专利名称：一种对葡萄糖敏感可自控释胰岛素的生物材料的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种对葡萄糖敏感、可自控释胰岛素的生物材料的制备方法，特别是 一种对葡萄糖敏感的葡聚糖-伴刀豆球蛋白A基胰岛素自控释生物载体材料的制备新方 法，属于药物控释与生物材料技术领域。
(二)
背景技术：
胰岛素依赖型糖尿病(I型)是一种全身性慢性代谢系统疾病，对人体健康的危害 大。胰岛素控释给药是目前治疗I型糖尿病的有效方法。近几年针对I型糖尿病研究开发 的自调节式植物外源凝集素_糖类衍生物智能型胰岛素给药载体系统，为糖尿病的治疗提 供了一条新途径。该载体系统主要利用植物外源凝集素(如伴刀豆球蛋白A)与寡糖的特 异性结合特性，将植物外源凝集素与葡萄糖或葡聚糖的聚合物形成凝胶_溶胶互变系统， 通过血液中游离葡萄糖分子在植物外源集素位点的竞争结合，使得载体由凝胶态变为溶胶 态，释放胰岛素；当血糖浓度低于一定值时，溶胶又变为凝胶网络，恢复原状，胰岛素不再释 放。该系统对葡萄糖的特异性高，在体内生理环境下能够发挥控释作用，凝胶-溶胶间的互 变迅速，重复性好。因此，对血糖浓度的变化较敏感，响应性良好。 现有文献资料中(Tanna等，Biomaterials 2006,27:1586-1597)曾利用紫外线诱 导聚合方法，制备得到了对葡萄糖敏感的葡聚糖_伴刀豆球蛋白A基生物水凝胶材料，可用 于胰岛素的自调节控释。但是，该聚合方法尚不易实现大规模生产，所得到的载体系统敏感 性能及自控释性能仍需进一步改善。
(三)
发明内容
本发明的目的是提供一种制备自调节式植物外源凝集素_糖类衍生物智能型胰 岛素给药载体系统的新方法。 为达到发明目的，本发明提供一种利用自由基聚合方法制备自调节式植物外源凝 集素-糖类衍生物智能型胰岛素给药生物载体材料的新方法，所述方法如下
—种对葡萄糖敏感、可自控释胰岛素的生物材料的制备方法，所述方法包括(1) 将质量比为l : 0.5 2.0的带C二C双键的葡聚糖衍生物单体和带C二C双键的伴刀豆 球蛋白A衍生物单体溶于pH5 9的缓冲液中，得到单体总浓度为50 150mg/L的单体溶 液；(2)向单体溶液中加入催化剂，于30 5(TC下进行自由基聚合反应，反应结束后透析 (用去离子水和截留分子量8 15kDa的透析膜透析3 7天)去除未反应物，得到所述生 物材料；所述带C = C双键的葡聚糖衍生物单体为C3 C6烯基(优选C3 C4烯基)取 代的葡聚糖，带C = C双键的伴刀豆球蛋白A衍生物为C3 C6烯基(优选C3 C4烯基) 取代的伴刀豆球蛋白；所述催化剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺的混合物。
优选的，所述带C = C双键的葡聚糖衍生物单体为烯丙基葡聚糖或甲基烯丙基葡 聚糖，分子量10 100KDa、取代度为10 18X;所述带C = C双键的伴刀豆球蛋白A衍生 物为烯丙基伴刀豆球蛋白。
所述缓冲液pH 5 9，浓度10 200mM，优选为下列之一①磷酸盐缓冲液、 ②Tris-盐酸缓冲液、③磷酸盐_柠檬酸溶液。 葡聚糖衍生物单体和伴刀豆球蛋白A衍生物单体总和过硫酸铵四甲基乙二胺
的质量比为i : o. 02 o. i : o. oi o. i。 优选的，葡聚糖衍生物单体和伴刀豆球蛋白A衍生物单体总和过硫酸铵四甲 基乙二胺的质量比为i : o. 05 : 0.02。 自由基聚合反应的适宜温度在30 60。C，反应时间5 120min。 所述的烯丙基葡聚糖(或甲基烯丙基葡聚糖)和烯丙基伴刀豆球蛋白A可参照文
献资料中(Tanna等，Biomaterials 2006,27 :1586-1597)提供的反应路径制备得到，但制
备条件不同。 具体的，所述甲基烯丙基葡聚糖由如下方法制备得到以分子量10 100kDa的葡 聚糖与甲基丙烯酸酐为反应底物，以二甲亚砜为溶剂，4-二甲氨基吡啶为催化剂，葡聚糖初 始浓度5. 5 6. 8mg/mL，甲基丙烯酸酐初始浓度1. 0 1. 3mg/mL，催化剂与甲基丙烯酸酐 的质量比为O. 1 0. 2 : 1，在48 55t:下进行烯丙基化衍生反应12 36h，反应结束后 去离子水透析(透析膜截留分子量8 15KDa) 1周，得到取代度10 18 %的甲基烯丙基葡 聚糖。 所述烯丙基葡聚糖由如下方法制备得到以分子量10 100kDa的葡聚糖与丙烯 酸酐为反应底物，以二甲亚砜为溶剂，4-二甲氨基吡啶为催化剂，葡聚糖初始浓度5.5 6. 8mg/mL，丙烯酸酐初始浓度1. 0 1. 3mg/mL，催化剂与丙烯酸酐的质量比为0. 1 0. 2 : l，在48 55t:下进行烯丙基化衍生反应12 36h，反应结束后去离子水透析(透 析膜截留分子量8 15KDa) 1周，得到取代度10 18%的烯丙基葡聚糖。
所述甲基烯丙基伴刀豆球蛋白由如下方法制备得到将伴刀豆球蛋白A和甲基丙 烯酸酐按质量比10 : 1溶于20mM、 pH7. 4的磷酸盐缓冲液，配成质量百分比浓度为4. 6% 的溶液，在5rC下反应2h，反应结束后去离子水透析(透析膜截留分子量8 15KDa) 1周， 得到甲基烯丙基伴刀豆球蛋白A。 所述烯丙基伴刀豆球蛋白由如下方法制备得到将伴刀豆球蛋白A和甲基丙烯酸 酐按质量比10 : 1溶于20mM、 pH7. 4的磷酸盐缓冲液，配成质量百分比浓度为4. 6%的溶 液，在5rC下反应2h，反应结束后去离子水透析(透析膜截留分子量8 15KDa) 1周，得到 甲基烯丙基伴刀豆球蛋白A。 与现有自调节式葡聚糖-伴刀豆球蛋白A基胰岛素自控释生物载体材料的制备 技术相比，本发明提供的方法的区别是制备过程采用自由基聚合反应。本发明方法的有益 效果主要体现在实施方便，反应过程迅速，条件温和，大规模生产制备十分容易，所得葡聚 糖-伴刀豆球蛋白A基胰岛素自控释生物载体材料对葡萄糖敏感性能好，自控释性能优良。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此 实施例1 : 将5. 4g葡聚糖(分子量10kDa)与0. 8g甲基丙烯酸酐溶于80mL 二甲亚砜，加入
40. 08g 4- 二甲氨基吡啶，48t:下反应36h，用去离子水和截留分子量8kDa的透析膜透析7 天，冷冻干燥，得到取代度16 %的甲基烯丙基葡聚糖单体。 取伴刀豆球蛋白A lg和甲基丙烯酸酐O. lg溶于24mL磷酸盐缓冲液(20mM、 pH7. 4)中在5rC下反应2h，用去离子水和截留分子量8kDa的透析膜透析7天，冷冻干燥， 得到甲基烯丙基伴刀豆球蛋白A单体。 取50mg上述甲基烯丙基葡聚糖单体，25mg上述甲基烯丙基伴刀豆球蛋白A单 体，溶于1. 5mL磷酸盐-柠檬酸缓冲液(50mM， pH 5)，得到单体溶液；向该单体溶液中加入 7. 5mg过硫酸铵和9. 4mg四甲基乙二胺，于3(TC下反应120min，用去离子水和截留分子量 8kDa的透析膜透析3天，除去未反应物，得到葡萄糖敏感自控释胰岛素的生物材料。
用含lmg/mL胰岛素和葡萄糖的磷酸盐缓冲液进行自控释性能测试(方法见文献 Tanna等，Biomaterials 2006,27 :1586-1597)表明，该载体材料可根据环境溶液中葡萄糖 浓度的变化而发生凝胶_溶胶互变，从而很好地对胰岛素进行对自控释。该载体材料对葡 萄糖的敏感性应变时间约15 30min，葡萄糖浓度在1 15mg/mL范围可实现凝胶_溶胶 互变，自控释性能优良。
实施例2 : 将5. 5g葡聚糖(分子量100kDa)与1. 3g甲基丙烯酸酐溶于100mL 二甲亚砜，加 入O. 26g 4-二甲氨基吡啶，55t:下反应12h，用去离子水和截留分子量14kDa的透析膜透析 7天，冷冻干燥，得到取代度12%的甲基烯丙基葡聚糖单体；甲基烯丙基伴刀豆球蛋白A单 体的制备同实施例1。 取50mg上述烯丙基葡聚糖单体，50mg上述甲基烯丙基伴刀豆球蛋白A单体，溶于 lmL Tris-盐酸缓冲液(10mM， pH 9)，得到单体溶液；向该单体溶液中加入2mg过硫酸铵和 10mg四甲基乙二胺，于6(TC下反应5min，用去离子水和截留分子量10kDa的透析膜透析3 天，除去未反应物，得到葡萄糖敏感自控释胰岛素的生物材料。 用含lmg/mL胰岛素和葡萄糖的磷酸盐缓冲液进行自控释性能测试表明，该载体 材料可根据环境溶液中葡萄糖浓度的变化而发生凝胶_溶胶互变，从而很好地对胰岛素进 行对自控释。该载体材料对葡萄糖的敏感性应变时间约25 60min，葡萄糖浓度在3 15mg/mL范围可实现凝胶_溶胶互变，自控释性能优良。
实施例3 : 将6g葡聚糖(分子量70kDa)与1. 2g丙烯酸酐溶于100mL 二甲亚砜，加入0. 18g 4_ 二甲氨基吡啶，5(TC下反应24h，用去离子水和截留分子量10kDa的透析膜透析7天，冷 冻干燥，得到取代度18%的烯丙基葡聚糖单体。 取伴刀豆球蛋白A lg和丙烯酸酐0. lg溶于24mL磷酸盐缓冲液(20mM、pH7. 4)中 在5rC下反应2h，用去离子水和截留分子量8kDa的透析膜透析7天，冷冻干燥，得到烯丙 基伴刀豆球蛋白A单体。 取75mg上述烯丙基葡聚糖单体，75mg上述烯丙基伴刀豆球蛋白A单体，溶于lmL Tris-盐酸缓冲液(10mM， pH 8)，得到单体溶液；向该单体溶液中加入7. 5mg过硫酸铵和 3mg四甲基乙二胺，于5(TC下反应20min，用去离子水和截留分子量10kDa的透析膜透析3 天，除去未反应物，得到葡萄糖敏感自控释胰岛素的生物材料。 用含lmg/mL胰岛素和葡萄糖的磷酸盐缓冲液进行自控释性能测试表明，该载体
实施例4 : 将6. 2g葡聚糖(分子量40kDa)与1. lg甲基丙烯酸酐溶于lOOmL二甲亚砜，加入 0. 13g 4- 二甲氨基吡啶，52t:下反应24h，用去离子水和截留分子量10kDa的透析膜透析7 天，冷冻干燥，得到取代度15 %的甲基烯丙基葡聚糖单体；烯丙基伴刀豆球蛋白A单体的制 备同实施例3。 取50mg上述甲基烯丙基葡聚糖单体，150mg上述烯丙基伴刀豆球蛋白A单体，溶 于2. 4mL磷酸盐缓冲液(200mM， pH 7)，得到单体溶液；向该单体溶液中加入8mg过硫酸铵 和5mg四甲基乙二胺，于4(TC下反应60min，用去离子水和截留分子量10kDa的透析膜透析 3天，除去未反应物，得到葡萄糖敏感自控释胰岛素的生物材料。 用含lmg/mL胰岛素和葡萄糖的磷酸盐缓冲液进行自控释性能测试表明，该载体 材料可根据环境溶液中葡萄糖浓度的变化而发生凝胶_溶胶互变，对葡萄糖的敏感性应变 时间约30 50min，葡萄糖浓度在1. 5 18mg/mL范围可实现凝胶_溶胶互变，自控释性能 优良。 实施例5 : 将5. 8g葡聚糖(分子量20kDa)与lg丙烯酸酐溶于100mL 二甲亚砜，加入0. lg 4-二甲氨基吡啶，49t:下反应12h，用去离子水和截留分子量10kDa的透析膜透析7天，冷 冻干燥，得到取代度10%的烯丙基葡聚糖单体；甲基烯丙基伴刀豆球蛋白A单体的制备同 实施例1。 取50mg上述甲基烯丙基葡聚糖单体，75mg上述甲基烯丙基伴刀豆球蛋白A单体， 溶于1. 7mL磷酸盐缓冲液(150mM， pH 6)，得到单体溶液；向该单体溶液中加入4mg过硫酸 铵和6. 5mg四甲基乙二胺，于45"下反应90min，用去离子水和截留分子量10kDa的透析膜 透析3天，除去未反应物，得到葡萄糖敏感自控释胰岛素的生物材料。 用含lmg/mL胰岛素和葡萄糖的磷酸盐缓冲液进行自控释性能测试表明，该载体 材料可根据环境溶液中葡萄糖浓度的变化而发生凝胶_溶胶互变，对葡萄糖的敏感性应变 时间约40 60min，葡萄糖浓度在2. 5 15mg/mL范围可实现凝胶_溶胶互变，自控释性能 优良。
权利要求
一种对葡萄糖敏感、可自控释胰岛素的生物材料的制备方法，所述方法包括(1)将质量比为1∶0.5～2.0的带C＝C双键的葡聚糖衍生物单体和带C＝C双键的伴刀豆球蛋白A衍生物单体溶于pH5～9的缓冲液中，得到单体总浓度为50～150mg/L的单体溶液；(2)向单体溶液中加入催化剂，进行自由基聚合反应，反应结束后透析去除未反应物，得到所述生物材料；所述带C＝C双键的葡聚糖衍生物单体为C3～C6烯基取代的葡聚糖，带C＝C双键的伴刀豆球蛋白A衍生物为C3～C6烯基取代的伴刀豆球蛋白；所述催化剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺的混合物。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述带C = C双键的葡聚糖衍生物单体为 烯丙基葡聚糖或甲基丙烯基葡聚糖，分子量10 100KDa、取代度10 18% ;所述带C = C 双键的伴刀豆球蛋白A衍生物为烯丙基伴刀豆球蛋白或甲基丙烯基伴刀豆球蛋白。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述缓冲液为下列之一 ①磷酸盐缓冲液、 ②Tris-盐酸缓冲液、③磷酸盐_柠檬酸溶液。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于葡聚糖衍生物单体和伴刀豆球蛋白A衍生物单体总和过硫酸铵四甲基乙二胺的质量比为i : o. 02 o. i : o. oi o. i。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于葡聚糖衍生物单体和伴刀豆球蛋白A衍生物单体总和过硫酸铵四甲基乙二胺的质量比为i : 0.05 : o.02。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述自由基聚合反应在30 6(TC下进行，反 应时间5 120min。
7. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述甲基烯丙基葡聚糖由如下方法制备得 到以分子量10 100kDa的葡聚糖与甲基丙烯酸酐为反应底物，以二甲亚砜为溶剂，4-二 甲氨基吡啶为催化剂，葡聚糖初始浓度5. 5 6. 8mg/mL，甲基丙烯酸酐初始浓度1. 0 1.3mg/mL，催化剂与甲基丙烯酸酐的质量比为0. 1 0. 2 : 1，在48 55"下进行烯丙基 化衍生反应12 36h，反应结束后去离子水透析1周，得到取代度10 18%的甲基烯丙基 葡聚糖。
8. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述烯丙基葡聚糖由如下方法制备得到以 分子量10 100kDa的葡聚糖与丙烯酸酐为反应底物，以二甲亚砜为溶剂，4-二甲氨基吡啶 为催化剂，葡聚糖初始浓度5. 5 6. 8mg/mL，丙烯酸酐初始浓度1. 0 1. 3mg/mL，催化剂与 丙烯酸酐的质量比为O. 1 0. 2 : 1，在48 55t:下进行烯丙基化衍生反应12 36h，反 应结束后去离子水透析1周，得到取代度10 18%的烯丙基葡聚糖。
9. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述甲基烯丙基伴刀豆球蛋白由如下方法制 备得到将伴刀豆球蛋白A和甲基丙烯酸酐按质量比IO : 1溶于20mM、pH7.4的磷酸盐缓 冲液，配成质量百分比浓度为4.6X的溶液，在5rC下反应2h，反应结束后去离子水透析1 周，得到甲基烯丙基伴刀豆球蛋白A。
10. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述烯丙基伴刀豆球蛋白由如下方法制备 得到将伴刀豆球蛋白A和丙烯酸酐按质量比10 : 1溶于20mM、pH7. 4的磷酸盐缓冲液，配 成质量百分比浓度为4. 6%的溶液，在5rC下反应2h，反应结束后去离子水透析1周，得到 烯丙基伴刀豆球蛋白A。
全文摘要
本发明公开了一种对葡萄糖敏感、可自控释胰岛素的智能生物材料的制备新方法。所述方法是首先将带C＝C双键的葡聚糖衍生物单体和带C＝C双键的伴刀豆球蛋白A衍生物单体溶于缓冲液中，制成单体溶液；然后，向该单体溶液中加入催化剂，在一定温度下进行自由基聚合反应；最后，透析除去未反应物，得到对葡萄糖敏感、可自控释胰岛素的生物材料。本发明提供的制备方法实施方便，反应过程迅速，反应条件温和，大规模生产制备十分容易，所得葡聚糖-伴刀豆球蛋白A基胰岛素自控释生物载体材料对葡萄糖敏感性能好，对胰岛素的自控释性能优良。
文档编号A61K38/28GK101745114SQ200910155749
公开日2010年6月23日 申请日期2009年12月25日 优先权日2009年12月25日
发明者张玮, 沈绍传 申请人:浙江工业大学