用于治疗糖尿病性视网膜病变的药物组合物及其制备方法

专利名称：：用于治疗糖尿病性视网膜病变的药物组合物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及以植物材料提取物为活性成分的药物组合物，具体讲涉及一组用于治疗糖尿病性视网膜病变的组合物及其制备方法。技术背景目前全世界糖尿病发病率约4.6%，累计达2亿人。其发病率逐年上升，预计至2025年，糖尿病发病率约5.4%，达3亿人。糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)是糖尿病患者最常见和最严重的眼部并发症，是目前世界范围内三大致盲疾病之一。我国糖尿病患者并发视网膜病变的比率高达47%(国际平均水平为45%)。糖尿病视网膜病变在发病早期并无明显眼部症状，随着病情进展可出现视力减退或骤降，严重者可完全失明，严重影响患者的生活质量。由于DR发病机制十分复杂，迄今为止，糖尿病视网膜病变的发病机制尚未完全阐明，但较为一致的意见是在糖尿病状态下，视网膜暴露在高浓度的血浆葡萄糖中，细胞内游离葡萄糖堆积，山梨醇合成加速，山梨醇在视网膜毛细血管壁内堆积，导致毛细血管壁长期处于高渗状态;糖基化终末产物的沉积，蛋白激酶激化，导致血管内皮细胞损伤，刺激基底膜进行性增厚，功能失常，造成周细胞死亡，微动脉瘤形成及其视网膜血管通透性增加；广泛的周细胞死亡可引起区域性视网膜血流量调节作用丧失，破坏毛细血管的完整性，出现无细胞结构的毛细血管，导致视网膜毛细血管闭塞，无血液灌注，引起血管周围的视网膜缺血，而缺血又刺激新生血管增殖因子的活化，继而引起新生血管形成，玻璃体充血水肿、纤维增殖和继发性视网膜脱离，最终导致失明。DR的发病机制虽然复杂，但其始动环节是高糖引起的糖尿病视网膜血管内皮(VascularendothelialCells,VECs)损伤。糖尿病可引起内皮细胞损伤及功能不全，导致炎性细胞浸入、血管平滑肌细胞增殖，增加细胞死亡，引发血管增生，最终导致粥样硬化、斑块破裂及血管再狭窄。糖尿病视网膜病变在很大程度上是由于血管内皮细胞损伤或功能障碍所致。血管内皮功能改变是血管病变的病理基础，而内皮功能的异常也加速了糖尿病及其并发症的进程。血管内皮细胞也是胰岛素的靶器官之一，胰岛素与内皮细胞表面胰岛素受体结合后，促使其释放一氧化氮(nitrogenoxide,NO)增加而实现其血管舒张的生理功能。包括内皮细胞在内的细胞膜损伤引起胰岛素受体分布和功能变化，从而产生胰岛素抵抗，又促使内皮细胞功能进行性损害，使血管功能障碍发生、发展。血管内皮功能异常在糖尿病前期就已存在，随着血糖升高，血管内皮功能受损会逐渐加重。内皮释放的NO具有一种血管舒张效应并抑制血小板的聚集、白细胞到内皮的粘附和内膜平滑肌细胞的增殖。它在许多关健性的心血管机理中是至关重要的。目前西药治疗还缺乏特效的治疗糖尿病性视网膜病变的药物，而且还有一定的毒副作用。而传统中药药方存在有效成分不明确、含量偏低，不利于生产质量控制，而且疗效偏低。所以还需要寻求一种安全、有效，且副作用小的治疗方法方法。牛蒡子(Fructusarctii)是牛蒡的干燥成熟果实，为历版《中国药典》收载，具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽的功效。传统中医临床多用于风热感冒、咳嗽痰多、麻疹、风疹、咽喉肿痛、痄腮丹毒等。现代药理学研究证明牛蒡子有抗肿瘤、降血糖、抗HIV和抑制血小板聚集等作用。临床上用牛蒡子治疗糖尿病及其并发症糖尿病肾病效果显著。药理实验也证明牛蒡子具有降低血糖和尿中蛋白质的作用。但是目前国内外均采用牛蒡子有效部分进行降血糖实验，而且其活性成分并不明确。近年来，国内研究表明牛蒡子水提物、醇提物能显著而持久地降低大鼠血糖，对碳水化合物耐量增高，毒性较小；牛蒡子提取物对糖尿病大鼠肾脏病变有一定的改善，其作用机制可能与减轻细胞内蛋白非酶糖基化有关。牛蒡子提取物中的成分中主要含有牛蒡子苷和牛蒡子苷元，牛蒡子苷(arctiin)及其苷元(arctigenin)如下结构式(I)、结构式(II)所示-结构式(I)结构式(II)OO专利ZL02133954.6公开了一种用于治疗糖尿病肾病或糖尿病的牛蒡子总木脂素苷类提取物。其技术方案为:用乙醇等有机溶媒提取，精制，干燥，获得含5090%(用紫外分光光度法测定)牛蒡子总木脂素苷类物质，或含牛蒡子苷1570%(用高效液相法测定)的提取物为原料药配制用于治疗糖尿病肾病或糖尿病的药物制剂。专利申请CN200610013120.0公开了一种以牛蒡子总木脂素苷类提取物为原料制成的具有降糖益肾作用的中药，其中牛蒡子总木脂素的含量5089%之间，牛蒡子苷的含量在30%以上。专利申请CN200510025834.9公开了一种牛蒡子提取物及其制备方法及应用，该提取物中包含以牛蒡子苷元为主的总木质素类化合物和牛蒡子苷，总木质素类化合物和牛蒡子苷的重量含量占52%—80%，其他成分的重量含量占20%—德。以上发明的不足是仅发现牛蒡子提取物的降糖效果，且药用成分为混合物，不利于生产质量控制和药效的提高；牛蒡子苷纯度不高。此外，专利ZL200410015465.0公开了一种制备抗病毒与抗肿瘤天然药物牛蒡子苷元的方法；专利申请CN200510035169.1公开了牛蒡子苷在制备抗炎药物中的应用。本发明人经过研究后发现，牛蒡子苷和牛蒡子苷元可以用于治疗糖尿病性视网膜病变，牛蒡子苷和牛蒡子苷元对视网膜血管内皮具有保护作用。
发明内容本发明的目的在于提出一种对糖尿病性视网膜病变标本兼治，且疗效好、毒副作用低的药物。为了实现发明目标，本发明人进行了牛蒡子苷和牛蒡子苷元对视网膜血管内皮的保护作用的研究。结果发现，牛蒡子苷和牛蒡子苷元能够显著增加内皮细胞内皮型一氧化氮合酶的表达；显著对抗高糖对内皮细胞增殖的抑制作用，改善内皮细胞功能；显著提内皮细胞在高糖条件下分泌NO的能力；显著的保护内皮细胞免受高糖条件所致的损伤。在此基础上，本发明人进行了更深入广泛的研究，实现了这一目标。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种治疗和预防糖尿病性视网膜病变的组合物，其特征在于述组合物包含(a)牛蒡子苷、药用添加剂和/或药用载体；或(b)牛蒡子苷元、药用添加剂和/或药用载体；或(c)牛蒡子苷、牛蒡子苷元、药用添加剂和/或药用载体。其中所述组合物(c)中牛蒡子苷的含量为50-99重量份，牛蒡子苷元的含量为l一50重量份；优选为牛蒡子苷75—95重量份，牛蒡子苷元5—25重量份。所述组合物中牛蒡子苷纯度为90%(高效液相色谱法测定)以上，牛蒡子苷元的纯度为90%(高效液相色谱法测定)以上。药用添加剂和/或药用载体的含量为100—20000重量份；所述组合物中的药用添加剂和药用载体包括填充剂、崩解剂、粘合剂、滑润剂、湿润剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂、增稠剂、稀释剂、缓冲物质、溶剂、增溶剂、旨在获得贮存效果的试剂、旨在改变渗透压的盐、涂布剂或抗氧化剂。所述组合物可制备成片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂、滴眼剂、滴眼剂或栓剂；以下各组分的重量以重量份计，有特殊说明的除外；其中片剂或丸剂的片芯中含有组合物(a)含牛蒡子苷I一IOO，从乳糖、淀粉、糊精、羟丙基纤维素中选出的至少一种250—350，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种5—10，包衣预混剂欧巴代OY-C-7000A3—5;组合物(b)含牛蒡子苷元I一IOO，从乳糖、淀粉、糊精、羟丙基纤维素中选出的至少一种250—350，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种5—10，包衣预混剂欧巴代OY-C-7000A3—5;组合物(c)中牛蒡子苷50—99，牛蒡子苷元1一50，从乳糖、淀粉、糊精、羟丙基纤维素中选出的至少一种250~350重量份，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种5—10，包衣预混剂欧巴代OY-C-7000A3—5;其中含速释层的双层缓释片剂或丸剂的片芯中含有组合物(a)中牛蒡子苷I一IOO，从乳糖、淀粉、羟丙基纤维素，聚乙烯基吡咯垸酮中选出的至少一种80~150，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种5—10;组合物(b)中牛蒡子苷元I一IOO，从乳糖、淀粉、羟丙基纤维素，聚乙烯基吡咯垸酮中选出的至少一种80—150，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种5—10;组合物(c)中牛蒡子苷50—99,牛蒡子苷元1一50，从乳糖、淀粉、羟丙基纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮中选出的至少一种80—150，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种5—10;所述双层缓释片剂或丸剂的包衣液中含有羟丙基纤维素70—100，聚乙二醇"4001—5、聚山梨酯-801—5，从柠檬黄、钛白粉中选出的至少一种其中胶囊剂中含有组合物(a)中牛蒡子苷l一100，从乳糖、淀粉、糊精、羟丙基纤维素中选出的至少一种200—300，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种1~4;组合物(b)中牛蒡子苷元I一IOO，从乳糖、淀粉、糊精、羟丙基纤维素中选出的至少一种200~~300，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种1~4;组合物(c)中牛蒡子苷50—99，牛蒡子苷元1一50，从乳糖、淀粉、糊精、羟丙基纤维素中选出的至少一种200—300，从滑石粉、硬脂酸镁中选出的至少一种1—4;其中注射剂中含有组合物(a)中牛蒡子苷1—100，氯化钠18，注射用水定容至2000;组合物(b)中牛蒡子苷元I一IOO，氯化钠18，注射用水定容至2000;组合物(c)中牛蒡子苷50—99，牛蒡子苷元1一50，氯化钠18，注射用水定容至2000;其中栓剂中含有组合物(a)中牛蒡子苷I一IOO，半合成脂肪酸酯600—800;组合物(b)中牛蒡子苷元I一IOO，半合成脂肪酸酯600—800;组合物(。中牛蒡子苷50~99，牛蒡子苷元1一50，半合成脂肪酸酯600~800;其中滴眼液中含有组合物(a)中牛蒡子苷I一IOO，无水磷酸二氢钠128.6，无水磷酸氢二钠37.8，氯化钠84,羟苯乙酯6，注射用水定容至20000;组合物(b)中牛蒡子苷元I一IOO，无水磷酸二氢钠128.6，无水磷酸氢二钠37.8，氯化钠84，羟苯乙酯6，注射用水定容至20000;组合物(c)中牛蒡子苷50^99，牛蒡子苷元1一50，无水磷酸二氢钠128.6，无水磷酸氢二钠37.8，氯化钠84，羟苯乙酯6，注射用水定容至20000。所述的重量份可以是克、市两、公斤、市斤、吨等。本发明分别提纯了纯度大于90%(高效液相色谱测定)的牛蒡子苷和牛蒡子苷元，牛蒡子苷、牛蒡子苷元单独用药可以分别作用于视网膜血管内皮细胞治疗和预防糖尿病性视网膜病变，将牛蒡子苷和牛蒡子苷元组合用药对于治疗糖尿病性视网膜病变具有协同的治疗效果。提纯后的牛蒡子和牛蒡子苷元中的杂质包括牛蒡酚B(lappaolB)、牛蒡酚A(lappaolA)、牛蒡酚F(IappaolF)、罗汉松脂素(matairesinol)、8-羟基松脂素(8-hydroxypinoresino1)、(+)-秦皮树脂醇((+)-Fraxiresino1)、山萘酚(kaempferol)、无梗五加苷B(acanthosideB)、槲皮素(quercetin)和异槲皮素(isoquercitrin)等。本发明采取的用于治疗和预防糖尿病性视网膜病变的组合物的制备方法如下1、牛蒡子苷、牛蒡子苷元的分离提纯方法为(1)牛蒡子苷的制备①牛蒡子苷的粗提牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，经沸程60—90'C石油醚回流脱脂2—4次，脱脂后取出晾干，60%—80%8倍乙醇回流提取2一4次，每次0.5—2h，提取液6(TC—8(TC减压浓縮，得深褐色浸膏；②大孔树脂精制将深褐色浸膏加15—35%乙醇，超声处理15—35分钟，使其恰恰充分溶解，过滤调至成浓度约为5—7mg/mL的溶液，通过AB-8型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂体积为药液体积的l-2倍，流速控制为1.5—2.5BV/h，柱径高比控制为1:5，水洗3倍树脂体积，水洗速度0.5—3BV/h;再换以4一6BV50。/。乙醇洗脱，醇洗速度l一3BV/h，收集洗液，浓縮干燥得牛蒡子苷粗品；③牛蒡子苷的分离牛蒡子粗品用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷粗品的1-2倍，经200—300目硅胶柱层析，硅胶柱为牛蒡子苷粗品的10一50倍，氯仿-甲醇95:1洗脱，薄层色谱跟踪流出液，收集牛蒡子苷单点的流份，合并浓缩，得牛蒡子苷；(2)牛蒡子苷元制备①牛蒡子苷元粗提牛蒡子药材粉碎后，过80目筛，置索氏提取器中，经沸程60卯。C的油醚回流脱脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取2—4次，每次1.5—2.5h，提取液7(TC减压浓縮，得褐色浸膏；②牛蒡子苷元的精制将褐色浸膏用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷元粗品的l-2倍，水浴烘干，干法上样，经200—300目硅胶柱层析，氯仿-甲醇98:l洗脱，洗脱液浓縮合并得到牛蒡子苷元。其中大孔树脂精制牛蒡子苷提取物时的优选方案为取牛蒡子苷醇提物，加15—30%乙醇，充分搅拌，超声处理15—30分钟，使其恰恰充分溶解，过滤调至成上样药液浓度为3—6.5mg/mL的溶液，使用AB-8型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂体积为药液体积的1-2倍，上样流速控制为2BV/h，柱径高比控制为1:5。水洗2—3倍树脂体积，水洗速度1—2BV/h;再换以3.5—4.5BV50。/。乙醇洗脱，醇洗速度l一2BV/h，收集醇洗液，浓縮干燥得牛蒡子粗品。2、按牛蒡子苷、牛蒡子苷元、药用添加剂和/或药用载体的比例配置混合。本发明涉及的组合物可通过任何适宜的途径给予，例如，通过口服、眼局部、静脉内、肌内、真皮内、表皮下、直肠、经皮或经肺给药。本发明涉及的组合物可通过任何符合上述组合物的口服的给药形式包括但不限于丸剂、普通片剂、双层片剂、多层片剂、缓释片剂、单室控释片剂、双室控释片剂、微孔型控释片剂、舌下含片、口腔速崩片、分散片、肠溶片、颗粒剂、延迟释放片、定时/位释放片、普通胶囊、肠溶胶囊、缓释胶囊、控释胶囊、含有微丸或小片的胶囊、含有微丸或小片的pH依赖型胶囊、颗粒剂、膜剂或贴剂、水溶液、酒精溶液或油溶液、乳剂或混悬剂；眼局部给药的形式包括但不限于滴眼液、眼用软膏剂、眼用贴剂；直肠给药的形式包括但不限于栓剂；注射给药的形式包括但不限于溶液、固体粉未或块状物、乳剂或混悬剂。其它适用的给药形式还包括不限于经皮肤或局部给药，例如以软膏剂、酊剂、喷雾或透皮治疗剂体系的形式，或以鼻喷入法或气雾剂混合物的形式的吸入给药，或采取微囊剂、植入剂或植入棒的形式给药。本优选的给药形式为口服、注射给药形式及眼局部给药的形式。药物给药形式的制备方法通常依据其具体形式、组合物实际情况和添加剂的性质等来确定。用于制备本发明的药物给药形式的方法在本领域中是己知的，对于本领域的普通技术人员是显而易见的。在这一方面，将牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元与一种或多种固体或液体药物载体和/或药用添加剂并且与其他具有治疗或预防功能的具有药物活性的化合物结合在一起，制成适当的给药形式或配药形式。本发明涉及的组合物的给药形式也可以包含本领域所属技术人员均知的常规添加剂，例如填充剂、崩解剂、粘合剂、滑润剂、湿润剂、稳定剂、遮光剂、乳化剂、分散剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂、增稠剂、稀释剂、缓冲物质、溶剂、增溶剂、旨在获得贮存效果的试剂、旨在改变渗透压的盐、涂布剂或抗氧化剂。本发明涉及的载体或添加剂的选择及其用量的选择根据具体的应用形式、口腔组合物实际情况、制备方法和主观需求等来确定。口服给药形式通常包含惰性稀释剂或可食用载体。它们可以包封在明胶胶囊中或压成片剂。为了口服给药治疗，可以将活性化合物或其前体药物衍生物与赋形剂混合并以片剂，锭剂或胶囊剂的形式使用。也可以包含在药学上可配伍的粘合剂和/或佐剂物质，作为组合物中的一部分。片剂，丸剂，胶囊剂，锭剂等等可以包含任何下列组分或性质类似的化合物粘合剂如微晶纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素或明胶；赋形剂如淀粉、甘露醇或乳糖；增塑剂为甘油、丙二醇或聚乙二醇；分散剂如藻酸或玉米淀粉;遮光剂如二氧化钛；抗粘剂如硬脂酸镁或滑石粉；润滑剂如胶态二氧化硅；增甜剂如糖精、阿斯巴甜或甜菊素；矫味剂如薄荷，橙皮油。当剂量单位形式为胶囊剂时，除上述种类的物质外，它可以包含液体载体如脂油。另外，剂量单位形式可以包含各种其它能够改变剂量单位物理形态或性能的物质，例如包衣剂。软明胶胶囊和栓剂的载体是例如脂肪、蜡、半固体和液体多元醇、天然或硬化油等。适用于微囊剂、植入剂或植入棒的载体是例如羟基乙酸和乳酸的共聚物。也可以将牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元的冻干物，例如将其用于制备用于注射和输注的制剂中。用于非肠道，真皮内，皮下或局部给药的溶液或悬浮液可包含下列组分:灭菌的稀释剂如注射用水，盐水溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂；抑菌剂如苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；鳌合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐，枸椽酸盐或磷酸盐和调节张力的试剂如氯化钠。非肠道给药的制剂可包封在由玻璃或塑料制成的安瓿，可处理注射器或多剂量小瓶中。如果通过静脉注射给药，优选的载体是生理盐水或磷酸盐缓冲的盐水。本发明涉及的组合物在药物制剂中的量一般为每剂0.11000mg(以牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷和牛蒡子苷元计，下同)，优选0.5500mg，特别是1200mg。典型的局部给药剂量为0.013%wt/wt(在适宜的载体中)。给予本发明涉及的组合物来获得活性化合物的血浆峰浓度，其值为0.000011Ommol/L，优选为0.001300(xmol/L，进一步优选为0.013Ofmiol/L。例如，这可以通过静脉注射活性组分的溶液或制剂，可有可无的盐水或水性溶媒，或者可以通过给予活性组分的药团来获得。组合物中的活性化合物(牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元)的血药浓度依赖于药物的吸收，分布，灭活和排泄速率以及本领域技术人员已知的其它因素。在本发明涉及的组合物中，也可以将牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元与其它不削弱所需作用的活性物质，或与补充所需作用的物质，如其它相同活性的药物、降糖药、抗氧化剂、醛糖还原酶抑制剂、内皮生长因子抑制剂、抗血小板聚集药或它们的混合物。本发明还涉及上述的组合物的用途。其可用于治疗和预防糖尿病性视网膜病变的药物、保健品或食品添加剂。本发明还涉及一种治疗和预防糖尿病性视网膜病变的组合物，包括I.牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元，II.其它治疗药，所述的治疗药选自其它与牛蒡子苷相同活性的药物、降糖药、抗氧化剂、醛糖还原酶抑制剂、内皮生长因子抑制剂、抗血小板聚集药或它们的混合物。上述的方法中，施用牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元的给药的剂量取决于各个实例，并且依惯例根据每一情况进行调整从而达到最好的效果。施用本发明涉及的组合物的给药的剂量值也随着疾病产重程度的减轻而改变。进一步应该知道，就任何特定的治疗对象而言，特定的剂量方案应该根据个休需要和具体的疗程或监督给予组合物的人的职业判断，随时间变化进行调节，并且本文所提出的浓度范围仅作为实例说明并不限定所公开组合物的范围或应用。由此，上述剂量取决于待处理的病症的性质和严重程度，也取决于患者的性别和体征，取决于牛蒡子苷及其苷元作用时间，取决于治疗是急性的或长期的或预防性的，或者取决于除牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元外是否有其它活性化合物被给药。一般而言，为了取得所希望的效果，适宜的每日剂量是0.01500mg/kg，优选0.05200mg/kg，特别是0.1100mg/kg。每日剂量可以在一次给药中使用，或者被分成几次(例如两次或三次)给药。在有些情况下，取决于个体的反应，可能需要从给出的每日剂量向上或向下调整。本发明相对己有技术的优势1、本发明发现了牛蒡子苷和牛蒡子苷元对于视网膜内皮细胞的治疗作用，可以显著提高内皮细胞在高糖条件下分泌NO的能力，显著保护内皮细胞免受高糖条件所致的损伤。2、与以往治疗糖尿病性视网膜病变的化学药物相比，本发明涉及的组合物具有标本兼治的效果，即针对糖尿病具有很强的治疗效果，又改善视网膜内皮细胞。因而具有多重疗效，且毒性极低，副作用极小。3、与以往治疗糖尿病性视网膜病变的传统药方、中成药相比，本发明涉及的药物或药物组合物具有有效成分明确，纯度高；有利于生产质量控制，有利于实施中药现代化；疗效较高，且毒副作用没有明显增加等优势。由此已详细地描述了本发明，对本领域技术人员而言在本发明的范围内显然还可有各种改变，本发明并不受说明书所述的限制。具体实施方式由此已详细地描述了本发明，对本领域技术人员而言在本发明的范围内显然还可有各种改变，本发明并不受说明书所述的限制。实施例1牛蒡子苷和牛蒡子苷元的制备方法(1)牛蒡子苷的制备①牛蒡子苷的粗提牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，经沸程60—卯'C石油醚回流脱脂2次，脱脂后取出晾干，60%8倍乙醇回流提取2次，每次0.8h，提取液6(TC减压浓縮，得深褐色浸膏；②大孔树脂精制将深褐色浸膏加15%乙醇，超声处理15分钟，使其恰恰充分溶解，过滤调至成浓度约为5mg/mL的溶液，通过AB-8型大孔吸附树月旨，大孔吸附树脂体积为药液1倍，流速控制为1.5BV/h，柱径高比控制为1:5，水洗3倍树脂体积，水洗速度0.5BV/h;再换以4BV50。/。乙醇洗脱，醇洗速度lBV/h，收集洗液，浓縮干燥得牛蒡子苷粗品；③牛蒡子苷的分离牛蒡子苷粗品用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷粗品的1倍，经200-300目硅胶柱层析，硅胶柱为牛蒡子苷粗品的10倍，氯仿-甲醇95:l洗脱，薄层色谱跟踪流出液，收集牛蒡子苷单点的流份，合并浓縮，得牛蒡子苷，高效液相色谱测定纯度为90.3%;(2)牛蒡子苷元制备①牛蒡子苷元粗提牛蒡子药材粉碎后，过80目筛，置索氏提取器中，经沸程6090。C的油醚回流脱脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取2次，每次1.5h，提取液7(TC减压浓縮，得褐色浸膏；②牛蒡子苷元的精制褐色将浸膏用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子粗品的1倍，水浴烘干，千法上样，经200—300目硅胶柱层析，氯仿-甲醇98:1洗脱，洗脱液浓缩合并得到牛蒡子苷元，高效液相色谱测定纯度为90.5%。实施例2牛蒡子苷和牛蒡子苷元的制备方法(1)牛蒡子苷的制备①牛蒡子苷的粗提:牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，经沸程60—9(TC石油醚回流脱脂4次，脱脂后取出晾干，80%8倍乙醇回流提取4次，每次2h，提取液8(TC减压浓縮，得深褐色浸膏；②大孔树脂精制将深褐色浸膏加35%乙醇，超声处理35分钟，使其恰恰充分溶解，过滤调至成浓度约为7mg/mL的溶液，通过AB-8型大孔吸附树月旨，大孔吸附树脂体积为药液的2倍，流速控制为2.5BV/h，柱径高比控制为1:5，水洗3倍树脂体积，水洗速度3BV/h;再换以6BV50。/。乙醇洗脱，醇洗速度3BV/h，收集洗液，浓縮干燥得牛蒡子苷粗品；③牛蒡子苷的分离牛蒡子苷粗品用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷粗品的2倍，经200—300目硅胶柱层析，硅胶柱体积为牛蒡子苷粗品的50倍，氯仿-甲醇95:1洗脱，薄层色谱跟踪流出液，收集牛蒡子苷单点的流份，合并浓縮，得牛蒡子苷，高效液相色谱测定纯度为90.7%;(2)牛蒡子苷元制备①牛蒡子苷元粗提牛蒡子药材粉碎后，过80目筛，置索氏提取器中，经沸程609(TC的油醚回流脱脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取4次，每次2.5h，提取液70。C减压浓縮，得褐色浸膏；②牛蒡子苷元的精制将褐色浸膏用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷元粗品的2倍，水浴烘干，干法上样，经200—300目硅胶柱层析，氯仿-甲醇98:1洗脱，洗脱液浓缩合并得到牛蒡子苷元，高效液相色谱测定纯度为90.8%。实施例3牛蒡子苷和牛蒡子苷元的制备方法(1)牛蒡子苷的制备①牛蒡子苷的粗提牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，经沸程60—9(TC石油醚回流脱脂3次，脱脂后取出晾干，70%8倍乙醇回流提取3次，每次lh，提取液70'C减压浓縮，得深褐色浸膏；②大孔树脂精制将深褐色浸膏加20%乙醇，超声处理20分钟，使其恰恰充分溶解，过滤调至成浓度约为6mg/mL的溶液，通过AB-8型大孔吸附树月旨，大孔吸附树脂体积为药液体积的1.5倍，流速控制为2BV/h，柱径高比控制为1:5，水洗3倍树脂体积，水洗速度2BV/h;再换以5BV50%乙醇洗脱，醇洗速度2BV/h，收集洗液，浓縮干燥得牛蒡子苷粗品；③牛蒡子苷的分离牛蒡子苷粗品用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷粗品的2倍，经200-300目硅胶柱层析，硅胶柱体积为牛蒡子苷粗品的25倍，氯仿-甲醇95:l洗脱，薄层色谱跟踪流出液，收集牛蒡子苷单点的流份，合并浓縮，得牛蒡子苷，高效液相色谱测定纯度为91.3%;(2)牛蒡子苷元制备①牛蒡子苷元粗提牛蒡子药材粉碎后，过80目筛，置索氏提取器中，经沸程609(TC的油醚回流脱脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取3次，每次2h，提取液7(TC减压浓縮，得褐色浸膏；②牛蒡子苷元的精制将褐色浸膏用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷元粗品的1.5倍，水浴烘干，干法上样，经200—300目硅胶柱层析，氯仿-甲醇98:1洗脱，洗脱液浓縮合并得到牛蒡子苷元，高效液相色谱测定纯度为91.7%。实施例4牛蒡子苷和牛蒡子苷元的制备方法(1)牛蒡子苷的制备①牛蒡子苷的粗提牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，经沸程8(TC石油醚回流脱脂3次，脱脂后取出晾干，75%8倍乙醇回流提取3次，每次lh，提取液7(TC减压浓缩，得深褐色浸膏；②大孔树脂精制将深褐色浸膏加25%乙醇，充分搅拌，超声处理25分钟，使其恰恰充分溶解，过滤调至成上样药液浓度为5mg/rnL的溶液，使用AB-8型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂体积为药液体积的1.5倍，上样流速控制为2BV/h，柱径高比控制为1:5，水洗3倍树脂体积，水洗速度1.5BV/h;再换以4BV50。/。乙醇洗脱，醇洗速度1.5BV/h，收集醇洗液，浓縮干燥得牛蒡子苷粗品；③牛蒡子苷的分离牛蒡子苷粗品用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷粗品的2倍，经200-300目硅胶柱层析，硅胶柱体积为牛蒡子苷粗品的40倍，氯仿-甲醇95:1洗脱，薄层色谱跟踪流出液，收集牛蒡子苷单点的流份，合并浓縮得牛蒡子苷，高效液相色谱测定纯度为90.8%;(2)牛蒡子苷元制备①牛蒡子苷元粗提牛蒡子药材粉碎后，过80目筛，置索氏提取器中，经沸程6090。C的油醚回流脱脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取3次，每次2h，提取液7(TC减压浓縮，得褐色浸膏；②牛蒡子苷元的精制将褐色浸膏用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷元粗品的2倍，水浴烘干，干法上样，经200—300目硅胶柱析层，氯仿-甲醇9&1洗脱，洗脱液浓縮合并得到牛蒡子苷元，高效液相色谱测定纯度为91.2%。实施例5胶囊剂配方组合物(a)牛蒡子苷(活性成分)100g乳糖(赋形剂)130g淀粉(赋形剂)120g硬脂酸镁(抗粘剂)2.5g共制成IOOO粒组合物(b)牛蒡子苷元(活性成分)100g乳糖(赋形剂)130g淀粉(赋形剂)120g硬脂酸镁(抗粘剂)2.5g共制成IOO鹏组合物(c)牛蒡子苷(活性成分)50g牛蒡子苷元(活性成分)50g乳糖(赋形剂)130g淀粉(赋形剂)120g硬脂酸镁(抗粘剂)_2.5g共制成IOOO粒制法将活性成份和药用辅料均过100目筛，按处方分别准确称量，在混合机中混合10—15min，加入硬脂酸镁2.5g，混合2min后，装入1000粒胶囊即得。实施例6注射剂<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>共制成IOOO支制备方法称取处方量的活性成份，加全量90%的注射用水搅拌使溶解，按注射用水量的0.P/。(W/V)比例加入活性炭，搅拌20分钟，布氏漏斗铺两层无菌滤纸抽滤后，再将粗滤液经已灭菌的0.22pm微孔滤膜精滤。补加注射用水至足量，使牛蒡子苷和牛蒡子苷元含量为标示量的95.0%105.0%，灌装即得。实施例7片剂或丸剂片芯配方组合物(a)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>制备方法将活性成分和其他药用辅料均过100目筛，称取处方量的牛蒡子苷、牛蒡子苷元、乳糖、糊精和占处方量一半的低取代羟丙基纤维素,按等量递加法混合均匀，以4°/。羟丙基纤维素的50%的乙醇为润湿剂制软材，18目筛制粒，湿颗粒于455(TC干燥，20目筛整粒，加入剩余量的低取代羟丙基纤维素、处方量的微粉硅胶、硬脂酸镁混匀，测定活性成份含量后，确定片重，于10.0mm浅凹冲模压片。按常规方法包以白色薄膜衣，包衣增重12%。包衣液的配制在搅拌下把包衣预混剂(欧巴代0Y-C-7000A)加入纯水中，5分钟内加完，继续搅拌45分钟即得。实施例8滴眼液配方组合物(a)牛蒡子苷(活性成分)50.0g无水磷酸二氢钠(调节PH值)128.6g无水磷酸氢二钠(调节PH值)37.80g氯化钠(调节渗透压的盐)84.0g羟苯乙酯(抑菌防腐剂)6.0g注射用水(药用载体)加至_20000ml共制成4000支组合物(b)牛蒡子苷元(活性成分)50.0g无水磷酸二氢钠(调节PH值)128.6g无水磷酸氢二钠(调节PH值)37.80g氯化钠(调节渗透压的盐)84.0g羟苯乙酯(抑菌防腐剂)6.0g注射用水(药用载体)加至_2000CM共制成4Q00支组合物(c)牛蒡子苷(活性成分)40.Og牛蒡子苷元(活性成分)10.Og无水磷酸二氢钠(调节PH值)128.6g无水磷酸氢二钠(调节PH值)37.80g氯化钠(调节渗透压的盐)84.0g羟苯乙酯(抑菌防腐剂)6.0g注射用水(药用载体)加至_20000ml共制成4000支制备方法称取处方量的活性成分，加入约30。/。的温度8(TC左右热注射用水中，搅拌使其溶解，再将无水磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、氯化钠和羟苯乙醋逐步加入其中，搅拌使其溶解，加入0.05%针用活性炭，于温度708(TC吸附15分钟，脱炭，补加注射用水至全量，搅匀，测定其pH值和含量合格后经0.22Mm微孔滤膜过滤，于温度10(TC灭菌30分钟，无菌分装，每支5ml，即得。实施例9栓剂配方组合物(a)牛蒡子苷(活性成分)80g半合成脂肪酸酯(药用载体)700g制成400粒组合物(b)牛蒡子苷元(活性成分)80g半合成脂肪酸酯(药用载体)700g制成400粒组合物(c)牛蒡子苷(活性成分)85g牛蒡子苷元(活性成分)15g半合成脂肪酸酯(药用载体)700g制成400粒制备方法称取活性成份过100目筛，另取半合成脂肪酸酯700g加热熔融，待温度降至6(TC以下时，将活性成份药粉加入，搅拌均匀，浇模制成400粒，即得。实施例IO含速释层的双层缓释片剂缓释片芯配方组合物(a)牛蒡子苷(活性成分)跳Og羟丙基纤维素(粘合剂)28.7g乳糖(赋形剂)58.Og聚乙烯基吡咯烷酮(崩解剂)8.Og硬脂酸(抗粘剂)5.3g制成667片组合物(b)牛蒡子苷(活性成分)跳Og羟丙基纤维素(粘合剂)28.7g乳糖(赋形剂)58.Og聚乙烯基吡咯垸酮(崩解剂)8.Og硬脂酸(抗粘剂)5.3g制成667片组合物(c)牛蒡子苷(活性成分)85.Og牛蒡子苷元(活性成分)15.Og羟丙基纤维素(粘合剂)28.7g乳糖(赋形剂)58.Og聚乙烯基吡咯烷酮(崩解剂)8.Og硬脂酸(抗粘剂)5.3g制成667片包衣液配方:羟丙基纤维素(粘合剂)86g聚乙二醇-400(增溶剂)3ml聚山梨酯80(乳化剂)2ml钛白粉(着色剂)3g柠檬黄(着色剂)6mg6Qo亿醇_3200ml_制成3200ml制备方法1、预处理将活性成分过7号筛，辅料羟丙基纤维素、聚乙烯基吡咯垸酮、硬脂酸分别过7号筛。2、烟酸片芯颗粒制备称取处方量的活性成份、聚乙烯基吡咯烷酮和31%处方量的羟丙基纤维素，混合均匀，作为混合粉，用水制粒。湿粒置6(TC通风干燥，干颗粒经2号筛整粒后，加入处方量的硬脂酸和剩余量的HPMC，混匀。测颗粒含药量，计算标准片重。3、压片13mm浅凹冲压片，片剂硬度控制在56千克力(kgf)。4、包衣液的配制称取处方量的羟丙甲基纤维素、聚乙二醇-400和吐温-80，溶于处方量的60%乙醇中，并用此液研磨处方量的钛白粉，取上清液即得空白包衣液。5、包衣取片芯称重，放入包衣锅内，温度控制在40±2°C，进行预包几分钟，将已过7号筛的牛蒡子苷分散到包衣液中，连续喷入包衣液，至片剂增重15%。实施例11牛蒡子苷和牛蒡子苷元的药效学实验一、试验材料(一)、试验药物试验药物牛蒡子苷、牛蒡子苷元，纯度均要求大于卯.0%，实测值牛蒡子苷94.2%(HPLC法)，牛蒡子苷95.2%(HPLC法)。(二)、糖尿病视网膜病变大鼠模型建立方法雄性Wistar大鼠120只(体重180—200g)，适应性饲养1周后，将大鼠按体重随机分为2组，其中正常组(Normal，N)20只给予常规饲料；建模组100只大鼠给予高脂饲料。建模组高脂词料继续饲养4周后，开始建模。建模方法(l)建模组链脲佐菌素(STZ)给药方法实验前大鼠禁食12h，STZ临用前以0.1mmol枸橼酸一枸橼酸钠缓冲液(pH4.6)配制成5%的溶液，按45mg4cg"腹腔内注射STZ;(2)正常组给药方法实验前大鼠禁食12h，腹腔注射等体积的0.1mmol枸橼酸一枸橼酸钠缓冲液(pH4.6)。注射链脲佐菌素1周后，测定餐后2小时血糖，挑选血糖值在ll.l一20mmol，L—、并具有多饮、多尿、多食特征者确定为糖尿病视网膜病变模型。糖尿病视网膜病变模型组继续高糖高脂饲养，于3个月后进行视觉电生理检须!h动物暗适应20min，戊巴比妥钠按50mg'kg—1腹腔注射麻醉，托品卡胺充分散瞳，按国际临床视觉电生理学会的标准记录闪光视网膜电图(FERG)，包括视网膜振荡电位(Ops)，筛选出出现视功能损坏的糖尿病视网膜病变大鼠作为DR大鼠模型。(二)、试验动物分组取建模成功的60只糖尿病视网膜病变大鼠模型进行随机分组，分组情况1.对照组01=20):给正常饮水及饲料；2.模型组(11=20):高脂高糖饲料饲养，不进行药物干预；3.牛蒡子苷组(n-20):高糖高脂饲料喂养，每日按50mg'Kg'1牛蒡子苷灌胃；4.牛蒡子苷元组(n-20):高糖高脂词料喂养，每日按50mg，Kg"牛蒡子苷元灌胃。二、指标测定(一)给药期间，实验动物一般状况观察在给药过程中每天观察，并记录动物一般状况及死亡情况；每2周称体重l次，并根据体重计算给药剂量；每月从尾静脉取静脉血检测血糖浓度；每2月用代谢笼接尿，检测尿量。(二)检测视网膜电图的改变检测视网膜电图(ERG)的a、b波、视网膜振荡电位(Ops)波的振幅的变化2%戊巴比妥钠按30mg《g'1腹腔注射麻醉，托品卡胺充分散瞳，参照国际临床视觉电生理学会对临床记录多焦视网膜电图(mffiRG)的指南的方法进行mffiRG的记录。以RetiScan(视觉电生理检查系统)系统中程序对mfERG的波形进行自动分析，分析总波形、5个环、四个象区及各个区域的N1波和P1波的峰潜伏时、振幅并计算反应度。(三)与糖尿病相关的常规生化指标血清生化指标末次给药后，禁食3小时，心脏取血，分离血清，用生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-ch)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-ch)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(CREA)和糖化血红蛋白浓度；与内皮损伤相关指标用试剂盒检测一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、内皮素(ET)和丙二醛(MDA)的浓度；收集24小时代谢笼中尿液，检测24小时尿蛋白排出量和24小时尿白蛋白排出量；血液流变学指标取4ml血EDTA抗凝，检测高、低切全血粘度、血浆粘度、红细胞压积及高、低切红细胞变形能力，使用Contraveslowshare30型血流变仪；纤维蛋白原采用双縮脲比浊法，使用紫外分光度仪测定。(四)血-视网膜屏障(BRB)对伊凡思蓝(EB)的通透性戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，暴露右颈静脉，EB45mg'kg"在lmin内由静脉缓慢注入。循环120min后，结扎下腔静脉，左心室灌注1%多聚甲醛缓冲液，同时剪开左心耳。灌注结束后，立即取出眼球,分离视网膜,4。C过夜晾干后称干重。将视网膜与150jiL甲酰胺在7(TC下孵育8h。然后将提取液4"C6000rmin'1高速离心90min。取上清液12(VL用酶标仪测其吸光度值,测定620nm和740nm2种波长样品的吸光度值之差(净吸光度值)，建立EB染料浓度在甲酰胺中的标准曲线。用视网膜干重(mg)标准化EB(ng)含量，结果表示为ng'mg'1。(五)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的测量1、GSH—Px活力测定将晶状体加10:1(mg/ml)生理盐水作匀浆后15000rpml(TC离心15min，取上清液10(Hd，用Lowry法作蛋白含量测定，取上清液400pl作GSH—Px活力测定(采用Hafeman改良法)，活力单位以Hafeman单位/gpr蛋白表示。2、还愿型谷胱甘肽(GSH)含量测定标准管加l.OmMGSH;测定管加GSH—Px活力测定用晶状体匀浆离心液；空白管加磷酸盐缓冲液PBS(0.4M，pH7.8)分别加偏磷酸钠溶液，摇匀后3000rpm室温离心10min，取上清液2ml，加入Na2HPO4(0.4M)溶液2ml、DTNBlml，混匀后以空白管作对照测OD412值，含量以nmol/gwt表示。3、醛糖还原酶活力测定采用Gabbay改良法，以活力单位(u)/gwt表示酶活性。4、晶状体皮层与核重量比值测定称取晶状体全重后，将晶状体置于干净试管内，分离晶状体核，并称取核重量，用晶状体重量减去晶状体核重量即为晶状体皮层重量，按下式计算皮层/核(w/w)=皮层重量/核重量。(六)病理检查戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，立即取视网膜进行标本制备。光镜观察HE染色观察糖尿病视网膜病变大鼠视网膜主要血管的变化情况。过碘酸一雪夫试剂一苏木素(PAS)染色，观察内皮细胞和周细胞形态。三、试验结果(一)牛蒡子苷、牛蒡子苷元对实验动物一般状况观察1、正常对照组大鼠体重增长明显，精神状况良好，动作自如，反应灵敏，毛皮有光泽。模型组大鼠的活动减少，明显消瘦，多饮多尿，反应迟钝，毛竖无光泽，抓取动物时候，动物出现烦躁不安等现象。牛蒡子各治疗组精神状态良好，动作自如，与正常对照组比较，反应灵敏度稍差。实验期间共死亡6只大鼠，其中模型组死亡4只，牛蒡子苷、牛蒡子苷元组各死亡1只。与模型组比较，表明牛蒡子苷、牛蒡子苷元组均能提高实验性糖尿病视网膜病变大鼠的生活质量，降低死亡率。2、对糖尿病视网膜病变大鼠尿量的影响表l对糖尿病视网膜病变大鼠尿量的影响U士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>注与正常对照组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型对照组比较AP<0.05，AAP<0.01结果说明糖尿病视网膜病变模型组与正常对照组比较，糖尿病视网膜病变模型组大鼠的24小时尿量明显高于正常对照组，且均有极显著性差异0<0.0/入与模型组比较，牛蒡子苷、牛蒡子苷元治疗组能降低糖尿病视网膜病变大鼠24小时尿排除量，且均有显著性差异&<0.00。3、对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜电图的影响正常大鼠左右眼ERGa、b波值无显著差异，但个体之间存在一定差异。与正常组相比，模型组a、b波振幅值均明显降低(><ftW)，与模型组相比，牛蒡子苷、牛蒡子苷元治疗组各时间点a、b波振幅值明显升高&<0.0/)。4、对糖尿病视网膜病变大鼠血糖、糖化血糖蛋白的影响表2对模型大鼠血糖、糖化血红蛋白的影响(i土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>注与正常对照组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型对照组比较Ap<0.05，AAp<0.01，"p〉0.05糖化血红蛋白率二糖化血红蛋白含量/血红蛋白含量结果说明糖尿病视网膜病变大鼠模型组与正常对照组比较，糖尿病视网膜病变模型组大鼠的血糖、糖化血糖蛋浓度明显高于正常对照组，有显著性差异0^ft^"入与模型组比较，牛蒡子苷、牛蒡子苷元治疗组对糖尿病视网膜病变模型大鼠的血糖作用不明显，二者无显著性差异^"。5、对糖尿病视网膜病变大鼠总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固斷HDL-ch)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-ch)的影响表3对糖尿病视网膜病变大鼠TC、TG、LDL-ch和HDL-ch的影响(i土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>注与正常对照组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型对照组比较Ap<0.05，AAp<0.01结果说明糖尿病视网膜病变大鼠模型组与正常对照组比较，糖尿病视网膜病变大鼠模型组大鼠的TC、TG、和LDL-ch浓度明显高于正常对照组，HDL-ch浓度明显低于正常对照组，且均有显著性差异&<0.0"。与模型组比较，牛蒡子苷、牛蒡子苷元治疗组均能降低糖尿病视网膜病变大鼠血清TC、TG、和LDL-ch浓度，升高HDL-ch浓度，二者均有显著性差异(^<0.05」。6.对糖尿病视网膜病变大鼠血清一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、内皮素(ET)和超氧化物歧化酶(SOD)的影响表4对糖尿病视网膜病变大鼠血清MDA、NO、ET及SOD的影响(i士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>注与正常对照组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型对照组比较AP<0.05，AAP<0.01结果说明糖尿病视网膜病变模型组与正常对照组比较，糖尿病视网膜病变模型组大鼠血清中MDA、ET含量明显高于正常对照组，NO含量和SOD活性低于正常对照组，且均有显著性差异0<0.05入与模型组比较，牛蒡子苷、牛蒡子苷元治疗组均能降低糖尿病视网膜病变大鼠血清MDA、ET含量，升高NO含量，提高SOD活性，且均有显著性差异&<0力"；但均不如盐酸羟苯磺酸钙治疗组显著。7、对糖尿病视网膜病变模型大鼠血尿素氮、血肌酐的影响表5对糖尿病视网膜病变模型大鼠血尿素氮(BUN)、血肌酐(Crea)的影响(？±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>注与正常对照组比较*p<0.05，林pO.01;与模型对照组比较AP<0.05，AAP<0.01结果说明糖尿病视网膜病变模型组与正常对照组比较，糖尿病视网膜病变模型组大鼠血清中BUN和Crea含量明显高于正常对照组，且均有显著性差异&<0.a5j。与模型组比较，牛蒡子苷、牛蒡子苷元治疗组能降低糖尿病视网膜病变大鼠血清BUN和Crea含量，且均有显著性差异(/Ka0"。8、对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜屏障(BRB)对伊凡思蓝(EB;i的通透性表6视网膜屏障对EB的通透性影响<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>注与正常对照组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型对照组比较Ap<0.05，AAp<0.01结果说明糖尿病视网膜病变模型组与正常对照组比较，糖尿病视网膜病变模型组大鼠视网膜屏障(BRB)对伊凡思蓝(EB)的通透性增加，且有显著性差异(^0.⑨。与模型组比较，牛蒡子苷、牛蒡子苷元治疗组能抑制视网膜屏障(BRB:)对伊凡思蓝(EB)的通透性，且均有显著性差异^<0.0"。9、对糖尿病视网膜病变模型大鼠谷胱甘肽还原酶活性的影响表7对糖尿病视网膜病变模型大鼠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响GSH-Px(Hafema单位/gpr)GSH(mol/gwt)AR(U/gwt)皮层/核(w/w)正常对照组35.88±2.4322.34±0.6378.54±6.241.26±0.08模型组27.36±2.2A20.65±0.62A82.64±6.35。0.81±0.11A牛蒡苷组34.89士3.05'21.86±0.68*60.45士7.89"1.20土0.06"牛蒡苷元组35.33土1.25'21.09±0.57*62.76土6.45"1.23士0.09"注与正常对照组比较*P<0.05，**p<0.01;与模型对照组比较<0.05,AAp<0.01结果说明糖尿病视网膜病变模型组与正常对照组比较，糖尿病视网膜病变模型组大鼠抑制谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)活力、降低还原型谷胱甘肽(GSH)含量和皮层/核值，显著降低醛糖还原酶(AR)活力，且均有显著性差异f/KO.0"。与模型组比较，牛蒡子苷及牛蒡子苷元能显著增强GSH—Px活力、GSH含量和皮层/核值，显著降低AR活力，且均有显著性差异^<0.0》。(七)光镜观察结果视网膜病理学形态显示正常组组大鼠可见较完整的血管网，动脉主干染色较深，管径较细，静脉染色较浅，管径较粗，动静脉相间排列，毛细血管网位于动静脉之间，后极部血管网致密，周边部较稀疏。动脉周围血管网明显少于静脉周围，管径均匀，互相连接成网状。视网膜毛细血管排列均匀规则，走行较直，管径粗细均匀一致。内皮细胞淡染，呈长梭形或椭圆形，位于血管腔内，其长轴多与毛细血管平行；周细胞深染，呈三角形或圆球形，突出于血管壁。内皮细胞与周细胞的比例约为2:1，并可见无细胞核的毛细血管间桥。模型组大鼠视网膜水肿明显，且发生视网膜剥离，视网膜下基底膜增厚，伴间质出血、纤维化、玻璃样变性；毛细血管管径粗细不一，血管走向极不规则，排列紊乱，可见白细胞栓塞毛细血管管腔，内皮细胞增生，周细胞明显减少。周细胞和内皮细胞凋亡，核固縮，凋亡小体形成；小动脉闭塞；周细胞及内皮细胞丧失；无细胞毛细血管形成。牛蒡子苷及牛蒡子苷元组可见类似病理改变，视网膜可见轻度水肿，未见新生血管，灶性出血改变。实施例12牛蒡子苷和牛蒡子苷元的急性毒性试验将本发明所述的牛蒡子苷和牛蒡子苷元用于小鼠的急性毒性试验，得牛蒡子苷的小鼠的口服半数致死量LD5。为139.8g/kg，得牛蒡子苷元的小鼠的口服半数致死量LD5e为64.6g/kg，远远高于前述试验有效剂量，表明该牛蒡子提取物毒副作用小，在开发制备临床用药方面前景广阔。一、试验材料实验动物昆明种小鼠，SPF级，6-8周龄，18—22g。饲养于全封闭动物房内，温度2(h"22"C，相对湿度50—60%，光照12小时暗，12小时明，中央空调集中通风8—15次/小时。自由摄食和饮水，每日更换饮用水一次。适应性饲养观察2天后，禁食不禁水过夜，次日称重、编号。二、实验方案1.动物分组将给药组分为5个剂量组，每组10只小鼠，雌雄各半。2.给药剂量以"不等浓度等容积"的原则给药，牛蒡苷和牛蒡苷元用0.5%羧甲基纤维素钠配成供灌胃用的混悬液，各组小鼠按等比级数l:0.5分别灌胃给予受试药物。以后常规词养，连续观察7天动物的毛色、自发活动、饮食、体重等，记录死亡症状和时间，7天后处死动物，解剖观察小鼠各组织、脏器有无异常变化。将本发明所述的牛蒡子提取物用于进行小鼠的急性毒性试验，得牛蒡子苷的小鼠的口服半数致死量LD5o为139.8g/kg，得牛蒡子苷元的小鼠的口服半数致死量LD5o为64.6g/kg，远远高于前述试验有效剂量，表明该牛蒡子提取物毒副作用小，在开发制备临床用药方面前景广阔。表8牛蒡子苷的小鼠死亡率剂量(g/kg)雄性雌性总死亡率401.445/55/5100%200.723/54/570%100.361/51/520%50.181/50/510%25.090/50/50%表内为"死亡数/动物数"。表9牛蒡子苷对雄性小鼠体重的影响(X土s，g)剂量(g/kg)第l天第7天401.4418.2±0.74(5)200.7221.5±1.01(5)33.2±1,27(2)100.3617.2±0.82(5)32.7±1,08(4)50.1817.8±1,27(5)31.9±0.85(4)25.092〗，7土/.J^"邓.9i:/.27③"()"内为动物数，下同。表IO牛蒡子苷对雌性小鼠体重的影响(X土s，g)剂量(g/kg)第l天第7天401.4419.1±0.73(5)200.7218.8±0.29(5)28.1±0.99(1)100.3620.3±1.26(5)29，6±1.65(4)50.1819.9±0.84(5)30.1±1.31(5)25.0920.7±1.04(5)29.5±0.87(5)表ll牛蒡子苷元的小鼠死亡率剂量(g/kg)雄性雌性总死亡率240.485/55/5100%120.243/54/570%60.121/51/520%30.061/50/5腦15.030/50/50%表12牛蒡子苷原对雄性小鼠体重的影响(X土s，g)剂量(g浸膏/kg)第1天第7天240.4817.5±0.74(5)120,2419.4±1.15(5)32.6±1.32(2)60.1218.5±0.095(5)31.8±1.24(4)30.0618.1±1.17(5)31.7±0.98(4)15.0321.4±0.86(5)30.7±1.32(5)表13牛蒡子苷元对雌性小鼠体重的影响(X土S，g)剂量(g/kg)第1天第7天19.5±0.91(5)18.4±0.59(5)19.8士1.即)20.2±0.78(5)20.6±1.14(5)27.8±1.15(1)28.5±1.55(4)30.7±0.71(5)29.6±0.77(5)结论牛蒡子苷的小鼠口服LD5。为139.8g/kg，LDs。的95W可信限为99.8195.9g/kg。牛蒡子苷元小鼠口服LD5o为64.6g/kg，LD5o的95X可信限为44.693.7g/kg。牛蒡子苷和苷元的小鼠LD5o远远高于其有效剂量，表明其毒副作用小，在开发制备临床用药方面前景广阔。实施例13临床实验研究病例中医辨证属气阴两虚证的2型糖尿病单纯型视网膜病变患者60例(参照《中药新药临床研究指导原则》2002年版)确定，用简单隨机方法将患者分成4组。患者均经散瞳后用三面镜、眼底照相及荧光素眼底血管造影检査。糖尿病视网膜病变依照《实用眼科学》r^y^7f、^^〃4_irl^乂厉_^主^應教，iwa*力按六级分期。治疗方法采用随机对照观察方法将入选对象按l:l随机分成三个试验组(a，b，c)、对照组，试验组a服用牛蒡子苷胶囊(100mg/粒，实施例5a样品)、试验组b使用牛蒡子苷元胶對100mg/粒，实施例5b样品)、试验组c使用牛蒡子苷、牛蒡子苷元混合物胶囊(100mg/粒，实施例5c样品)，每次2粒(每粒0.lg)，l天3次；对照组用进口羟苯磺酸钙胶囊(导升明，奥地利依比威大药厂生产，规格500mg/粒)，每次0.5g(l粒)，l天3次，3个月为1个疗程；各组均予基础治疗试验期间受试者根据适合个体需要的最佳用药原则，各组均同时口服二甲双胍以控制血糖，使受试者血糖达到控制标准或保持稳定的水平。观察指标及评定标准1、实验室检查初查和3月疗程结束后都进行系统的三大常规、空腹血糖(FBS)、餐后血糖(PBS)、血脂、肝肾功能、血内皮生长因子(VEGF)、一氧化氮(NO)含量、血液流变学和视网膜中央动静脉血流参数检测，服药1个月，禾B2个月则只查FBS。2、根据视力及眼底变化分为显效、有效和无效改善眼底荧光血管造影微血管瘤、出血点面积、渗漏面积减少10%以上(2分、2分、3分)；视力提高2行以上或视力》1.0(3分)。稳定眼底荧光血管造影微血管瘤、出血点面积、渗漏面积没有变化或变化程度小于10%(1分、l分、1.5分)；视力波动在l行以内(l分)。恶化眼底荧光血管造影微血管瘤、出血点面积、渗漏面积扩大10%以上(0分、0分、0分)；视力降低2行以上(0分)。综合评价显效上述指标总积分^7分；有效上述指标总积分》4分；无效上述指标总积分<4分。有效率=[(显效例数+有效例数)/总例数]><100%。3、中医根据证候积分评定主要症状视物昏花、目睛干涩、倦怠乏力、气短懒言、五心烦热、口干咽燥，每项按无、轻、中、重4个等级，分别为0、2、4、6分；次要症状口渴喜饮、心悸、失眠、溲赤、便秘，每项按无、轻、中、重4个等级，分别为0、1、2、3分；舌象、脉象只作记录，不计分。疗效指数(n"[(治疗前积分一治疗后积分)+治疗前积分]><1000%。痊愈证候中主症和体征全部消失，有效率n^95X;显效证候中主症绝大部分消失，有效率n》70X;有效证候中的主症基本消失，有效率30%《n<70%;无效证候中的主症有一定改善，有效率1!<30%。4、观察副作用。实验结果1)治疗前后空腹血糖(FBG)、餐后血糖(PBG)、糖化血红蛋白(HbAlc)的结果见表14，15。表14(a)试验组(a)治疗前后FBG、PBG、HbAlc比较(冗士5)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>注碌示p〈0.05表14(b)试验组(b)治疗前后FBG、PBG、HbAlc比较(K土S)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>注碌示p〈0.05表14(c)试验组(c)治疗前后FBG、PBG、HbAlc比较fe土5)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>注碌示口<0.05艮显示:各组均具有一定的降血考奢作用。表15对照组治疗前后FBG、PBG、HbAlc比较(，土5)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>注*表示？<0.05，tt表示pX).052)各组治疗前后血清血管内皮生长因子(VEGF)的结果见表16。表16(a)血管内皮生长因子(VEGF)水平变化比较<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>注*表示口<0.05，#表示p〉0.05表16(b)血管内皮生长因子(VEGF)水平变化比较<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>注*表示。<0.05，#表示pX).05表16(c)血管内皮生长因子(VEGF)水平变化比较<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>注*表示口<0.05，共表示pX).05结果显示各组治疗前后血管内皮生长因子水平均显著下降。3)眼底改变评定结果见表17。表17(a)试验组(a)与对照组眼症总疗效情况<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>注H^表示p〈0.05表17(b)试验组(b)与对照组眼症总疗效情况<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>注*表示。〈0.05表17(c)试验组(c)与对照组眼症总疗效情况<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>注H^表示p〈0.05结果显示各组的疗效均优于导升明疗效。4)中医证候疗效结果见表18。表18(a)试验组(a)与对照组中医证候改善情况总痊愈显效有效无效有效率^739数例例例例(%)试验组30对照组30801349901710036.7一O.475.67X10—15*注碌示p〈0.05表18(b)试验组(b)与对照组中医证候改善情况总痊愈显效有效无效有效率Z户机.数例例例例(%)试验组3081480100一O.475.67X10—15*对照组300491736.7注碌示p〈0.05表18(c)试验组(c)与对照组中医证候改善情况总痊愈显效有效无效有效率Z尸数例例例例(%)试验组30101460100—0.475.67X10—15*对照组300491736.7注*表示？<0.05结果显示各组的中医证候疗效均优于导升明中医证候疗效。5)—氧化氮含量结果见表19:表19(a)两组患者治疗前后一氧化氮比较组别n一氧化氮(X士5)试验组30治疗前治疗后92.13±15.63*46.69±8.43"*对照组30治疗前治疗后91.53±17.42"82.81±12.37***注组内治疗前后比较，***口<0.01，**p<0.05;组间治疗后比较，★★<().01，组间治疗前比较.*p>0.05c组别表19(b)两组患者治疗前后一氧化氮比较n—氧化氮^土5)试验组对照组30治疗前治疗后94.08±8.06*54.66±5.76***30治疗前治疗后91.53士17.42'82.81±12.37*注组内治疗前后比较，"*p<0.01，**p<0.05;组间治疗后比较，"*p<0.01，组间治疗前比较.*P>0.05。表19(c)两组患者治疗前后一氧化氮比较组别一氧化氮(X土5)试验组30治疗前治疗后104.37±9.52'52.30士5.93"对照组30治疗前治疗后91.53±17.42"82.81±12.37***注组内治疗前后比较，"<0.01，*<0.05;组间治疗后比较，"<0.01，组间治疗前比较.>0.05。结果显示各组均能有效抑制一氧化氮含量下降。6)全血高切粘度0iHb)、全血低切粘度(TiLb)、血浆粘度("P)、红细胞聚集指数(EAI)、纤维蛋白原(Fb)的结果见表20。表20(a)治疗前后血液流变学变化(X士5)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>注氺表示P〈0.05表20(b)治疗前后血液流变学变化(3±5)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>注碌示p〈0.05表20(c)治疗前后血液流变学变化(2±5)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>注求表示p〈0.05结果显示治各组疗后患者全血高切粘度OiHb)、全血低切粘度(TiLb)、血浆粘度(tiP)、红细胞聚集指数(EAI)、纤维蛋白原(Fb)比治疗前有明显减(^caa5,。7)视网膜中央动脉的收缩峰值血流速度(PSV)、加速度(A)、舒张末期血流量最大速度(EDV)、视网膜中央静脉回流速度(CRV)的结果见表21表21(a)治疗前后视网膜中央动静脉血流参数变化(l土6)治疗前治疗后9,28±2.8314.03±1.53*~EDA3.42±1.234.97±1.23*A92.30±31.23113.24±34.81*CRV8.83±1.255.86±1.36*注'表示P"CO.05表21(b)治疗前后视网膜中央动静脉血流参数变化(，土i)治疗前治疗后9.49±2.0315.00±2.03'~EDA3.65±0.735.08±0.79'A87.80±34.18109.24±25.31*CRV9.39±0.806.35±1.41*注^表示p〈0.05表21(c)治疗前后视网膜中央动静脉血流参数变化(^土5)—治疗前治疗后PSV8.60±1.9114.77士1.73'EDA4.31±0.674.93±0.61*A94.48±27.65120.33±25.78*CRV9.91±0.716.02±1.29*注'表示p〈0.05结果显示各组治疗后患者视网膜中央动脉的收縮峰值血流速度(PSV)、加速度(A)、舒张末期血流量最大速度(EDV)等显著增加，视网膜中央静脉回流速度(CRV)明显减慢(^:ftO"。8)安全性比较各试验组及对照组服药期间血尿常规、肝功能指标(丙氨酸转氨酶ALT、天冬氨酸转氨酶AST)和肾功能指标(血尿素氮BUN、肌酐Cr)均未显示异常。但对照组中有2例病人出现轻度发热、关节痛、胃肠道紊乱等副作用，而各试验组未见明显副作用。以上各结果表明，牛蒡子苷、牛蒡子苷、牛蒡子苷与牛蒡子苷元混合物能安全有效控制糖病性视网膜病变。权利要求1.一种治疗和预防糖尿病性视网膜病变的组合物，其特征在于，所述组合物含纯度为90％以上、按重量份计的50-99的牛蒡子苷或1-50的牛蒡子苷元。2.根据权利要求1的所述组合物，其特征在于，所述组合物中含100—20000重量份的药用添加剂或药用载体。3.权利要求1所述的组合物，其特征在于将所述组合物制备成片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂、滴眼剂或栓剂。4.一种如权利要求3的所述组合物，其特征在于所述组合物制得的片剂或丸剂含按重量份计的牛蒡子苷I一IOO或牛蒡子苷元I一IOO或牛蒡子苷50—99与牛蒡子苷元1一50的混合物；250—350重量份的从乳糖、淀粉、糊精和羟丙基纤维素中选出的至少一种，5_10重量份的从滑石粉和硬脂酸镁中选出的中的一种，3—5重量份的包衣预混剂欧巴代OY-C-7000A。5.—种如权利要求3所述的组合物，其特征在于所述组合物制得的含速释层的双层缓释片剂或丸剂含按重量份计的牛蒡子苷I一IOO或牛蒡子苷元I一IOO或牛蒡子苷50—99和牛蒡子苷元1一50二者的混合物；80—150重量份的从乳糖、淀粉、羟丙基纤维素和聚乙烯基吡咯烷酮中选出的至少一种；5—10重量份的从滑石粉和硬脂酸镁中选出的至少一种；70—100重量份的羟丙基纤维素，l一5重量份的聚乙二醇"400、l一5重量份的聚山梨酯-80，l一5重量份的从柠檬黄和钛白粉中选出的至少一种。6.—种如权利要求3所述的组合物，其特征在于所述组合物制得的胶囊剂含按重量份计的牛蒡子苷I一IOO或牛蒡子苷元I一IOO或牛蒡子苷50~99和牛蒡子苷元l一50二者的混合物，200_300重量份的从乳糖、淀粉、糊精和羟丙基纤维素中选出的至少一种，1~4重量份的从滑石粉和硬脂酸镁中选出的至少一种。7.—种制备上述任一权利要求的组合物的方法，所说方法包括(1)牛蒡子苷的制备①粗提牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，经沸程60—9(TC石油醚回流脱脂2—4次，脱脂后取出晾干，用60%—80%的8倍量乙醇回流提取2—4次，每次0.5—2h，于6(TC—8(TC下减压浓縮，得深褐色浸膏；②大孔树脂精制将深褐色浸膏加15—35%乙醇，超声处理15—35分钟，溶解，过滤，调至成浓度为5—7mg/mL的溶液，通过AB-8型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂体积为药液体积的l-2倍，流速控制为1.5—2.5BV/h，柱径高比控制为1:5，水洗3倍树脂体积，水洗速度0.5—3BV/h;再换以4—6BV50。/。乙醇洗脱，醇洗速度l一3BV/h，收集洗液，浓缩干燥得牛蒡子苷粗品；③分离牛蒡子苷粗品用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷粗品的1-2倍，经200-300目硅胶柱析层，硅胶柱体积为牛蒡子苷粗品的10-50倍，氯仿-甲醇95:1洗脱，薄层色谱跟踪流出液，收集牛蒡子苷单点的流份，合并浓縮，得牛蒡子苷；(2)牛蒡子苷元制备①粗提牛蒡子药材粉碎后，过80目筛，置索氏提取器中，经沸程6090'C的油醚回流脱脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取2—4次，每次1.5—2.5h，于7(TC下减压浓縮，得褐色浸膏；②精制褐色将浸膏用60目粗硅胶拌样，粗硅胶体积为牛蒡子苷元粗品的1-2倍，水浴烘干，干法上样，经200—300目硅胶柱层析，氯仿-甲醇98:l洗脱，洗脱液浓縮合并得到牛蒡子苷元；(3)按牛蒡子苷、牛蒡子苷元、药用添加剂和/或药用载体的比例配置混合。8.—种如权利要求7的制备方法，其特征在于所说牛蒡子苷于精制为取牛蒡子苷醇提物，加15—30%乙醇，充分搅拌，超声处理15—30分钟，使其恰恰充分溶解，过滤调至成上样药液浓度为3—6.5mg/mL的溶液，使用AB-8型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂体积为药液体积的1-2倍，上样流速控制为2BV/h，柱径高比控制为1:5。水洗2—3倍树脂体积，水洗速度l一2BV/h;再换以3.5一4.5BV50。/。乙醇洗脱，醇洗速度l一2BV/h，收集醇洗液，浓縮干燥得牛蒡子粗品。9.权利要求l一6的任一组合物所述的用于治疗和预防制备糖尿病性视网膜病变药物的用途，其特征在于，将所述的组合物与其他其它治疗药混合施用，所述的治疗药选自与牛蒡子苷相同活性的药物、降糖药、抗氧化剂、醛糖还原酶抑制剂、内皮生长因子抑制剂、抗血小板聚集药或它们的混合物。全文摘要本发明涉及一种包含纯度为90％以上、按重量份计的50-99的牛蒡子苷或1-50的牛蒡子苷元的组合物及其制备方法，其作用是治疗和预防糖尿病性视网膜病变。本发明通过提纯牛蒡子苷和牛蒡子苷元，经药理、毒理和临床试验结果表明，本发明涉及的牛蒡子苷或牛蒡子苷元的组合物对于糖尿病性视网膜病变具有治疗效果强，毒副作用小的特点。文档编号A61K31/365GK101273994SQ20081009437公开日2008年10月1日申请日期2008年4月29日优先权日2008年3月17日发明者卢春来,周世文,周吉银,懿应,蓉张,徐梓辉,茂邢,黄林清申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院