手术切除的明显转移收集，和/或者通过对复发病人外科手术或活组织检查收集，或者从病人的继发性肿瘤收集，这些病人在初次外科手术之后已接受或未接受其它方式的治疗。
在任何一种基因克隆方案中，重要的是使用尽可能纯的靶细胞群，力图避免来自非靶细胞的、混淆待比较表达模式的无关信号。对于来自实体瘤的样品这点难以达到，因为在外科手术和活检样品中，肿瘤细胞是与正常的包括基质细胞和内皮细胞的纤维组织相混合的，常规的组织制备法不能满意地除去这些细胞。对于血液癌，其恶性细胞具有与相应的正常细胞亚群共同的抗原决定簇，这将阻碍对这二种类型细胞的分离。
在试图对早期肿瘤扩散中涉及的基因进行鉴定时，重要的是当继发性肿瘤的体积很小时从相关部位取得肿瘤细胞，或者如果有可能，甚至应该从亚临床肿瘤病灶或细胞中取得肿瘤细胞。一个实施例是，在常规的诊断检查能发现实体转移形式之前，恶性细胞已存在于血液或骨髓中。另一个实施例是在常规的形态学方法能够检测癌细胞之前，这些细胞已存在于脑脊液中，尿中，或者胸腔和腹腔渗漏液中。并且，在初次外科手术时，或者如果怀疑存在转移性扩散，淋巴结常常被除去，因为它们已扩大了。但是，当可能仅存在有限数量的肿瘤细胞时，形态学检查可能仍然是阴性。在所有这些实施例中，本发明描述了一种以基因克隆为目的的检测和选择靶细胞的方法。
除了使用从病人不同组织或器官得到的癌细胞之外，本发明还描述了另一种得到转移性人肿瘤细胞的途径，用于研究具有部位特异性表达的基因。已经在体外，或者在免疫缺乏的动物体内培养了来自几种人肿瘤的细胞，并且，用这些细胞建立了实验性转移模型，或者使细胞能在其中常位生长，即在临床相关的起源组织中生长的模型，如恶性黑素瘤在皮肤中，骨肉瘤在骨中，结肠癌在肠壁中，乳腺癌在乳房脂垫中，等等。在实验性转移模型中，可见到肿瘤扩散的不同模式，取决于细胞株，细胞注射的途径，以及所用宿主的种类。通常这种转移模式模拟相应种类的肿瘤在临床条件下的转移模式。通过使用这种模型，还可能从通常在病人体内不易进入的转移部位得到肿瘤细胞，例如脊髓和脑组织。而且，重要的是为了进行基因克隆，从动物细胞中选择人肿瘤细胞，从而避免了正常宿主细胞的基因表达问题。
在以前，要对实体肿瘤和转移样品，以及对血液和骨髓中的恶性细胞，进行以鉴定部位特异性表达基因为目的的，有意义的基因克隆实验是不可能的。这是因为实体肿瘤和转移病灶中相当大的部分不是恶性细胞，而是支撑和生长在恶性细胞之间的结缔组织，并且其中也包含有对肿瘤提供必要的营养因子和氧气供应的血管。并且认为，不借助于体外细胞培养的中间步骤，不进行除去正常细胞的操作，就不可能从正常细胞中适当地分离出肿瘤细胞。但是，这种体外培养可能导致在完全不同于体内状况的，因而明显改变基因表达模式的环境中，对肿瘤细胞的亚群进行选择，从而。因此，为了鉴定与转移过程有关的基因，不能采用从实体转移肿瘤培养肿瘤细胞的方法。而且熟知基因克隆领域的技术人员都认为，比较未经处理的实体原发性和转移性肿瘤中恶性细胞的基因表达模式是没有意义的。并且，在血液和骨髓样品中，肿瘤细胞在任何情况下都仅构成具核细胞总数中非常少的一部分，而且，血液和骨髓中的恶性细胞对进行基因克隆是没有价值的。这是因为不能从正常细胞中适当地分离出肿瘤细胞，更重要的是因为熟知基因克隆技术的人员已经预料到，这些恶性细胞基因表达模式与母体肿瘤相比较没有显著的差别。
在试图鉴定与部位特异性表达相关的肿瘤基因的过程中，还没有使用在免疫缺乏动物中从转移至不同的临床相关靶组织器官的人肿瘤分离出的癌细胞，这仅仅是因为这种人肿瘤模型非常稀少，但是更重要的是因为缺乏获得纯癌细胞群的方法。
因此，本发明的目的是提供一种方法，通过此方法能够从细胞群中分离出靶细胞，以便用于鉴定来自特定细胞群环境中靶细胞的基因序列。
通过本发明已达到了这个目的，在所附的权利要求中描述了本发明的特征。
因为本发明的目的是在肿瘤扩散的早期阶段鉴定特异性表达的基因，所以其实体肿瘤和转移病灶体积都很小，并且血液和骨髓中的恶性细胞将表现出所谓的微转移性疾病，即存在有限数量的癌细胞。如果有可能，即使在如下情形下就应该收集这种癌细胞这种细胞还不能被常规的形态学检测法所发现，或者用诊断方法如放射技术和磁共振成象技术也不能检测。显然，因为这种细胞还不能被识别，所以它们对基因克隆没有价值。应用免疫磁性技术可在即使少量存在的情况下分离出这种恶性细胞。各种扩增DNA和RNA序列的方法，使之有可能对如此少量的恶性细胞进行基因克隆，只要这种细胞群具有充分的纯度。
应用本来已知的技术可以获得正选择靶肿瘤细胞，如在专利PCT/NO 93/00136(WO 94/07139)和PCT/NO 95/00052中所描述的，因为在目前情况下最后靶细胞群的纯度是很重要的，所以免疫磁性选择处理可以重复进行几次，或者还可以以正选择(用识别靶细胞的单克隆抗体)和负选择(用与干扰细胞结合的抗体)结合的形式进行处理。这些技术已成功地用于从血液，骨髓，恶性渗漏液中分离出靶细胞，并且还从由原发性肿瘤和淋巴结以及其它转移的实体瘤组织制备的单细胞悬液中分离出了靶细胞。同样地，还已证明可以从动物宿主的正常基质细胞或造血细胞中选择人恶性细胞，即使当肿瘤细胞是存在于骨，骨髓，脊髓或脑组织中也能进行选择。因为目标之一是搜寻具有涉及转移形成早期阶段产物的基因，可能碰巧仅能获得相当少的肿瘤细胞，所以肿瘤细胞的纯度特别重要。与通过任何其它已知的技术相比较借助于这种方法，可能从人和动物宿主得到更纯的靶细胞群，为克隆部位特异性表达基因提供了极好的可能性。
本发明的下一步涉及使用已知的基因克隆技术，例如使用由LiangA.和Pardee A.B(Science,Vol 257,967-971,1992)首先描述的差示显示技术。在此方法中，是以产生逆转录和随机扩增存在于靶细胞中的基因转录物的酶和引物进行聚合酶链反应。然后，在测序凝胶上对从待比较的细胞群产生的cDNA片段进行研究，提取出部位特异性片段并进行测序。此后可对所需的基因片段作进一步研究，包括在类似于用于克隆的材料中，测定它们的表达模式。再次强调的是，得到一种纯化肿瘤细胞群，没有无关的干扰检测结果的非靶细胞是非常重要的。有可能使用从免疫缺乏动物转移模型分离人肿瘤细胞的优越性，还在于该模型为更深入地研究提供了可靠的连续的靶肿瘤细胞来源。另一方面重要的是，从病人或从动物模型分离的靶细胞，经处理后可直接地，非常迅速地用于DNA和RNA研究，避免了基因表达中不希望存在的与鉴定部位特异性表达基因的目标无关的改变。
用于克隆新基因的不同方法都具有其内在的局限性。基于聚合酶链反应技术的差示显示法也可能遇到与代表性和重复性有关的问题。对于我们的方法，我们随之采取了目的在于使这些问题减到最小的步骤。主要是通过使用磁性免疫微球(immunobead)选择技术达到了这个目的，该技术使之有可能对有代表性的特异性生物细胞进行研究，不仅可用于最初的差示显示步骤，而且可在测定待选基因在相关细胞和组织中表达水平的步骤中使用。
实施例1借助于物理学和酶学方法，制备来自乳腺癌病人原发性肿瘤和腋下淋巴结的肿瘤细胞，获得单细胞悬液。抽取骨髓样品(50ml)，并通过静穿到采取外周血液样品，在淋巴细胞制备器(Lymphoprep)(NycomedPharma,Oslo,Norway)上分离出两种样品的单核细胞。将此细胞悬液单独分别与识别泛上皮抗原(pan-epithelial antigen，和MUC-1基因产物的MOC-31和BM7单克隆抗体共同温育。漂洗和温育之后，加入磁性微球Dynabeads M-450 SAM SD(Dynal,Oslo,Norway)Dynabeads与第一抗体的Fc-区相结合。然后可以用强磁体从正常的单核细胞中分离出带有结合的抗体-Dynabeads M-450SAM SD复合物的肿瘤细胞。显微镜检证实了所选择细胞的性质。从不同的细胞群中提取出RNA，并使此物质进行差示显示克隆(Liang andPardee,1992)，其中对通过逆转录从mRNA亚群得到的部分cDNA序列进行聚合酶链反应扩增。在测序凝胶上对来自各种肿瘤细胞群的cDNA片段进行了比较，提取在从某一部位得到的细胞中特异性表达的片段，并进行测序。在以我们的磁性免疫微球技术从骨髓分离出的肿瘤细胞中，或者在此免疫磁性技术从淋巴节转移病灶分离出的肿瘤细胞中，从若干具有特异性表达的所需基因序列中，除了尚未鉴定的基因之外，我们已发现了一个细胞周期相关的转录因子，即一种致癌基因产物。目前正在对相关的生物模型系统和临床材料中，二个已鉴定的基因序列的表达进行分析。实施例2在此实施例中，使用了来自人乳腺癌实验性转移模型的细胞。对于无胸腺裸大鼠，大池(CM)内注射MA-11人乳腺癌细胞，导致恶性细胞在柔脑脊膜内扩散，生长。并且，对左心室(LV)内注射的MA-11细胞在脊髓内形成了转移，在大约35天后，导致动物后肢发生麻痹。通过绞碎宿主组织，制备单细胞悬液，获得了来自二个部位的肿瘤细胞，并借助于实施例1所述的磁性免疫微球技术对恶性细胞作正选择。然后，对来自二个部位的细胞，和体外培养的MA-11细胞一起进行RNA提取，并同样如上所述，使此RNA经受差示显示克隆程序。此外，还从大鼠相关的正常组织中提取mRNA作为对照。应该说明的是，MA-11细胞株是从来源于借助免疫磁性法从Ⅱ期乳腺癌病人的骨髓中得到的微转移性肿瘤细胞分离物建立的。已检测出几个特异性候选片段，它们对在柔脑脊膜中生长的，或者作为对脊髓转移病灶的细胞具有特异性。序列分析表明，这些片段中既有新发现的基因，以有已知的基因。这些被证实在选自转移细胞的MA-11细胞中差示表达的片段中，迄今已对四个候选基因进行了更详细的测定。其中定名为LV1和LV12的二个基因片段特别有价值，LV1显示在来自脊髓转移的肿瘤细胞中，有非常高的表达偏爱性，而LV12在柔脑脊膜生长的细胞中受到减量调节。发现LV1在若干已知具有在免疫缺乏动物中形成实验性转移高度能力的细胞株中，受到了增量调节。在一组来自乳腺癌病人的原发性肿瘤中，LV12的低表达与相应病人的短存活期有关。综合这些结果表明，LV1 mRNA似乎在高度转移性细胞中受到了增量调节，而相反LV12 mRNA的水平与乳腺癌细胞的进行和转移有关。这个二基因都是新发现的。此外，第三个有希望的候选基因CM13，也是在柔脑脊膜生长的肿瘤细胞中受到了增量调节的新基因。还将对其它几个候选基因作进一步的分析。对LV1及LV12 cDNA的全长克隆已经开始进行。实施例3以类似于在实施例2中所述的模型，在作CM注射之后使MT1人乳房癌细胞生长在柔脑脊膜中，而LV注射的细胞转移至骨髓以及脊椎骨和长骨。将来自这二个部位的细胞以及体外培养的细胞分离出，并提取出了来自不同细胞群的RNA。然后可对此RNA作类似于实施例2中所述的克隆处理。实施例4通过在实施例1中所述的技术分离出的肿瘤细胞，也已从下列几种病人样品中被分离出其它乳腺癌病人；结肠癌病人，在此肿瘤细胞是从原发性和复发性肿瘤中从淋巴节和肝脏转移病灶，血液和骨髓样品中分离，以及从前列腺癌病人。选自原发性和复发性肿瘤样品的细胞，除了从血液和骨髓之外，还从淋巴节中分离出细胞。这些被分离出的细胞都可用于进行基因克隆。
除了将实施例1-4中所述的材料用于基因克隆之外，还可以将它用于测定有充分希望的所有基因序列的表达模式。
权利要求
1．一种用于鉴定当特异性靶细胞存在于不同于或不是其起源的细胞环境时，该靶细胞具有的位点特异性或部位偏爱性表达的基因的方法，其特征在于，为了获得最高可达100％特异性的靶细胞，在对靶细胞实施已知的细胞克隆程序之前，首先重复地进行免疫-磁性处理对靶细胞进行检测和分离。
2．据权利要求1的方法，其特征在于，所使用的靶细胞是从如下样品获得的恶性细胞原发性或复发性实体肿瘤，和/或这种肿瘤对淋巴结，和/或血液，和/或骨髓，和/或骨组织，和/或肝脏，和/或肺，和/或中枢神经系统，和/或胸膜恶性渗漏液及腹水，尿，和/或脑脊液，和/或其它器官位点的转移。
3．据权利要求1-2的方法，其特征在于，其恶性细胞是从如下细胞材料中分离出的由实体肿瘤制备的单细胞悬液，和/或从骨髓或血液样品中获得的单核细胞组分，和/或存在于其它体液中的细胞。
4．据权利要求1-2的方法，其特征在于，所用的恶性细胞是体外培养的人肿瘤细胞，和/或在免疫缺乏动物的特异性组织中生长的人肿瘤细胞，和/或在这种动物中的实验性人肿瘤转移。
5．据权利要求1-4的方法，其特征在于，从所分离的细胞中提取RNA和/或DNA。
6．据权利要求5的方法，其特征在于，所提取的核酸是被用于基因克隆的目的。
7．据上述权利要求的方法，其特征在于，所述的基因克隆方法是差示显示法或扣除杂交法，或者是能用于鉴定具有差示表达(differential express)基因的其它方法。
8．据权利要求7的方法，其特征在于，在测序凝胶上对从选自不同部位的恶性细胞得到的被扩增cDNAs进行研究和比较，并在此对那些感兴趣的具有位点特异性或部位偏爱性表达模式的cDNA进行测序和鉴定。
9．据权利要求8的方法，其特征在于，是在从权利要求1-4中所述的所有相关的肿瘤细胞位点得到的材料上，对所鉴定基因序列的表达模式进行研究。
10．据上述权利要求的方法，其特征在于，在上述权利要求中所确定的以前尚不知道的基因是用于基因治疗的目的，和/或者是作为目的在于使这些基因或其产物发生改变或失活处理的靶物。
11．权利要求1方法的用途，用于从存在于不同于或不是其起源的细胞环境的靶细胞中，获得特异性基因序列和其表达产物。
全文摘要
一种用于鉴定靶细胞中具有部位特异性或部位偏爱性表达基因的方法,是首先通过反复地免疫－磁性处理对靶细胞进行检测的分离。然后对纯化的靶细胞实施已知的克隆程序,优选的靶细胞是恶性细胞,例如转移细胞。基因克隆的方法可包括使用差示显示法(differential display)或扣除杂交法(substractive hybridization)。
文档编号C12N5/10GK1214738SQ97193361
公开日1999年4月21日 申请日期1997年3月25日 优先权日1996年3月26日
发明者奥伊斯坦·福德斯塔德, O·恩格布拉藤, A·H·雷, J·E·霍维格 申请人:奥伊斯坦·福德斯塔德