专利名称：视网膜机能改善药的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为医药或试剂在临床上或研究上有用的、以具有视网膜电位图(ERG)改善作用的蛋白质为有效成分的视网膜机能改善约。
背景技术：
视觉是感觉机能中最重要的，外界信息的80％是通过视觉系统输入的。因此，视力下降或失明等视机能障碍可以列为重大身体障碍之一。特别是若考虑在信息化社会中向高龄化推进的现状，则防止视机能障碍可以说是现在医疗的重要课题之一。实际上，最近提倡在引起日常生活障碍的疾病的治疗时提高患者生活质量(QOL)的重要性，但在眼科疾病方面，尤其对于包括视机能的改善和维持在内的QOLV(生活质量与视觉)的提高来说成为必须要件的、能达到这一点的治疗法的确立，更是当务之急。
重度视力下降或失明可能是由于种种原因引起的，但日本成年人中每年约16000人中途失明，其原因包括糖尿病视网膜症、绿内障、白内障、视网膜色素变性症、高度近视等。作为采用手术的治疗法，对糖尿病视网膜症可以实施采用激光器的光凝固术、玻璃体手术，对绿内障可以实施小梁切除术，对白内障可以实施眼内透镜插入术。对绿内障也开发了能使眼压降低的各种点眼药，然而，对这些疾病的药物疗法尚未达到能十分令人满意的水平。与伴随着侵袭的手术相比，药物疗法有侵袭少、简便这样的大优点，而且对日益增加的种种眼科疾病的治疗的期待很大，因而人们迫切希望采用有用性高的药剂的药物疗法的开发。
另一方面，近年来基础研究和临床研究的进展，也推进了眼科疾病中病理学的阐明。即，已经变得清楚的是，视力障碍不仅是狭义的感觉器视网膜上视细胞的病变，而且与视细胞的代谢关系密切的视网膜色素上皮的病变、神经纤维的障碍或视网膜的循环障碍、进而脉络膜的循环障碍也会引起视力障碍。
其中，尤其已经判明视网膜色素上皮(RPEretinal pigmentepithelial)细胞在视细胞维持方面发挥重要作用。即，RPE细胞在视网膜最下位层的布鲁赫膜上排列成一层，除吸收到达视网膜的光以防止反射外，还与布鲁赫膜一起构筑能使视细胞与脉络膜血管板分开的血液-视网膜关(blood-retinal barrier)，而且还与各种细胞因子的产生有关等，因而具有视细胞的维持或再生等物理上和生理上重要的机能。视细胞受到这些RPE细胞和缪勒细胞的保护。
此外，作为眼组织中重要的神经传递因子，有谷氨酸、乙酰胆碱、多巴胺等，另一方面，据报告，作为与RPE细胞有关的、涉及眼内恒常性的细胞因子，有白细胞介素类、TGFβ(转化生长因子-β)总科、bFGF(基础成纤维细胞生长因子)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)等(玉井信，日本眼科学会杂志，101，889-890，1997)。然而，这些因子能否积极地应用于治疗，还是未知数。此外，本发明者等人已经确认，以TFPI-2或PP-5为有效成分在视网膜色素变性、视网膜症、黄斑疾病、视网膜剥离等眼科疾病治疗中是有效的(特愿平7-203304和WO97-05893)。
已知TFPI-2(Sprecher等人，Proc.Natl.Acad.USA，91，3353-3357，1994)有VIIa凝血因子抑制活性。此外，这是作为T98G神经胶质瘤细胞产生的丝氨酸蛋白酶抑制剂发现的，进而，据报告，这和与血液凝固有关的PP5(Miyake等人，J.Biochem.，116，939-942，1994)有相同的氨基酸序列。然而，迄今为止尚无报告指出这些蛋白质有视网膜机能改善活性。
如上所述，会引起重大视机能下降或失明的眼科疾病预料今后还会增加，而且尚未确立令人满意的药物疗法，况且眼组织的细胞生物学研究好不容易才刚开始着手进行。
如上所述，对于尚无有力药物疗法的眼科疾病来说，可以把能改善视网膜变性的因子作为治疗药的开发列为课题。在会引起重大视力障碍的眼科疾病中，例如，对绿内障首先进行能使眼压降低的手术或者药剂的给药，虽然取得了一定成果，但已经清楚的是，下降视力的恢复是有极限的，或者说对于正常眼压绿内障这样的疾病不能只采用降低眼压疗法治疗。进而，在视网膜中心动静脉的闭塞方面，即使循环障碍恢复后视力也不能充分恢复，或者有发生继发性绿内障的问题。
对于如上所述的眼科疾病，全都是视网膜机能有高度障碍，从而引起视力下降或视野缺损、失明等重大视机能障碍。显然，只要有能适用这些疾病的有效药剂，就会对实际医疗做出很大贡献。本发明涉及作为医药或试剂在临床上或研究上有用的、以具有ERG改善作用的蛋白质为有效成分的视网膜机能改善药。
发明公开本发明是作为医药或试剂在临尿上或研究上有用的、以具有ERG改善作用的蛋白质、尤其组织因子途径抑制剂-2(TFPI-2)或胎盘蛋白5(PP5)为有效成分的视网膜机能改善药。
附图简单说明
图1显示TFPI-2对使用SI障碍兔模型的ERGc波改善效果。
发明实施的最佳形态本因子是通过从人体培养细胞培养上清液中精制分离、或从采用本因子的cDNA并借助于所谓基因重组技术制作的细胞的提取液或细胞培养上清液中精制分离、进而从本因子的cDNA以适当载体系注入胎儿胚中得到的所谓转基因动物的乳等体液成分中精制分离而得到的。人体培养细胞是以源于有产生本增殖因子的能力的各种正常组织的细胞或株化细胞中任何一种为对象的，但较好是上皮系细胞、基质细胞或成纤维细胞。在利用基因重组技术制备本因子的情况下，可以采用CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、小鼠C127细胞等哺乳动物细胞、蚕、夜盗蛾等昆虫细胞，大肠菌、枯草菌、酵母等微生物等。进而，在以转基因动物为宿主的情况下，可以采用小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛等。
这样制备的本因子可以借助于种种色谱法从作为原料的细胞培养上清液、虫体提取液、菌提取液、生物体提取液中精制分离。采用的色谱法只要是对本增殖因子有亲和性的，任何一种均可，例如，以二氧化硅(硅石)或磷酸钙为吸附材料的柱、以肝素或色素或疏水基为配体的柱、金属螯合柱、离子交换柱、凝胶过滤柱等。
此次采用的ERG(视网膜电位图)已知能反映视网膜中存在的视细胞的生存所必须的视网膜色素上皮细胞的机能，而且已知在引起视网膜变性或视机能障碍的眼科疾病、具体地说、绿内障(原发性绿内障、继发性绿内障)、视网膜血管闭塞症(细动脉硬化症、视网膜中心动脉闭塞症、视网膜中心静脉闭塞症、视网膜静脉分枝闭塞症)等疾病中，当视网膜色素上皮细胞的机能下降即视网膜机能下降时，ERG的振幅减少或消失(Brown，K.T.等人，J.Physiol.158，257-280，1961)。对于以上所示伴随着视网膜变性的疾病来说，尚未发现显示出ERG改善即视网膜机能改善效果的药物。
本发明者等人，在如实施例中所示的药物诱导视网膜障碍模型中，确认了组织因子途径抑制剂-2(TFPI-2)或胎盘蛋白5(PP5)能恢复ERG的c波振幅，改善视网膜色素上皮细胞的机能、防止视细胞障碍。
从以上所述，发现了本因子即组织因子途径抑制剂-2(TFPI-2)或胎盘蛋白5(PP5)是作为视网膜机能改善药或作为试剂在临床上或研究上有用的，对于广泛引起视网膜变性或视机能障碍的眼科疾病来说，适合用来作为视机能改善用治疗药。
本因子可以以其原样或作为与本身已知的药理学上可接受载体、赋形剂等混合的医药组合物经口或非经口给药。
作为经口给药用剂型，具体地说，可以列举片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂等。这样的剂型可以用本身已知的方法制造，而且是含有制剂领域通常使用的载体或赋形剂的。例如，作为片剂用载体、赋形剂，可以列举乳糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉、硬脂酸镁等。
作为非经口给药用剂型，可以列举诸如软膏剂、霜剂、注射剂、泥罨剂、涂布剂、栓剂、点眼剂、经鼻吸收剂、经肺吸收剂、经皮吸收剂等，对于眼科局部给药用途来说，特别好的是注射剂(全身给药、玻璃体内给药、视网膜下给药、眼球囊给药、结膜下给药等)、经角结膜剂、点眼剂、眼软膏等。溶液制剂是用本身已知的方法，例如将本因子溶解于通常用于注射剂的无菌水溶液中、或悬浮于提取液中、进而乳化以呈包埋于脂质体中的状态制备得到的。作为制剂处方，可以将等张化剂(氯化钠、氯化钾、硼酸、甘油等)或缓冲剂(硼酸缓中液、磷酸缓中液、乙酸缓冲液等)、增溶剂(表面活性剂、环糊精类等)、稳定剂(柠檬酸、乙二胺四乙酸、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠等)、粘稠剂(合成高分子、纤维素类、多元醇类等)调合制作。进而，还可以配制成高分子聚合物剂、微球制剂、溶胶、凝胶、软膏等剂型。
作为固体制剂，可以用本身已知的方法，例如向本因子中添加甘露糖醇、茧蜜糖、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖等作为赋形剂，制成冷冻干燥物。进而，还可以将其制成粉末使用。作为凝胶化剂，可以用本身已知的方法，例如，将本因子制备成溶解于甘油、聚乙二醇、甲基纤维素、羧甲基纤维素、透明质酸、硫酸软骨素等增粘剂或多糖中的状态。
即使在任何一种制剂中，也可以添加人血清清蛋白、人免疫球蛋白、α2巨球蛋白、氨基酸等作为稳定剂，而且在不损害本因子的生理活性的范围内还可以添加醇、糖醇、离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂等作为分散剂或吸收促进剂。此外，必要时还可以添加微量金属或有机酸盐。
本发明的视网膜机能改善药的给药可以以全身给药或局部给药方式进行，有效给药量和给药次数因给药剂型、给药途径、患者的年龄、体重、治疗对象疾病、症状或严重程度而异，但通常可以是成人每人0.001～100mg、较好0.01～10mg每日一次或分数次给药。
实施例以下显示实施例，以期更详细地说明本发明。
实施例1使用RCS大鼠的药理试验作为遗传性视网膜障碍动物，使用已知从出生后25天左右开始发生视网膜组织变性的RCS大鼠(Ella，G等人，Nature 34783-86，1990)，考察TFPI-2的视网膜障碍保护效果。TFPI-2是用“以TFPI-2或PP-5为有效成分的视网膜色素变性、视网膜a疾病治疗剂的发明”(特愿平7-203304和WO97-05893)中所示工艺产生的。雄性RCS(皇家外科医生学院)大鼠在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下(氯胺酮∶甲苯噻嗪∶生理食盐水＝10∶1∶1)用30号针向玻璃体内给药。TFPI-2给药在3周龄和4周龄共进行2次。一次给药容量是10μl，给药总蛋白量7μg。对照组给药PBS(磷酸盐缓冲剂食盐水)。第5周龄时摘出眼球，按常法进行戊二醛/福尔马林固定后，制作病理切片。染色用苏木精-曙红法进行。表1中列出其结果。〔表1〕TFPI-2对RCS大鼠的视网膜变性抑制效果
PBS给药组观察到构成视细胞的外颗粒层减少，和杆体锥体细胞萎缩空泡化。TFPI-2给药组抑制了外颗粒层的减少，也抑制了杆体锥体细胞的萎缩空泡化。另一方面，视网膜色素上皮细胞，与PBS给药组比较，尤其未观察到增殖。这个结果表明TFPI-2没有促进视网膜色素上皮细胞的增殖，而且保护了视细胞，因而预料TFPI-2给药对视网膜色素上皮细胞的机能有改善效果。
实施例2使用碘酸钠(以下简称SI)障碍兔模型的药理试验作为代表性药物诱导视网膜障碍模型，使用SI障碍兔模型(Heike，M.等人，Documenta Ophthalmologica 7515-22，1990)，验证TFPI-2的视网膜色素上皮细胞机能改善效果。对有色兔(Dutchrabbits)经静脉内给药SI 15mg/kg，次日向玻璃体内给药TFPI-2。TFPI-2的一次给药容量是100μl。给药总蛋白量79μg。对照组采用同蛋白量的bFGF。然后，测定ERG的c波随时间的变化。兔子在暗室中放置1.5小时以上，适应黑暗之后用氯胺酮/甲苯噻嗪(5∶3)麻醉。将兔子俯伏固定，用散瞳药散瞳之后，安装接触眼镜型电极。借助于连接在电极上的白色LED电极发光装置，进行1000勒克司5.5秒钟的光刺激。因刺激而发生的ERG的c波用直流增幅器增幅，并记录在记忆示波器上。测定以5分钟的间隔测定数次，对波形作加和平均，求出振幅。各时点的振幅与SI给药前正常时的振幅比较，求出c波振幅的恢复率。据报告，视网膜电位图的c波反映出视网膜色素上皮细胞的机能(Steinbarg，R.H.等人，Nature 227，728-730，1970)。本实施例的结果显示在图1中。TFPI-2给药组与bFGF给药组相比显示出明显的c波恢复效果。SI给药28日后，bFGF给药组只恢复到正常时的2成，但TFPI-2给药组恢复到8成。
从以上实施例1和2可以看出，TFPI-2明显地改善视网膜色素上皮细胞的机能，并防止视细胞的障碍。
产业上利用的可能性本发明的有ERG(视网膜电位图)改善作用的蛋白质，作为视网膜机能障碍、具体地说、绿内障、视网膜血管闭塞症等眼科疾病的治疗剂是有效的。
权利要求
1.视网膜机能改善药，包含有视网膜电位图改善作用的蛋白质作为有效成分。
2.权利要求1记载的视网膜机能改善药，其中，有视网膜电位图改善作用的蛋白质是组织因子途径抑制剂-2(TFPI-2)。
3.权利要求1或2记载的视网膜机能改善药，是以绿内障或视网膜血管闭塞症为对象的。
全文摘要
本发明是以具有ERG(视网膜电位图)改善作用的蛋白质为有效成分的视网膜机能改善药。特别是以组织因子途径抑制剂－2或胎盘蛋白5为有效成分者，可以在绿内障、视网膜血管闭塞症、视网膜机能障碍等眼科疾病中用来作为视网膜机能改善药。
文档编号A61K38/57GK1406134SQ01805844
公开日2003年3月26日 申请日期2001年2月28日 优先权日2000年2月29日
发明者武藤昌图, 穗积香织, 须藤哲央, 内海润 申请人:东丽株式会社