专利名称：用于预防hiv经上皮传播的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用于阻止人类免疫缺陷病毒(“HIV”)传播的方法、组合物和制品。在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及ICAM-1激动剂/拮抗剂以及它们在阻止HIV经粘膜表面而传播中的应用。
参考本文引用了多篇文献。这些文献的完全引用见下。除非特别指明，这些文献均全文引入本文作参考。
背景技术：
理解病毒传播的机制是防止HIV，这种获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子扩散的关键。限制AIDS的世界范围内大流行，很大程度上取决于阻止HIV进一步传播和扩散的能力。
HIV-1性传播的一个关键特点是最初与该病毒接触的阴道或粘膜表面覆盖着上皮细胞，它们并非一般情况下与HIV-1感染相关的细胞。为了跨过这道屏障，病毒必须(1)直接跨过上皮细胞或感染上皮细胞，(2)与能在上皮细胞间移动的那些细胞结合，或(3)延伸(extend)在上皮细胞间的那些可被感染的宿主细胞接触。已有实验证据支持所有这些可能性。此前的研究提示，上皮细胞可被生殖性(productively)感染，但传播至这些细胞或从这些细胞开始传播需要直接与已感染的细胞或可感染的细胞接触。
HIV潜伏感染的白细胞，CD4白细胞和不相关个体的上皮细胞之间的物理接触可激发HIV-1快速装配并释放至供体细胞与受体细胞之间的封闭空间。在这一过程中，单核细胞形成与上皮膜亲密接触的微绒毛。隔离在这些部位的病毒体随后通过内在化而进入上皮细胞内的吞噬体中。这些观察得到其它很多项研究的支持，它们证实，细胞与细胞间的相互作用是HIV-1有效传播至上皮细胞和从上皮细胞有效传播至其它部位的关键。
ICAM-1是组成型表达于静息态内皮细胞、静息态单核细胞、静息态上皮细胞以及活化的T细胞上的一种单链糖蛋白粘附分子。ICAM-1的表达可由各种细胞因子包括IFN-γ，TNF-α，和IL-1来诱导。CD18家族的细胞粘附分子介导免疫系统与炎症系统的细胞之间的相互作用。LFA-1(也称为淋巴细胞功能相关抗原-1或CD11a/CD18)可识别并结合内皮细胞表面的ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3。LFA-1的异二聚体结构由一条α链以及一条β链组成。作为整合蛋白家族的一个成员，LFA-1在多种细胞过程如迁移、抗原提呈、和细胞增殖中发挥作用。例如，LFA-1介导白细胞对内皮细胞的结合，使得白细胞可从血液中迁移至组织中。ICAM-1是LFA-1的主要配体。ICAM-1通过一个跨膜结构域而锚着在内皮细胞上，它具有一个较短的胞浆尾，含有5个细胞外免疫球蛋白样结构域，可在被HIV感染的单核细胞和上皮细胞上表达。
美国专利5,891,841(“841专利”)涉及用细胞间粘附分子(ICAM-3)抑制HIV-1所感染的细胞从循环系统迁移至其它部位的方法。根据此“841专利”，对上皮细胞、内皮细胞、和成纤维细胞表面的ICAM-1的诱导可介导淋巴细胞的LFA-1依赖性粘附(第12栏，第48-50行)。LFA-1和ICAM-1互为受体，它们在“841专利”中分别被称为“受体”和“配体”。同前。具体是，“841专利”涉及在HIV诱导的合胞体形成中ICAM-1与LFA-1之间的相互作用。根据“841专利”，LFA-1对ICAM-1的亲和力相对于ICAM-2和ICAM-3为最大(第14栏，第9-16行)。
美国专利5,674,982(“982专利”)涉及抗ICAM-1抗体通过干扰LFA-1与ICAM-1之间的相互作用而降低鼻病毒的感染性的应用。PCT申请WO90/13316A1涉及通过使被HIV感染的白细胞具有与ICAM-1或CD11/CD18家族的一种分子结合的能力而抑制HIV-1感染细胞从循环系统中迁移而出的方法。
这类粘附分子在与细胞结合的病毒或未与细胞结合的病毒的经上皮传播中的作用尚无人提及。此前的方法和组合物都是通过阻断ICAM-1与LFA-1的相互作用而阻止病毒从循环系统迁移至远离最初感染部位的其它部位。ICAM-1，除了与LFA-1相互作用以外，在暴露于HIV的部位或在病毒进入机体的部位的病毒传播中的作用，至今无人提及。
目前需要的是用于在暴露于HIV的部位阻断该病毒经上皮传播的方法和组合物。
发明简述本发明提供了用于阻止HIV经上皮传播至动物的方法、组合物、和制品。现有涉及ICAM-1的方法均是干扰ICAM-1/LFA-1结合和阻止病毒从循环系统，穿过内皮细胞，迁移至机体组织中。本发明涉及在暴露于HIV的部位阻断该病毒的经上皮传播，并阻止HIV感染而不是在发生了感染后治疗感染。
在一个优选实施方案中，本发明提供了在暴露于HIV的部位用ICAM-1激动剂/拮抗剂阻断该病毒经上皮传播的方法。在另一优选实施方案中，对病毒传播的阻断不需要阻断ICAM-1与LFA-1的结合。在另一优选实施方案中，本发明提供了用含有ICAM-1激动剂/拮抗剂的组合物或制品阻断该病毒跨过粘膜表面而经上皮传播的方法，所述粘膜如生殖器粘膜、阴道粘膜、直肠粘膜、口腔粘膜、胃肠道粘膜。本发明还提供了用能产生ICAM-1激动剂/拮抗剂的遗传改造细菌接种粘膜表面的方法。
在另一优选实施方案中，本发明提供了用于阻断HIV经上皮传播的药用组合物，其含有ICAM-1激动剂/拮抗剂及一种可药用载体。在另一优选实施方案中，本发明提供了含有ICAM-1激动剂/拮抗剂和一种基体(substrate)的制品。优选的基体包括宫颈环、避孕套和宫内避孕器。
本发明的其它实施方案和优点将在下文举例说明，并可从这些说明中显而易见，或可通过本发明的实践而领悟。本发明的目的和优点将通过所附权利要求书中具体指出的方法和组合物而实现。
附图简述
图1A-B显示与单核细胞结合的HIV-1Ba-L、与PBL(外周血淋巴细胞)结合的HIVBa-L、以及不与细胞结合的病毒跨过单层上皮细胞的能力。
图2A-B显示被HIV感染的单核细胞随时间的传播(A)和具有不同接种细胞数的情况下的传播(B)。
图3证实，人的宫颈上皮细胞单层提供了一道从单核细胞结合型HIV-1、PBL结合型HIV-1、或非细胞结合型病毒传播非细胞结合型HIV-1的屏障。
图4A-B证实，抗ICAM-1抗体阻断单核细胞结合型HIV-1的传播。当抗ICAM-1抗体针对LFA-1的β亚单位、E-钙依粘连蛋白(cadherin)、CD103时，可阻断单核细胞结合型HIV-1的传播(4A)，同种型对照不能阻断传播(4B)。
图5证实，抗ICAM-1抗体可体内阻止细胞结合型HIV通过阴道传播所致感染。在Hu-PBL-SCID小鼠体内，HIV的阴道传播被抗ICAM-1单克隆抗体彻底阻断。
图6A-B证实，293T细胞不表达LFA-1。既不表达ICAM-1又不表达LFA-1的293T细胞感染了HIV后，所致的HIV经上皮传播可被抗ICAM-1抗体阻断，说明在暴露部位阻止HIV传播不需要ICAM-1与LFA-1的结合。
优选实施方案详述目前绝大多数HIV-1感染是性传播、主要是异性传播所致。虽然机械屏障，如避孕套，可非常有效地阻止性传播，但这种依赖于男性的保护方法通常不被接受或使处于最大危险的妇女无法实施。绝大多数情况下，处于新HIV感染的最大危险的妇女来自发展中国家。然而，HIV-1感染在非洲和东南亚的快速传播已增加了对防止STD传播的预防性干预的最新紧迫需求。
本发明提供了在暴露于人类免疫缺陷病毒的部位使用ICAM-1激动剂/拮抗剂阻断该病毒经上皮传播的组合物和方法。术语“ICAM-1激动剂/拮抗剂”指能阻断或刺激与ICAM-1正常功能相关的事件的化合物或生物分子。术语“暴露部位”指动物机体上暴露于HIV的部分，如生殖器、口腔、直肠、眼组织、耳组织、皮肤等。根据本发明，对HIV传播的阻断无需阻断ICAM-1与LFA-1的结合。
在一优选实施方案中，将ICAM拮抗剂提供至动物的粘膜表面，包括但不限于生殖器、阴道、直肠、口腔或胃肠道的表面。粘膜表面具有通过性接触、母婴传播途径、以及其它机制而接触HIV的潜在部位。ICAM激动剂/拮抗剂可应用于诸如避孕套或宫内避孕器等基体表面，或提供在各种形式，如阴道洗液(vaginal wash)、润滑剂、杀精剂、冲洗剂(douche)、栓剂、母乳添加剂(breast milk supplement)、或婴儿配方食品(infant formula)中。
抗体是多功能的预防性干预手段，特别适用于机体的各种部位，尤其粘膜表面。本发明的抗体可在HIV感染的流行病学中调节ICAM-1的功能。其它激动剂/拮抗剂，如反义核苷酸序列和核酶，也可用于调节ICAM-1的功能。抗体是可在疾病的预防中应用的一种高度特异性杀微生物剂。粘膜抗体尤其有效，因为它们一般通过使病原体脱离上皮而发挥作用。此外，抗体结构的多样性使得能产生一种几乎是无穷尽的全能型抗原结合特异性，这对产生针对具体病原体的特异性杀微生物剂很重要。
术语“抗体”在本文中指人类免疫球蛋白(Ig)、人源化动物免疫球蛋白、或衍生自植物的人源化免疫球蛋白的全部，所述Ig包括但不限于IgG，IgM，IgA，IgE，以及单价片段、二价片段、和多价片段等片段。优选的抗体包括在植物中产生的二价IgG型和多价IgA型人类单克隆抗体(“植物抗体(plantibody)”)。另一种优选抗体是抗人ICAM-1 IgG1。植物抗体系统可轻易地用于产生具有指定特异性的大量抗体。具有特殊化合价、类别的抗体，以及在IgA的情况下含有分泌型成分的抗体，都可在谷类植物中产生。
出于多种原因，分泌型IgA聚合物在植物中的表达要优于更传统的杂交瘤技术。sIgA的产生在植物中是一种单细胞系统，而在哺乳动物产生系统中需要两种不同类型的细胞。植物抗体系统具有一种IgA聚合物支架，可在该支架中插入现有成熟抗体的cDNA。植物抗体与产生并维持在细胞培养中的抗体相比，还具有较高稳定性，且较不易被诱变。能产生抗体的植物比传统的杂交瘤细胞系保存时间长，可使维持成本缩减3-6个数量级。此外，植物抗体可无限增产，即从一棵植物至数千亩植物，并且无需考虑因细胞培养中潜在的病毒污染所带来的安全性问题。
另一类优选的抗体是sIgA，它是粘膜表面(包括阴道和宫颈)的一种常见抗体。该抗体与IgG类抗体在功能上的区别是，大多数吞噬细胞表面缺乏IgA的Fc受体，且sIgA不能通过经典途径固定补体。这些特性降低了sIgA的前炎性潜力，这种潜力是在诸如胃肠道或小支气管等部位，当炎症可能导致功能受损的情况下，一种非常有用的特征。sIgA的Fc受体较少以及补体结合能力较弱使得这类免疫球蛋白不太可能诱导与某些HIV-1特异性IgG相关的感染恶化问题。IgA区别于IgG的另一点是，它只与上皮细胞反应，这种反应通过表达于上皮细胞的basolateral表面的聚合物式Ig受体来介导。IgA二聚体与上皮细胞表面的这些受体结合，这些受体允许该抗体分子，以及与之结合的任何抗原，穿过上皮细胞而不被降解。该受体的一部分在IgA分子脱离上皮细胞后仍与IgA结合，产生IgA的分泌片。聚合物式Ig受体的功能成分在不同物种(包括小鼠和人类)之间高度保守。
在另一优选实施方案中，提供了一种预防性药用组合物，其含有ICAM-1激动剂/拮抗剂及一种可药用载体。“可药用载体”指适用于粘膜表面的载体或赋形剂。可将ICAM-1激动剂/拮抗剂配制在任何合适的载体中，只要拮抗剂和载体相容。拮抗剂的活性应不被载体降低至不再阻断HIV传播的程度。载体可以为水性或非水性，如含醇类或为油性，或它们的组合，还可含有其它表面活性剂、软化剂、润滑剂、稳定剂、染料和活性成分如防腐剂、抗生素、避孕药、杀精剂或药用试剂。所述组合物可以是乳膏、泡沫剂、洗剂、软膏剂、溶液、固体和喷雾剂。
优选的载体适用于阴道、口腔、胃肠道、及直肠。特别优选的载体为粘膜粘着剂。适当的载体可包含有机溶剂、乳化剂、胶凝剂、增湿剂(moisturizer)、稳定剂、湿润剂(wetting agent)、控释剂、多价螯合剂、染料、香料以及在粘膜给药的药用组合物中常用的其它成分。
本发明的组合物可以是能用于阴道的阴道洗液或冲洗剂。含有ICAM-1激动剂/拮抗剂的母乳添加剂和婴儿配方食品优选通过口腔粘膜表面为婴儿提供ICAM-拮抗剂。
固体剂型包括栓剂、粉剂、和颗粒。在固体剂型中，所述组合物可与至少一种惰性稀释剂如蔗糖、乳糖、或淀粉混合且还可包含润滑剂、缓冲剂、以及本领域技术人员已知的其它成分。
在本发明的方法、组合物、以及制品中，ICAM-1激动剂/拮抗剂的实际用量可以变化，以便在暴露于病毒的部位或病毒进入的部位获得具有所需预防性应答的量。相应地，对剂量水平的选择取决于，接触病毒的部位或病毒进入的部位的特点和位置，所需的预防性应答，给药途径，预防作用需要维持的时间以及其它因素。
用于本发明组合物、制品、和方法中的优选的激动剂/拮抗剂是抗ICAM-1抗体。抗体的有效浓度通常为约20-约2000μg/ml，但该浓度可根据具体情况变化。抗ICAM-1植物抗体的用量可达约5-10mg/ml。
本发明的ICAM-1激动剂/拮抗剂可用任何适当的方法给药。优选将ICAM-1激动剂/拮抗剂局部应用于粘膜表面以防止HIV传播。优选使抗ICAM-1抗体包含在一种粘膜粘着剂赋形剂中而运送，该赋形剂能使免疫球蛋白活性维持一至数天。
本发明的激动剂/拮抗剂还可通过能表达抗ICAM-1激动剂/拮抗剂(如抗ICAM-1抗体、抗ICAM-1反义分子、ICAM-1抗原、或核酶)的遗传改造型细菌来运送。“遗传改造型”细菌含有或转染有质粒DNA载体或其它载体，如病毒载体，裸露的DNA或RNA，它们包含编码抗ICAM抗体的核苷酸，抗ICAM反义核苷酸序列，或核酶。优选的遗传改造型细菌是属于目标粘膜(即生殖道、口腔等)表面的正常菌群成员的那些。遗传改造型细菌可用任何适当的重组DNA方法或本领域技术人员已知的其它方法产生。
在另一优选实施方案中，提供了含有一种基体以及一种ICAM-1激动剂/拮抗剂的制品。术语“支持物”指能浸透或涂布ICAM-1激动剂/拮抗剂并将ICAM-1激动剂/拮抗剂运送至机体的粘膜表面的物品，如海绵，避孕套，隔膜，宫内避孕器，或宫颈环。例如，避孕套可通过喷射方式将所述拮抗剂涂布在其表面，或在生产过程中用领域内已知的方法将所述拮抗剂浸透在避孕套中。婴儿奶嘴也可用类似的方法涂布。在另一优选实施方案中，将抗ICAM-1抗体置于一种缓释产品中来运送，如浸透了该抗体的宫颈环。
由于HIV主要通过性活动传播，本发明的一个优选方法包括在性活动期间或之前使本发明的激动剂/拮抗剂组合物与阴道上皮或其它粘膜表面接触。优选使用涂布或浸透了ICAM-1激动剂/拮抗剂的避孕套等避孕用品，或局部用药组合物如胶质或泡沫剂时，所用量足以防止HIV传播和感染。当希望强化避孕效果时，可将所述组合物与一种杀精剂联合使用。
在本发明的又一实施方案中，可将ICAM-1激动剂/拮抗剂固定在一种固体(如塑料、或类似材料)的表面，以便运送至暴露于HIV的部位。适当的塑料有，聚氯乙烯、聚乙烯、聚氨基甲酸酯或硅以及常用于容器和奶瓶的其它物质。奶瓶，包括配有奶嘴的奶瓶，或其它容器以及能装生物流体的导管可用足量的ICAM-1激动剂/拮抗剂涂布，其量足以防止或阻断与细胞结合的HIV的传播。所述激动剂/拮抗剂还可在塑料聚合物的聚合期间掺入，然后以控释形式从表面浸出。
具体ICAM-1激动剂/拮抗剂和组合物阻断HIV经上皮传播的能力可在跨孔(transwell)培养系统中评估。优选的跨孔系统包含一种插件，其能将24孔板的孔通过一种可拆式网格分隔为上下两个室，该网格含有直径5m的孔。将人类宫颈上皮细胞系如ME180(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)在该可拆式网格上培养至长满。使长满的上皮细胞形成一道屏障，该屏障不可通透C14-菊粉，而且相对于与外周血淋巴细胞(PBL)结合的病毒，可选择性通透与巨噬细胞结合的病毒。穿过这道上皮障碍而传播的HIV将出现在跨孔系统的下层小室中。因此，可评估ICAM-1激动剂/拮抗剂阻断HIV跨过这道支持已长满之上皮细胞屏障的网格而传播的能力。该跨孔系统允许快速而直接地检查具有不同特异性的Mab阻断与细胞结合的HIV-1跨过上皮细胞单层的能力。这类系统也可用于比较抗体类别和同种型之间的相对效力。
ICAM-1激动剂/拮抗剂还可在具有十分接近于真实传播状况的动物模型体内进行评估。例如，Hu/PBL-SCID小鼠阴道传播模型是研究HIV-1传播的极好模型。移植到这种小鼠体内的人类PMBC细胞在感染时(细胞移植的8-10天后)，其活化状态类似于人的外周血单核细胞(PBMC)中所见，而明显区别于通常用于培养HIV的组织培养中所见。此外，对传播至Hu-PBL-SCID小鼠的变体的种系发生分析显示，病毒传播不是随机的，具有巨噬细胞向性的病毒变体亚组被优选传播。这种传播模式与某些人类中的完全一样，在这些人体内，只有非常有限范围的巨噬细胞向性病毒从供体传播至受体。可将ICAM-1激动剂/拮抗剂应用于已暴露给HIV的Hu-PBL-SCID小鼠，以评估ICAM-1激动剂/拮抗剂阻断HIV体内传播的能力。
本发明的教导在具体问题或环境中的应用是在本领域技术人员通过本文之教导而能实施的范围之内。本发明之产物及其应用方法的其它实例见于以下实施例。
实施例1分离无细胞的HIV以及被HIV感染的外周血淋巴细胞和单核细胞HIV-1Ba-L(Advanced Biotechnologies Inc.，Columbia，MD)是HIV的一种巨噬细胞向性、NSI、CCR5-应用型变体，其市售产品为1.0ml等份试样(1×10650％组织培养感染剂量(TCID50)/ml)且保存在液氮中。应用于培养物之前将病毒原液新鲜解冻。
将已经白细胞分离术处理过的血液在Ficoll Hypaque(Pharmacia，Piscataway，NJ)上离心而分离人的PBMC。将总PBMC用添加了100U/ml青霉素/100mcg链霉素、10ng/ml庆大霉素、和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640(培养基和所有添加物均来自Life Technologies，Grand Island，NY)稀释成1×107/ml，然后铺板于75或150cm2组织培养烧瓶(Corning ScientificProducts，Inc.，Cambridge，MA)中。在培养的最初12小时内，将细胞重悬在添加了20％热灭活的FCS(56℃45min，Gemini Bio-Products，Inc.Calabasas，CA)和10％热灭活的A/B型人类血清(HS；Nabi，Boca Raton，FL)的上述RPMI-1640(后文称cRPMI)中。收集单核细胞。弃去未粘附的PBMC；将粘附的细胞用冷HBSS(Life Technologies)从烧瓶中取出。通过测定表面抗原CD14的表达(FITC-标记的抗人CD14抗体，My-4；Coulter Immunotech，Hialeah，FL)，确定粘附细胞中＞95％是单核细胞。将单核细胞洗涤并以5×106/ml与1×103TCID50的HIV-1Ba-L重悬于25cm2烧瓶(Corning ScientificProducts，Inc.)中的5ml cRPMI-10％FCS或cRPMI-10％HS中，于37℃、5％CO2中培养。24小时后取出病毒培养液，细胞用cRPMI洗涤一次，添加新鲜的cRPMI-10％FCS或cRPMI-10％HS。在感染后(pi)第3和第7天给培养物添加新鲜培养基。用冷HBSS或0.02％EDTA(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)从烧瓶中取出单核细胞，用于在感染后第10天进行的实验。
将PBL(外周血淋巴细胞)在添加了PHA(5μg/ml，Sigma)的cRPMI-10％FCS中以2×106/ml的密度重悬48小时。用1×103TCID50HIV-1Ba-L感染后，用培养单核细胞的类似方法培养PBL，区别在于PBL培养基含10U/mlIL-2(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。单核细胞和PBL受HIV-1感染的程度可通过用HIV-1 gag-特异性引物(正向引物5’-GCG-AGA-GCG-TCA-GTA-TTA-AGC-GG-3’，和反向引物5’-TCT-GAT-AAT-GCT-GAA-AAC-ATG-GG-3’)以及如前述的相应标准和对照进行有限稀释PCR来确定。PCR产物可通过在1％琼脂糖凝胶上电泳来观察。
无细胞的病毒衍生自cRPMI-10％FCS或cRPMI-10％HS中被HIV-1Ba-L感染的单核细胞或被HIV-1Ba-L感染的PBL。离心并滤过0.2μm的注射器滤膜(Millipore，Bedford，MA)使上清不含细胞。无细胞的病毒可通过HIV p24ELISA(Dupont NEN，Boston，MA)定量，并通过与来自HIV阴性健康供体的PBMC共培养来确定TCID50。
实施例2人类宫颈上皮细胞跨孔培养将自发转化的人类宫颈上皮细胞系ME-180(ATCC，Rockville，MD)培养在75cm2烧瓶中的cRPMI-10％FCS中，每3天通过用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Life Technologies)处理细胞而常规传代。将ME-180细胞以2×105/0.1ml cRPMI-10％FCS或-10％HS/5.0μm铺在12mm直径的跨孔插件(insert)(Corning Scientific Products，Inc.)上。将跨孔中的ME-180细胞维持在37℃，5％CO2下。每2-3天换培养基。7天后，细胞在跨孔插件上形成极化的完整单层，这可利用欧姆计(ohmmeter)(Millipore)监控横跨上皮的阻抗和用荧光染料标记的抗ZO1抗体染色来证实，其中所述ZO1是一种在上皮细胞紧密连接处发现的蛋白(20)(1∶50稀释，Zymed，San Francisco，CA)。插件上的ME-180单层随时可用于在培养至第7-第10天时进行实验。
实施例3经上皮迁移和HIV-1的传播如Bomsel所述进行经上皮迁移试验，有几处改动。简短说，将1×106被HIV-1Ba-L感染的单核细胞、1×106被HIV-1Ba-L感染的PBL、或单核细胞或PBL培养上清中的无细胞HIV-1添加至上皮细胞单层的顶侧(apical side)。进行时间过程的分析，在将已感染的细胞添加至插件后的1-48小时之间收集顶侧和基侧(basal side)的培养基。在24小时的时候横跨单层的传播接近最大值，选此时间点进行所有后续实验。单核细胞和PBL的活力通过台盼兰(Sigma)排除法来评估，然后将细胞添加至跨孔中，传播24小时后，结果总是＞90％。用HIV-1 p24抗原ELISA试验(Dupont NEN)定量顶侧和基侧上清液中HIV-1 p24抗原的量(灵敏度为12.5pg/ml-350pg/ml)。
实施例4
传播阻断研究将小鼠抗人ICAM-1抗体(20μg/ml；及其稀释液；HA58(IgG1)，Pharmingen)，抗人E-钙依粘连蛋白抗体(20μg/ml；67A4(IgG1)CoulterImmunotech，和E4.6(IgG1))、抗人CD103抗体(20μg/ml；2G5(IgG2a)，CoulterImmunotech，和αE7-1(IgG2a)、αE7-2(IgG1)和αE7-3(IgG1))、以及抗人CD18抗体(20μg/ml；L130(IgG1)，Becton Dickinson)、或它们各自的同种型对照添加至1×106被HIV感染的单核细胞或被HIV感染的293T细胞(含或不含ICAM-1)，然后将它们迅速添加至ME-180跨孔培养中。根据AIDS ClinicalTrials Group(ACTG)Antibody Selection Working Group为证实某种抗体在低至体内可获得的浓度(20-25μg/ml)时的效力而建立的标准，选择抗体的最高浓度(20μg/ml)。37℃，5％CO2下培养24小时后，收集顶侧和基侧的上清液。用ELISA定量HIV-1p24抗原。
实施例5与单核细胞结合的HIV-1比与PBL结合的HIV-1或无细胞病毒更有效地跨过人的宫颈上皮细胞HIV-1感染的单核细胞、HIV-1感染的PBL、或衍生自单核细胞或PBL培养的无细胞的病毒(cfv)，将它们各自的cRPMI-10％FCS溶液，置于含有ME-180上皮细胞的铺满单层的跨孔培养物的顶端(apical)小室中。评估与单核细胞结合的、与PBL结合的、或无细胞的HIV-1跨过完整的人类宫颈上皮单层的程度(图1A)。(cRPMI-10％FCS培养基(n＝8个供体，比较单核细胞和PBL以及PBL和cfv之间ap＜0.05；比较单核细胞和cfv之间bp＜0.001))。结果表示为来自ME-180跨孔培养物的基底(basal)上清液和各种接种物的HIV-1 p24抗原浓度(pg/ml)。
与单核细胞结合的病毒比与PBL结合的病毒跨过宫颈上皮的效力高约5倍。衍生自任一种细胞类型的无细胞型病毒不能有效跨过该上皮单层，且通常在p24 ELISA试验中低于可检测的极限。
为明确无细胞的HIV-1是否能被Kage及其同事提到的FCS(胎牛血清)中的糖蛋白抑制而不能跨过上皮单层，用已在含10％HS的cRPMI中培养的被HIV-1感染的单核细胞或cfv(无细胞的病毒)进行研究。在这些实验中，培养在cRPMI-10％HS中的单核细胞结合型HIV-1，比培养在cRPMI-10％FCS中的单核细胞结合型病毒更有效地跨过该上皮，也比培养在cRPMI-10％FCS或cRPMI-10％HS中的cfv更有效(图1B)(cRPMI-10％FCS或HS培养基(每一实验中n＝3，比较单核细胞(mono)FCS和mono HS之间ap＜0.5，比较cfv FCS和cfv HS之间bp＜0.05，比较mono HS和cfv HS之间cp＜0.005))。相对于在10％FCS中测得的经上皮传播，培养在cRPMI-10％HS中的cfv能跨过完整上皮，但水平显著低于与细胞结合的病毒(P＜0.005)(图1B)。
在多个时间点评估顶部上清液中HIV-1 p24抗原，以便确定病毒从接种至上皮顶侧的被感染的单核细胞或PBL中释放出的程度。培养在FCS或HS中的被HIV-感染的单核细胞和被HIV-感染的PBL，它们的上清液中p24抗原的浓度在整个感染期间保持彼此相当的水平，未出现显著差异(数据未显示)。
我们发现，在基底(basilar)上清中测得的HIV-1(用p24浓度表示)当与未被感染的单核细胞或受PHA刺激的PBL混合培养时具有感染性，随时间的推移，培养物中p24抗原的量增加(数据未显示)。
实施例6单核细胞以时间-依赖性且剂量-依赖性方式跨过宫颈上皮制备带有ME-180的跨孔培养物，将cRPMI-10％HS中1×106个被HIV-感染的单核细胞添加至该上皮的顶部侧以分析经上皮传播的动力学。被感染的单核细胞早在4小时的时候就可以测到经上皮的迁移和/或经上皮的HIV-1传播(图2A)，伴有基底p24水平的升高，直至48小时达到顶峰。类似地，将1×106个细胞，或其5倍稀释液，添加至该上皮的顶侧，取基底侧上清液样品检测p24抗原的存在以确定能在上皮的基底侧检测到病毒所需的最小细胞接种量。当应用5,000个被HIV感染的单核细胞时，在基底培养基中一直能检测到HIV p24抗原。如LD-PCR所测，其中1-5％的细胞被HIV-1感染(数据未显示)，因此这意味着少至500个被感染细胞就可持续传播HIV-1。在跨孔的顶侧加入少至1,000个的单核细胞(感染率同样为1-5％)，就可在基底侧上清液中检测到p24(图2B)。
图2所示实验使用被HIVBa-L-感染的单核细胞在cRPMI-10％HS中的溶液进行。结果表示为基底上清中HIV-1 p24抗原的浓度(pg/ml)。图中分别显示了随时间变化的实验(n＝4)和随接种量变化的实验(n＝2)。+基底p24介于100-1,000pg/ml之间；++基底p24介于1,001-5,000pg/ml之间；+++基底p24介于5,001-30,000pg/ml之间；-基底p24低于检测的极限(12.5pg/ml)。
实施例7完整的人类宫颈上皮限制了HIV-1的传播此前曾显示，位于跨孔插件中的人类宫颈上皮细胞单层形成了一种完整的极性表面，并提供了一种针对无细胞的HIV-1的明确屏障。以下实验用于确定宫颈上皮单层和将跨孔小室分隔开的膜是否能提供一种限制HIV-1经上皮传播的屏障。为此，测定跨孔下层小室培养基中无ME-180存在时的p24抗原浓度。与由HIV-感染的单核细胞或HIV-感染的PBL所传播的基底HIV-1 p24抗原的不同水平(如图1所示)相比，在没有宫颈上皮细胞的情况下，下层小室的跨孔培养物中测得的p24抗原的量在单核细胞结合型HIV-1、PBL-结合型HIV-1、或无细胞型病毒之间无显著差异(p＞0.005)(图3)。这些数据表明，膜的组成和孔径大小不能限制HIV-1的传播，反而是上皮细胞层的紧密连接以及被HIV-感染的细胞与上皮之间的假定相互作用决定了经上皮传播HIV-1的程度。
图3所示数据分别表示为，插件膜上有或没有ME-180上皮细胞时，跨孔培养物的基底侧或下层小室上清液中的p24抗原(pg/ml)。图中还显示了另一个试验(n＝3)，有或没有ME-180的接种组之间的比较p＜0.05，没有ME-180的接种组之间的比较p＞0.05。
实施例8抗ICAM-1抗体阻断单核细胞结合型HIV-1的传播为了检查被HIV感染的单核细胞与上皮细胞之间的粘附作用是否经上皮迁移和HIV-1传播的关键，将针对数种粘附分子的抗体添加至跨孔培养物中。在被HIV感染的单核细胞以及培养中剩余的细胞进行实验的同时添加针对ICAM-1、CD18、E-钙依粘连蛋白、或αE-β7整合蛋白(CD103)的抗体(1-20μg/ml)。所选抗体能靶向已显示参与免疫细胞与上皮细胞之结合的特异性配体-受体相互作用。
ICAM-1在被HIV感染的单核细胞和上皮细胞上表达。抗ICAM-1抗体阻断单核细胞结合型HIV-1的传播，如上皮细胞单层基底侧的p24抗原量所示(图4A)。CD18分子是淋巴细胞功能相关性抗原LFA-1的β亚单位，其结合ICAM-1并参与HIV诱导的合胞体形成。抗CD18抗体及其同种型对照不能阻断HIV-1的经上皮传播(图4A)。
为了测定对经上皮传播的抑制作用是否特异性针对ICAMLFA-1相互作用，检验了抗E-钙依粘连蛋白和CD103的抗体在跨孔系统中抑制HIV-1传播的能力。E-钙依粘连蛋白表达在上皮细胞表面，其配体CD103表达在单核细胞以及一个PBL亚类的表面。抗E-钙依粘连蛋白抗体、抗CD103抗体、以及它们各自的同种型对照不能阻断HIV-1的经上皮传播(图4，A和B)。经测定，被HIV感染的单核细胞与这些实验中使用的抗体一起保温不改变从被感染细胞释放出的病毒量，如保温24小时后顶部上清液中所测(数据未显示)。将抗E-钙依粘连蛋白(20mg/ml)、抗CD103(20mg/ml)、抗CD18(LFA-1)(20mg/ml)、鼠IgG1(20mg/ml)和鼠IgG2a(20mg/ml)抗体与被感染的单核细胞一起添加至跨孔培养物中，对HIV-1的经上皮传播没有影响。图4的结果表示为基底侧上清液中的HIV-1 p24抗原，p＜0.05。
实施例9抗ICAM-1 MAB抑制HIV-1在HU-PBL-SCID小鼠中的阴道传播单克隆抗体在Hu-PBL-SCID小鼠中可提供对抗HIV-1的保护作用，如此前的三项研究所示。但是，这些研究无一涉及抗ICAM-1抗体或提到对抗病毒之阴道传播的保护作用。在所有例子中，Mab可有效对抗携有其所针对的特异性表位的病毒，但不能对抗异源HIV-1变体而提供交叉保护。
如表1所示，阴道中应用抗ICAM-1的Mab彻底阻断了SCID小鼠模型中细胞结合型HIV-1的阴道传播。结果具有统计学显著性(p＝0.03，单侧Fisher真实性(exact)检验；p＝0.06，双侧Fisher真实性检验)。
表1
实施例10对细胞结合型HIV的经上皮传播的阻断不需要阻断ICAM-1与LFA-1的结合对并不在其表面表达ICAM-1的293T细胞进行转染，以确定对细胞结合型HIV的经上皮传播的阻断是否需要阻断ICAM-1与LFA-1的结合。结果表明，被感染的293T细胞能够跨过上皮细胞屏障传播HIV-1，而这种传播(如跨孔系统的基底小室中HIV-1 p24抗原的浓度所测)可被抗ICAM-1抗体阻断(表2)。
表2
*p＜0.001，比较p24浓度的差异由于ICAM-1不在293T细胞表面表达(数据未显示)，抗ICAM-1抗体阻断传播的能力必须通过与ME180宫颈上皮细胞系(已知其表达ICAM-1)表面的ICAM-1的相互作用。流式细胞仪分析表明，293T细胞不表达LFA-1(图6A-B)。由于293T细胞缺乏LFA-1，抗ICAM-1抗体不能通过阻断ICAM-1与其对应受体LFA-1之间的相互作用而阻断传播。
实施例11抗ICAM-1 MAB不引起阴道炎性应答有一种潜在的担心是，阴道内给与能针对免疫应答中起作用的配体的抗体可能激发局部炎性应答。为了了解该问题，我们每天2次，连续14天在正常BALB/c小鼠阴道内给与20mg/ml抗小鼠ICAM-1的IgG2a型Mab、20mg/ml无关的IgG2a型Mab、或5mg伤寒沙门菌(Salmonella typhimirium)脂多糖。抗ICAM-1 Mab在所处理的小鼠阴道上皮中未显示毒性。
实施例12MAB均未从阴道内给药处被吸收至血清中Mab均未从阴道内给药处被吸收至血清中。这一点可能使针对宿主抗原的Mab具有潜在的临床应用意义。三只SCID小鼠每天2次接种20mg正常小鼠IgG，共10天。在第4天、第7天、和第10天注射后的刚刚2小时后，用灵敏度为0.1mg/ml的ELISA试验分析小鼠血清中小鼠Ig浓度的增加。小鼠Ig的基线值范围为0-4mg/ml。在任何一只小鼠中，在所分析的任何时间点，均未观察到小鼠抗体浓度的增加。
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上述说明和实施例仅为举例说明实现本发明的目标、特征和优势的优选实施方案，并非意图将本发明限制在该范围内。落在后续权利要求书的精神和范畴之内的本发明任何修饰可以被认为是本发明的部分。
权利要求
1.一种阻断HIV经上皮传播至动物体内的方法，其包括在所述动物的暴露于所述HIV的部位处提供一种抗ICAM-1抗体。
2.权利要求1的方法，其中所述抗ICAM-1抗体是植物抗体。
3.权利要求1的方法，其中所述抗ICAM-1抗体是抗人ICAM-1 IgG1抗体。
4.权利要求1的方法，其中所述ICAM-1抗体的量足以阻断HIV经上皮传播。
5.权利要求4的方法，其中所述量为约20μg/ml-约1000μg/ml。
6.权利要求4的方法，其中所述量为约5mg/ml-约10mg/ml。
7.权利要求1的方法，其中所述动物是哺乳动物。
8.权利要求1的方法，其中所述动物是人类。
9.权利要求1的方法，其中所述抗ICAM-1抗体所用剂型选自乳膏、泡沫剂、口服液、固体、喷雾剂、阴道洗液、阴道冲洗剂、栓剂、母乳添加剂、和婴儿配方食品。
10.权利要求1的方法，其中所述抗ICAM-1抗体提供在一种载体中，该载体含有选自下组的物质润滑剂、表面活性剂、胶质、有机溶剂、乳化剂、胶凝剂、增湿剂、稳定剂、湿润剂、控释剂、多价螯合剂、染料、和香料。
11.权利要求1的方法，其中所述对HIV与细胞结合后传播的阻断不需要阻断ICAM-1与LFA-1的结合。
12.权利要求1的方法，其中所述暴露位点为粘膜表面。
13.权利要求12的方法，进一步包括在所述粘膜表面接种已经得到遗传改造的细菌，其中所述细菌能产生抗ICAM-1抗体。
14.权利要求12的方法，其中所述粘膜表面选自生殖器、阴道、直肠、口腔、和胃肠道的表面。
15.一种阻断HIV与细胞结合后经上皮传播的方法，其包括在动物的阴道上皮上提供一种抗ICAM-1抗体，其中所述对HIV与细胞结合后传播的阻断发生在所述动物的阴道上皮处。
16.一种能在暴露于HIV的经上皮位点处阻断所述HIV经上皮传播的组合物，其包含一种抗ICAM-1抗体和一种赋形剂，其中所述抗ICAM-1抗体的量足以阻断HIV经上皮传播。
17.权利要求16的组合物，其中所述量为约20μg/ml-约1000μg/ml，
18.权利要求16的组合物，其中所述抗ICAM-1抗体是植物抗体。
19.权利要求16的组合物，其中所述抗ICAM-1抗体是抗人ICAM-1IgG1抗体。
20.权利要求18的组合物，其中所述植物抗体的量为约5mg/ml-约10mg/ml。
21.权利要求16的组合物，其中所述组合物为母乳添加剂。
22.权利要求16的组合物，其中所述组合物为婴儿配方食品。
23.权利要求16的组合物，其中所述组合物为阴道洗液。
24.权利要求16的组合物，其中所述组合物为口服液。
25.权利要求16的组合物，其中所述组合物为栓剂。
26.权利要求16的组合物，其中所述组合物为抗ICAM-1抗体，而所述赋形剂为一种可药用的载体。
27.权利要求26的组合物，其中所述赋形剂选自润滑剂、表面活性剂、胶、有机溶剂、乳化剂、胶凝剂、增湿剂、稳定剂、湿润剂、控释剂、多价螯合剂、染料、和香料。
28.权利要求26的组合物，其中所述赋形剂为粘膜粘着剂。
29.一种用于阻断HIV与细胞结合后经上皮传播的制品，其包括一种基体和一种抗ICAM-1抗体。
30.权利要求29的制品，其中所述抗ICAM-1抗体浸透在所述基体中。
31.权利要求29的制品，其中所述抗ICAM-1抗体涂布在所述基体表面。
32.权利要求29的制品，其中所述基体选自海绵、避孕套、宫内避孕器、宫颈环和隔膜。
33.权利要求29的制品，其中所述基体含有一种避孕用品。
全文摘要
本发明提供了用ICAM－1激动剂/拮抗剂阻断HIV经上皮传播的方法，组合物和制品。所述ICAM－1激动剂/拮抗剂在暴露至病毒的位点阻断病毒传播。对病毒传播的阻断不需要阻断ICAM－1对LFA－1的结合。所述ICAM－1激动剂/拮抗剂可应用于粘膜表面，避孕用品表面或内部或口服液如母奶添加剂和婴儿配方食品中。
文档编号A61K9/08GK1402797SQ00811362
公开日2003年3月12日 申请日期2000年6月23日 优先权日1999年6月24日
发明者理查德·B·马卡姆, 克里斯腾·V·卡纳 申请人:约翰·霍普金斯大学