%，摇床转速为50-80r/min，24-28°C培养10-15小时后调整温度为16-20°C进行低 温静止培养，停止搅拌，pH调整为3-5,保持2-4小时；之后阶梯形升温到26-30°C，pH调整 为4. 6-5. 5,按照初始培养基2. 5%的添加量添加蛋白胨，按照2%的量添加酵母粉，摇床转 速为50-lOOr/min，继续发酵10-15h;发酵液干燥粉碎过50-60目筛后即得海洋酵母发酵培 养物。
[0018] 优选的，在所述低温静止培养阶段向培养基中添加初始培养基重量3_5wt%的蛋 氨酸螯合铜。
[0019] 所述酶解玉米粉的制备方法为：将玉米粉与水混合，湿法粉碎制备细微玉米粉 料液，加入a-淀粉酶和氯化钙，调节pH5. 5-6. 0,72°C保温15min，再加热至90°C酶解 20-30min，然后降温至55-60°C，调节pH4. 5-5. 0,添加酸性蛋白酶水解30-40min，酶解液离 心洗涤后即得浓缩的酶解玉米粉。
[0020] 所述杨树花提取物的制备方法如下：
[0021] 将杨树花干燥粉碎至粒径为2毫米以下，添加3-6倍重量的水，控制温度 70°C-90 °C保持2-4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至 40°C-50°C保持3-4h，过滤，滤液真空浓缩后冷冻干燥获得杨树花提取物。
[0022] 优选的，乙醇和丙醇的质量比例为1:1-1. 5,乙醇浓度为95%，丙醇浓度为100%。
[0023] 本发明所述饲料添加剂的制备方法如下：
[0024] 将积雪草、山药、薤白和乌梅分别干燥粉碎过60目筛，再与通过上述方法制得的 海洋红酵母发酵培养物、复合多糖提取物和杨树花提取物按比例混合均匀即可。
[0025] 本发明提供的一株用于饲料添加剂的海洋红酵母WYN1，属于红酵母属 (Rhodotorula)，所述菌株已于2014年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址： 中国.武汉.武汉大学，邮编430072)，保藏编号为：CCTCCNO:M2014592,分类命名：海洋 红酵母WYN1(Rhodotorulasp.WYN1)〇
[0026] 本发明饲料添加剂产品在一般畜禽和水产饲料中均可以添加使用，尤其在猪饲料 中使用效果最佳，添加量以饲料重量0. 5-2%。为宜。
[0027] 有益效果：
[0028] 本发明利用从海洋环境中分离获得的一株既能高产类胡萝卜素又能富集铜的海 洋红酵母WYN1，通过静止培养方法有效的提高了酵母中类胡萝卜素产量和铜含量。采用 本发明方法发酵培养海洋红酵母WYN1，其生物量、类胡萝卜素产量及胞内铜含量分别达到 27g/L以上、35-40mg/L和7240-8000yg/g干菌。研发中，发明人意外发现低温静止培养可 以有效提高胡萝卜和铜含量，是本发明的重要成果。
[0029] 本发明所述海洋红酵母WYN1作为饲料添加剂应用于饲料中，可以提供类胡萝卜 素、B族维生素和铜离子，其高效的富铜能力良好地取代了常规饲料中使用的无机铜离子， 稳定性好，易于饲料长期有效贮存和运输，与饲粮中其它组分配伍性好，吸收率高，排泄率 低，环境污染小，改善动物肤质和毛色，强化饲料的营养价值。
[0030] 本发明对复合多糖的提取方法简单彻底，极大节省了乙醇用量和提取时间，并且 保证了提取物中黄芪多糖、苜蓿多糖、枸杞多糖等有效成分含量。
[0031] 本发明通过科学复配，将具有富铜能力和高产类胡萝卜素的海洋红酵母菌与多种 中草药成分实现了有机组合，可以有效降低抗生素类药物在饲养动物中的使用量，提高肉 制品的安全性，提高饲料利用效率，增强动物机体免疫力，调节肠道健康，改善动物代谢机 能和繁殖能力，提高饲养效益。
【具体实施方式】
[0032] 下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术 手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发 明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背 离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改 动也属于本发明的保护范围。
[0033] 实施例1:海洋红酵母菌WYN1的获得及耐铜能力驯化
[0034] (1)将从黄海海边采集新鲜的海虾、海星、海藻等生物样本，置于无菌的YEro培养 基中，挑取红色或粉红色圆形菌落，进一步纯化培养。根据各菌种类胡萝卜素的积累量，筛 选类胡萝卜素产量高的菌种。其中类胡萝卜素产量较高的海洋红酵母WYN1，细胞为卵圆形， 没有假菌丝；在海水配置的YEH)培养基上形成红色菌落，表面光滑，边缘整齐；在产孢培养 基上不产子囊孢子，多边芽殖，无掷孢子；不发酵糖，不形成类淀粉化合物，不同化肌醇。根 据上述特点，初步确定属于红酵母属（Rhodotorula)。斜面保存于冰箱中。
[0035] (2)海洋红酵母WYN1的发酵培养
[0036] 将菌种转接到斜面培养基上活化，28°C培养24h后，接种于液体种子培养基中， 28°(：振荡培养3611得种子液，按10%接种量接入装有6〇1^发酵培养基的25〇1^三角瓶中， 28°C，振荡培养48h(摇床转速为180r/min)。发酵培养基组成为葡萄糖2%，蛋白胨1%， 酵母膏1%，硫酸镁〇. 02%，磷酸二氢钾0. 15%，盐度20。28°C摇床培养48h，转速为180r/ min〇
[0037] (3)耐铜能力驯化
[0038] 将海洋红酵母菌WYN1接种于铜离子含量为50mg/L(硫酸铜配置）培养基中，置于 28°C，180r/min恒温摇床上震荡培养24h。然后从该培养物中取3ml发酵物接种到不含铜 的麦芽汁培养基中，培养24h。反复培养几代，使酵母在含铜的培养基中生长稳定，且数量不 再增多时，再逐步提高培养基的铜浓度。如此反复便可使得酵母菌能够适应铜离子含量为 300mg/l的环境，获得了耐铜的特性。本发明经过对海洋红酵母进行耐铜能力驯化后，能有 效地提高细胞生物量、类胡萝卜素的产量及酵母的富铜能力。
[0039] (4)细胞生物量的测定
[0040] 将发酵液3000r/min离心lOmin，弃上清液，菌体经无菌水洗2~3次后再次离心， 所得菌体置于60°C烘箱中干燥至恒重，准确称重。
[0041] (5)类胡萝卜素的提取：
[0042] 将lg干菌体放入lOOmL三角瓶中，加入5mL3mol/L的盐酸室温浸泡lh，沸水浴 4min，迅速冷却，3000r/min离心15min沉淀为细胞残渣，用丙酮定容至20mL萃取，得类胡萝 卜素浸提液。
[0043] (6)类胡萝卜素的测定
[0044] 将提取液适当稀释后，用722型分光光度计在475nm条件下测定光吸收值。按下 式计算类胡萝卜素含量：
[0045]
[0046] 式中：AA_为475nm波长处的吸光度；D为测定试样时的稀释倍数；V为丙酮用量 (mL) ;0. 16为类胡萝卜素的克分子消光系数；W为红酵母菌体干重（g)。
[0047] (7)酵母含铜量测定
[0048] 用原子吸收法测定。
[0049] ⑶菌种保藏
[0050] 将上述经过驯化的富铜海洋红酵母WYN1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏 编号为：CCTCC NO :M2014592。
[0051] 实施例2:(对比试验）海洋红酵母WYN1高产类胡萝卜素的发酵条件研究
[0052]发酵培养基组成：葡萄糖2. 5 %，蛋白胨2. 5 %，硫酸镁0.02 %，磷酸二氢钾 0. 15%，铜含量300mg/L(硫酸铜配置），氯化钠20%，其余为水；初始pH为8,接种量10%， 摇床转速为180r/min，28°C培养24小时后，温度调整为30°C，pH调整为5,补加一次氮源， 即再按照2. 5%的添加量添加蛋白胨，继续发酵24h。采用上述方法发酵培养海洋红酵母 WYN1，其生物量、类胡萝卜素产量及胞内铜含量分别为27. 52g/L、25. 12mg/L和62