含伴刀豆蛋白a的复合移植体,其制备方法及应用的制作方法

专利名称：含伴刀豆蛋白a的复合移植体,其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明总地涉及组织工程学和再生医学，特别是涉及含伴刀豆蛋白A的复合移植体，其制备方法及其在治疗因各种原因导致的软骨组织损伤中的应用。
超过关节软骨生理耐受能力的撞击、剪切、扭曲和摩擦等外力均可导致关节软骨或其它永久软骨的机械损伤。由于成年哺乳动物的关节软骨缺乏直接血液、淋巴及神经供应，加之其代谢效率很低，所以成熟的关节软骨组织一旦受到损伤，将很难以自然修复。一般说来，软骨再生主要依赖于活的软骨细胞的存在。在软骨再生过程中，首先由相似于成纤维细胞的某些细胞增殖形成幼稚组织，然后由这些细胞分化成软骨母细胞并合成软骨基质。分化并增殖的细胞被埋入软骨隐窝内以形成静止的软骨细胞。另一方面，软骨细胞不仅自然修复十分缓慢，而且修复的组织还常常随时间的推移而发生退行性变化。因此，修复因创伤、炎症及各种退行性病变和先天性疾病等引起的关节软骨损伤，一直是组织工程学和再生医学领域里的一个难以解决的问题。
近年来，随着关节镜技术在临床上的广泛应用和运动医学的发展，已相继出现并在临床上使用了许多关节软骨损伤的修复技术。例如，这些技术包括(1)人为损伤软骨下骨并暴露骨髓腔以促进软骨再生；(2)利用骨—软骨移植(包括自体和异体移植)技术修复软骨组织；(3)通过软骨膜或骨膜移植再生软骨组织；(4)局部应用生长因子(如IGF、bFGF、PDGF、TGF-β、HGF、CGF及BMP等)促进软骨组织原位再生和修复。
组织工程学是二十世纪九十年代逐步建立并发展起来的一门综合学科。它应用工程学的基本原理和方法，预先在体外构建一个具有生物学活性的移植体，然后植入哺乳动物体内，以修复组织缺损，代替组织或器官的部分或全部功能，或作为一个体外装置，暂时替代器官的部分功能，达到延长包括人在内的哺乳动物生命，提高生存质量的目的。组织工程的基本要素是活的细胞、可供细胞完成生命周期的支架材料以及细胞与支架材料之间的相互作用。目前已开展的组织工程研究涉及软骨、骨、肌腱、肌肉、血管、皮肤、肝脏、胰脏、肾脏及血管等组织或器官。其中，软骨组织因细胞成分单一、支架材料来源充分，所以有关软骨组织修复及其代用品的研究在组织工程领域相对起步较早。
利用组织工程技术修复软骨缺损的基本步骤包括体外培养并增殖少量所需的特异性组织细胞；将所得到的活细胞移植到预制备的基质材料中继续培养；待细胞与基质材料充分结合后，将所得到的结合体植入体内特定部位，以其代替受损组织或器官并在原位发挥这些组织或器官的功能。
软骨细胞是目前软骨组织工程的主要细胞来源。可联合使用机械分离和酶(如胶原酶)消化方法从软骨组织中制备软骨细胞培养物。软骨细胞单层(二维)培养方法的缺陷在于多次传代细胞常常出现反分化现象。Benya等人(Benya and Shaffer，Cell 30373，1982)首次利用琼脂糖凝胶基质成功地完成了软骨细胞的三维培养。他们的研究还证明，在这种三维培养系统中，不仅可有效地保留体外培养的软骨细胞的固有表型，而且可使已出现反分化的细胞回复其高分化状态和细胞表型。此后，其它一些研究者也相继利用胶原蛋白凝胶(Yasui et al.，Exp.Cell Biol.5092，1982)和海藻糖凝胶(Hanselman et al.，J.Cell Sci.10717，1994)以及多聚2-羟乙基甲基丙烯酸盐含水凝胶(Reginate et al.，Arthritis.Rheum.37(9)1338，1994)培养得到了具有稳定表型和典型形态特征的软骨细胞或组织。为了克服三维培养系统存在的难以大量回收增殖细胞的问题，也已将微载体悬浮培养系统引入哺乳动物细胞的体外培养。研究证明，使用微载体悬浮培养技术，特别是使用II型胶原蛋白微载体培养软骨细胞，不仅可显着提高细胞增殖速度，而且可长时间保持细胞表型及生理功能(Freed et al.，Biomaterials 51257，1993；Frondoza et al.，Biomaterials 17879，1996)。
在组织工程中，三维支架起到临时细胞外基质作用，为细胞提供附着、增殖、分化和代谢场所。更具体地说，在软骨组织工程中，软骨细胞以其所附着的三维支架为模板发生并形成新的软骨组织。软骨组织工程的支架材料可以是天然或合成来源的。其中纤维蛋白、胶原蛋白等天然生物材料是软骨组织工程研究中最常也是最早使用的支架材料。由于这些材料本身就是细胞外基质的组成成分，故具有良好的组织兼容性，并具有软骨细胞生长与分化状态良好和易于形成相应的软骨组织等优点。但由于材料来源的生物学差异性，而致使目前尚难以实现大批量生产。与天然材料相比，人工合成的材料具有可随意控制分子量、降解时间和疏水性，以及具有良好的组织兼容性等优点，所以也常被用作组织工程的支架材料。目前常用的合成材料包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酯(PGA)或它们的共聚物。
自Chesterman等人首次利用体外培养的软骨细胞修复关节软骨缺损以来，一些研究者相继利用不同的基质材料和不同来源的软骨细胞进行软骨组织工程和软骨修复实验研究，已取得了某些成功的经验，并为进一步的深入研究和临床应用提供了有益的探索。
颜炜群等人(Weiqun Yan et al.，J.Biol.Chem.272(12)7833-7840，1997；Weiqun Yan et al.，J.Biol.Chem.265(17)10125-10131，1990)的研究发现，淋巴细胞有丝分裂原伴刀豆蛋白A(ConA)可抑制软骨细胞的DNA合成，并促进细胞高分子硫酸化蛋白糖(PG)、碱性磷酸酶(AKPase)和维生素D3受体的合成，及细胞外基质中钙的摄入和沉积。观察结果表明，ConA对体外培养的静止软骨细胞的成熟化和终末分化具有显着的特异性促进作用。然而，ConA对在体软骨细胞生长和软骨组织生长的生物学作用，迄今尚未见报导。
本发明人在上述现有技术研究成果的基础上，制备了含淋巴细胞有丝分裂原伴刀豆蛋白A(ConA)的胶原蛋白凝胶，并以其作为修复哺乳动物软骨组织损伤的移植体。将所说的移植体植入哺乳动物关节内软骨组织损伤部位，观察4～20周后，结果令人惊奇地发现，不仅受损伤的软骨组织得以充分修复，而且再生的软骨组织在组织学和生理、生化特征上基本接近或相同于正常软骨组织，从而完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于修复哺乳动物软骨组织损伤的移植体，特征在于所说的移植体基本上是由胶原蛋白基质和均匀地分散在所说基质中的凝集素组成的。
根据本发明的一个优选实施案方案，其中所说的植物凝集素是伴刀豆蛋白A或其衍生物、Lentil、WGA、PHA-L或PHA-P，以及UEA或它们的衍生物或片段。
根据本发明的一个优选实施案方案，其中所说的植物凝集素是伴刀豆蛋白A或其衍生物或片段。
根据本发明的一个优选实施案方案，其中所说的伴刀豆蛋白A衍生物选自由一个、二个、四个、八个或十六个分子量为26KDa的亚单位构成的单体、二聚体、天然存在形式的四聚体、八聚体和十六聚体伴刀豆蛋白A，以及其一个或多个亚单位结构的侧链被选自琥珀酸、唾液酸的有机酸或选自烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、酯基、羧基或羟基的脂族或芳族基团取代的衍生物。
根据本发明的一个优选实施案方案，其中所说的胶原蛋白是胶原蛋白I或II。
根据本发明的一个优选实施案方案，其中所说的胶原蛋白是胶原蛋白II。
根据本发明的一个优选实施案方案，其中所说的胶原蛋白是天然或合成来源的。
根据本发明的一个优选实施案方案，其中所说的胶原蛋白是人、牛、马、羊或猪来源的。
根据本发明的一个优选实施案方案，其中所说的胶原蛋白是人来源的。
根据本发明的一个优选实施案方案，其中所说的移植体中伴刀豆蛋白A的含量约为1至100μg/ml胶原凝胶基质。
根据本发明的一个优选实施案方案，其中所说的胶原蛋白基质可以是胶原蛋白与甲壳素的0.1∶1至10∶1(w/w)混合物。
根据本发明的一个优选实施案方案，其中所说的移植体还可含有一种或多种选自碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍生的生长因子、转化生长因子β、肝细胞生长因子、软骨细胞生长因子和骨形成蛋白的细胞生长因子。
本发明的另一个目的是提供制备如上限定的移植体的方法，该方法包括(1)提供含有培养液的适当浓度的胶原蛋白基质；(2)在所说的溶液中加入适当浓度的植物凝集素，并混合均匀；(3)将所得到植物凝集素-胶原蛋白混合液于大约37℃下保温约30分钟，以得到半固态凝胶；(4)必要时冻干所说的凝胶。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的凝集素是伴刀豆蛋白A或其衍生物。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的胶原蛋白基质还可以是胶原蛋白与甲壳素的0.1∶1至10∶1(w/w)混合物。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的伴刀豆蛋白A或其衍生物的浓度为1至100μg/ml。
本发明的再一个目的是提供如上限定的移植体在修复哺乳动物软骨组织损伤中的应用。


图1A和1B分别显示在兔膝关节软骨组织损伤部位植入含有50μg/ml ConA的移植体8周后的局部组织的40×(图1A)和100×(图2B)显微照片。其中箭头A指示正常软骨组织；箭头B指示修复的软骨组织。
图2A和图2B分别显示在兔膝关节软骨组织损伤局部植入含ConA(图2A)和bFGF(图2B)的移植体12周后的局部组织显微照片(EB，100×)。其中箭头A指示正常软骨组织；箭头B指示修复的软骨组织。
一般说来，软骨组织在由静止期向成熟期转变过程中，主要表现有下列三个方面的形态与生物学特征(1)细胞由扁平形状逐渐变成圆形；(2)细胞增殖速度逐渐减慢或停止增殖；(3)细胞合成并在细胞外基质中大量堆积高分子量蛋白多糖。颜炜群等人(Weiqun Yan et al.，J.Biol.Chem.272(12)7833-7840，1997；Weiqun Yan et al.，J.Biol.Chem.285(17)10125-10131，1990；Weiqun Yan et al.，J.Bone Miner.Metab.1377-80，1995)以前的体外实验发现，在离体条件下，伴刀豆蛋白A(ConA)可抑制培养的软骨细胞的DNA合成，同时促进软骨细胞蛋白多糖和碱性磷酸酶的合成。他们的研究还表明，ConA及某些其它植物凝集素可强有力的诱导静止的软骨细胞发生上述细胞形态学和组织化学改变，并证明ConA等植物凝集素具有促进静止的软骨细胞成熟化、终末分化和钙化的生物学活性。因此推测有可能将植物凝集素，特别是ConA作为一种哺乳动物软骨组织的再生诱导剂，用于诱导和促进软骨组织损伤的修复。
因此本发明提供了一种基本上以胶原蛋白凝胶为基质，并含有适当浓度的植物凝集素特别是伴刀豆蛋白A的移植体，其制备方法及在治疗哺乳动物因各种原因导致的软骨组织损伤中的应用。
根据本发明，作为软骨组织再生诱导剂的植物凝集素可以是任何一种植物凝集素，包括但不只限于天然或合成来源的ConA、Lentil、WGA、PHA-L和PHA-P，以及UEA(I或II)，但其中特别优选的是ConA。伴刀且蛋白A(ConA)作为一种已知的有丝分裂原，最初是从豆科植物的种子中分离并纯化的。迄今尚未见动物组织中存在有ConA。已知ConA可与淋巴细胞表面受体结合，诱导并促进淋巴细胞的有丝分裂和增殖。
作为本发明的软骨组织修复移植体的基质材料，可以使用任何天然或合成来源的胶原蛋白或胶原蛋白与甲壳素的0.1∶1至10∶1(w/w)混合物。胶原蛋白可以是由人、牛、马、羊、猪或狗的肌腱组织中天然提取的，或以化学方法或DNA重组技术人工合成的。其中优选的是人胶原蛋白I或II，特别是人胶原蛋白I。可以按照本领域技术人员熟知的方法从上述来源分离并纯化胶原蛋白I或II，特别是人胶原蛋白II或其衍生物或片段。或者，也可基于胶原蛋白的氨基酸序列，以肽合成方法或DNA重组技术合成或在适当宿主细胞中表达所需的胶原蛋白或其片段，或它们的衍生物。为避免可能发生的免疫原性反应，最好使用同种动物来源的胶原蛋白或衍生物。
胶原蛋白是结缔组织的基质成分之一。在正常生理条件下，胶原蛋白形成具有网状结构的胶原纤维，为细胞粘附、生长、分化与代谢提供极好的支架材料和部分营养支持。胶原蛋白还具有良好的组织兼容性和促进组织修复的功能。因此，以胶原材料作为组织充填材料可更有利于促进细胞或组织的再生与修复。
为了制备用于关节软骨组织修复的本发明的移植体，例如可在冰水浴中将0.1％至0.5％(w/v)的胶原蛋白溶液与等体积培养基A(含有10％新生小牛血清、50mg/L抗坏血酸和60mg/L卡那霉素的2×MEM培养基)相混合。然后向所得混合物中加入不同剂量的ConA。将此ConA/胶原蛋白混合物于30℃保温30分钟后，即可得到可直接用作哺乳动物软骨组织损伤修复材料的凝胶状移植体。为了便于储存，必要时可在常规冻干条件下冻干所说的凝胶。一般说来，如此得到的移植体中ConA的浓度为大约1～100μg/ml，最好为大约20～80μg/ml。
根据本发明的一个实施方案，虽然用于制备本发明的移植体的优选植物凝集素是ConA，但某些情况下也可使用其它已知的植物凝集素，例如Lentil、WGA、PHA-L和PHA-P，以及UEA等代替ConA。与ConA相比，虽然这些植物凝集素刺激静止的软骨细胞成熟化和终末分化的活性较弱，但它们亦可作为制备本发明的软骨修复移植体的候选物质。在此应特别指出的是，由于包括ConA在内的植物凝集素的完整分子均具有凝集红细胞的作用，所以必要时可制备并选择使用这些植物凝集素的片段或片段组合或其衍生物。所有这些片段、片段组合或功能类似物或衍生物都将包括在本发明的范围内。
本发明的移植体可用于修复包括人在内的各种哺乳动物因各种原因导致的软骨和/或骨组织损伤。所说的软骨和/或骨组织损伤可以是由于创伤等机械损伤、化学损伤和各种病原微生物引起的感染性或非感染性损伤及免疫功能失调(如变态反应或自家免疫病等)导致的软骨和/或骨损伤。其中所说的哺乳动物包括人、牛、马、羊、猪、狗、猫、兔、大鼠、小鼠和豚鼠等。
在某些情况下，特别是当局部软骨组织损伤过多，或合并有周围软组织损伤如关节周围软组织损伤时，或损伤部位距离骨髓腔较远时，也可在本发明的移植体中加入一种或多种已知具有细胞或组织再生促进活性的生长因子。这些生长因子包括但不只限于碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子2(IGF-II)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、软骨细胞生长因子(CGF)、转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)以及骨形成蛋白(BMP)等。我们的实验研究表明，在附加使用生长因子的情况下，生长因子可与ConA发挥协同作用，进一步加速局部软骨组织和其周围软组织的修复和伤口愈合，并可大大减少ConA的使用浓度。一般说来，在联合使用ConA和生长因子如bFGF时，ConA的浓度可限制在大约10～20μg/ml，生长因子(bFGF)的浓度可限制在大约1～5ng/ml。
为了观察ConA等植物凝集素在活体条件下对软骨细胞成熟与分化的诱导和刺激活性，进而研究本发明的基本上由胶原蛋白和ConA组合的移植体的临床适用性。本发明利用关节软骨机械创伤动物模型，全面观察了不同浓度ConA对动物活体内关节软骨组织的再生和修复作用(参见实施例2)，并比较了本发明的ConA-胶原蛋白复合移植体与生长因子(bFGF)-胶原蛋白复合移植体在促进受损伤的关节软骨再生和修复中的不同效果(参见实施例3)。
在为本发明目的所进行的动物实验研究中，使用以机械方法造成膝关节全层软骨缺损(深达软骨下骨板，直径5mm)的新西兰大白兔作为模型。实验组动物在软骨缺损处植入按上述方法制备的ConA-胶原蛋白复合体。以损伤部位只植入胶原蛋白凝胶(或其冻干制品)的动物作为阴性对照组，并以损伤部位未植入任何材料的动物作为空白对照组。分别于手术后第4、8、12和20周处死动物，观察在添加不同浓度的ConA的情况下，本发明的ConA-胶原蛋白凝胶移植体诱导动物关节软骨损伤修复的能力及其效果。
结果可见，手术植入后第4～20周，每毫升体积含20和50μg ConA的移植体显着地诱导了缺损区软骨组织的再生与修复。植入后第4周，可见缺损区已几乎被再生的组织完全充填，但修复区与周围正常组织分界明显。再生的组织中的表层可见大量非融合的软骨细胞，而且基底部有明显的新生骨小梁形成。第20周时可见再生的组织表面光滑，并与周围正常组织融合良好。组织学检查可见再生的组织内有软骨陷窝形成，且陷窝内有大量圆形软骨细胞积聚。相反，第4～12周时对照组动物的关节软骨缺损区只有少量白色软骨组织不完全充填，而且表面粗糙；组织学观察可见缺损区以纤维样组织修复为主，陷窝内未见有典型的成熟期透明软骨细胞。第20周时，对照组动物软骨缺损部位仍以纤维组织修复为主，而且再生的组织表面亦不规则。
基于已在体外实验中证实的肝细胞生长因子(HGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对培养的哺乳动物关节软骨细胞的细胞增殖促进活性，我们还分别制备了含有这些细胞生长因子的移植体材料(HGF和bFGF的浓度分别为5μg/ml和10μg/ml)，并按上述同样方法观察了这些移植体对在体软骨组织的修复活性，同时与ConA相比较。与以前的体外细胞学实验结果相符，可见细胞生长因子HGF和bFGF在体内条件下同样表现有明显的软骨细胞再生与修复促进活性。例如在植入含有这些因子的移植体后(第8-20周)，软骨缺损区逐渐被新生的软骨组织充填，而且与正常组织融合良好，基底部亦可见有与正常骨小梁相似的再生并钙化的骨组织形成。然而平行的比较实验也表明，在软骨组织修复速度和再生修复质量上，这些生长因子明显地不如ConA移植体。
另外，我们的初步实验结果还显示，在某些情况(如软骨组织缺损面积较大，或移植体宿主的组织再生能力较差，或合并有关节软骨组织损伤等情况)下，可在胶原蛋白基质中加入适当量的细胞生长因子及甲壳素或甲壳多糖，以期在这些因子的协同作用下，更有利地加速和促进关节软骨组织的再生与修复。当ConA与生长因子(如bFGF)联合使用时，可适当地减少两者在胶原蛋白或胶原蛋白/甲壳素基质中的掺入量。例如，可将ConA和生长因子(如bFGF)的浓度分别限制在5～20μg/ml和0.5～5μg/ml基质。
为了诱导局部软骨组织(如关节软骨组织)的再生与修复，也可使用局部关节腔内直接注射方法投用ConA或溶液态胶原蛋白/ConA混合物。然而，我们的比较实验结果显示，直接局部关节腔内注射ConA或ConA/胶原蛋白溶液所产生的软骨组织修复效果远不如关节腔内植入本发明的ConA/胶原蛋白或ConA/胶原蛋白/甲壳素移植体(数据未出示)。很显然，这种差异主要是由于溶液态ConA在游离状态下半衰期相对较短，而且注入组织(如关节腔内)后可被组织液(如关节液)稀释，或通过周围软组织吸收而进入全身血液循环系统，从而降低了局部有效浓度，影响了其生物学活性的发挥。反之，如使用本发明的凝胶态或冻干的固态移植体时，作为ConA之载体材料的胶原蛋白，其不仅本身具有一定的组织再生促进活性，而且还为新的细胞和组织的再生提供一个良好的三维空间环境，从而更有益于其空隙中ConA分子的缓慢释放，以长时间保持局部有效浓度和其生物学作用的发挥。
在生理条件下，骨内成骨过程包括静止软骨细胞成熟化和成熟的软骨细胞向肥大软骨细胞转变(即终末分化)两个阶段。在胚胎时期，大部分软骨细胞经终末分化完成软骨内成骨过程。但在出生后，则只有小部分软骨细胞保留软骨内成骨功能(如垢板软骨和肋软骨生长板软骨细胞)，以支持骨的纵向生长。我们的研究进一步发现，植物凝集素在诱导缺损软骨组织再生的同时，还可刺激并诱导软骨下骨区域的软骨内成骨过程，即在局部投用ConA等植物凝集素后，可见软骨缺损区基底部有明显的软骨组织钙化和海绵状新生骨小梁形成。因此可以认为，ConA能够在活体条件下诱导软骨再生和软骨内成骨的全过程，即软骨细胞终末分化、骨吸收和新骨形成，以及进一步的骨组织改建。
下列实施旨在举例描述，而不是以任何方式限制本发明。在此应特别指出的是，在不背离本发明的基本精神和原则的前提下，对本发明的个别技术细节的任何改动和改变均将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例1以胶原蛋白和甲壳素为基质材料的复合移植体的制备向大约1 00ml预制备的0.3％人胶原蛋白(Sigma)溶液中加入约100ml含10％新生牛血清(Gibco)、50mg/L抗坏血酸和60mg/L卡那霉素的2×MEM培养基(Gibco)。经简单混合后，向所得混合物中加入大约150mg甲壳素和5mg ConA(Sigma)，并于室温下缓慢搅拌均匀。然后将如此得到的混合物倒入浅盘中，并置于37℃孵箱中保温30分钟，以形成其中均匀地分散有ConA的胶原-甲壳素凝胶。为了便于储存起见，可将这样的凝胶块切成约10×15×20mm大小，并置于冻干机中冷冻干燥，以得到带有致密微孔结构的含ConA的软骨修复移植体。
实施例2ConA对生理条件下关节软骨再生与修复及软骨内成骨的影响选择平均体重约2.5kg的雄性新西兰大白兔30只，随机分成6组，每组5只动物。用3％戊巴比妥(50mg/kg)经腹腔内注射麻醉动物后，将动物固定于操作台上。经膑骨外侧手术切开动物膝关节，暴露股骨远端膑骨面关节软骨。用手工钻在关节软骨表面造成直径为5，深达软骨下骨板的全层软骨缺损。
实验组动物(第3-6组)分别在膝关节软骨缺损部位植入基本上按实施例1所述方法制备的，以牛胶原蛋白为基质材料的移植体。各实验组动物所使用的移植体中ConA的浓度分别为10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml和100μg/ml。对照组分别为不植入任何材料的空白对照组(第1组)和只植入同样大小不含ConA的空胶原蛋白凝胶的阴性对照组(第2组)。植入手术完成后，包扎动物膝关节伤口并将动物送回笼中正常饲养。植入后第4周处死动物，解剖膝关节，进行组织学观察和评价。结果如下列表1所示。
表1ConA对大白兔关节软骨缺损模型的组织再生和修复作用
从表1所示的结果可以看出，与我们以前的体外细胞学实验结果相符，植物凝集素ConA在体内环境下同样表现有明显的软骨组织原位再生和软骨内成骨诱导与促进活性(也参见图1A和1B)，并且在使用胶原蛋白凝胶作为基质的情况下，ConA局部给药剂量与软骨组织修复效果之间存在着明显的量效关系。另外，实验还表明，ConA促进软骨组织原位再生和软骨内成骨的局部有效浓度为20～50μg/ml，增大这一浓度似乎不会进一步改善其使用效果。
实施例3ConA与bFGF促进软骨组织再生与修复作用的比较选择平均体重约为2.5 的雄性新西兰大白兔15只，按照实施例3种所述的方法制备关节软骨缺损动物模型，并将这些模型动物随机分成三组，每组5只动物。第1组为只植入空胶原蛋白+甲壳素基质(参见实施例1)的空白对照组；第2组为植入以胶原蛋白+甲壳素为基质材料制备的含bFGF(10μg/ml)的移植体；第3组为植入以同样基质材料制备的含ConA(50μg/ml)的移植体。移植手术后，分别于第4、8、12和20周处死动物，解剖膝关节并制备创伤局部的组织学切片，然后进行显微镜(100×)下组织学观察并记录结果。结果如下列表2所示。
表2ConA与bFGF促进和诱导大白兔关节软骨组织再生和修复作用的比较
从上列表2所示的结果可以看出，虽然某些细胞生长因子(如bFGF等)在哺乳动物活体内也表现有显着的关节软骨再生与修复刺激活性，但在长时间连续观察期间，可见ConA诱导关节软骨组织原位再生和修复的活性明显好于细胞生长因子。
权利要求
1，一种用于修复哺乳动物软骨组织损伤的移植体，特征在于所说的移植体基本上是由胶原蛋白基质和均匀地分散在所说基质中的凝集素组成的。
2，根据权利要求1的移植体，其中所说的植物凝集素是伴刀豆蛋白A或其衍生物、Lentil、WGA、PHA-L或PHA-P，以及UEA或它们的衍生物或片段。
3，根据权利要求1的移植体，其中所说的植物凝集素是伴刀豆蛋白A或其衍生物或片段。
4，根据权利要求1的移植体，其中所说的胶原蛋白是胶原蛋白I或II。
5，根据权利要求1的移植体，其中所说的胶原蛋白是胶原蛋白II。
6，根据权利要求1的移植体，其中所说的胶原蛋白是人、牛、马、羊或猪来源的。
7，根据权利要求1的移植体，其中所说的胶原蛋白是人来源的。
8，根据权利要求1的移植体，其中所说的移植体中伴刀豆蛋白A的含量约为1至100μg/ml胶原凝胶基质。
9，根据权利要求1的移植体，其中所说的胶原蛋白基质可以是胶原蛋白与甲壳素的0.1∶1至10∶1(w/w)混合物。
10，根据权利要求1的移植体，其中所说的移植体还可含有一种或多种选自碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍生的生长因子、转化生长因子β、肝细胞生长因子、软骨细胞生长因子和骨形成蛋白的细胞生长因子。
全文摘要
本发明总地涉及组织工程学和再生医学，特别是涉及植物凝集素伴刀豆蛋白A的体内诱导和促进哺乳动物软骨组织再生和修复活性。本发明进一步涉及基本上由伴刀豆蛋白A和胶原蛋白组成的软骨组织修复移植体，其制备方法及其在治疗哺乳动物因各种原因导致的软骨组织损伤中的应用。
文档编号A61K38/18GK1398645SQ01123470
公开日2003年2月26日 申请日期2001年7月26日 优先权日2001年7月26日
发明者颜炜群, 陈昕, 杨同书, 侯立中, 马昭若, 胡春光, 申鸣 申请人:吉林圣元科技有限责任公司