专利名称：人参皂甙在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人参皂甙在制药领域中的新用途。该物质具有抵抗和减轻神经细胞因外环境压力带来的损伤，保护神经细胞活力的作用。用于抵抗脑衰老，增强记忆力。
背景技术：
本世纪90年代初我国学者在国内外研究基础上，对人参根及其地上部分的皂甙成分又深入地进行了分离鉴定，对单体皂甙的代谢化学、半合成、碱水解及分析方法进行系统研究，自人参茎叶中得到10种新的皂甙成分，分别为20(R)-人参皂甙-Rh2、-Rh3、-La、-F4、25-羟基-人参皂甙-Rg2、25-羟基-人参皂甙-Rh1、-Ia，-Ib、koryoginsenoside-R1和-R2(1～3)。到目前为止，从植物人参中已分离并确定了结构的皂甙成分计40余种。
我国中医学中记载了人参扶正(例如增强TNF活性)祛邪(如抗肿瘤)的作用。通过试验证明，抗肿瘤活性构效关系规律如下(1)抗肿瘤活性受母核影响，其强弱规律是齐墩果酸型＞原人参二醇型＞原人参三醇型；(2)抗肿瘤活性受糖影响强弱规律是甙元＞单糖苷＞二糖苷＞三糖苷＞四糖苷；(3)抗肿瘤活性受C20构型影响的强弱规律是20(R)-人参皂甙＞20(S)-人参皂甙。此外还发现人参皂甙-RA1可明显增强肿瘤坏死因子(TNF)的抗肿瘤作用，体外可增强80倍，体内可达10倍，是一个有希望的先导化合物。
以ADP诱导兔血小板聚集为模型，对15种单体皂甙及甙元进行抗血小板聚集活性测试，探讨其构效关系如下甙元强度为PPT＞PPD＞OA；人参皂甙活性强度为PPT型＞OA型＞PPD型；PPT型皂甙单糖苷＞双糖苷＞甙元；OA型皂甙RO＞OA；PPD型皂甙Rb1，Rb2＞Rc，Rd＞PPD＞Rh2。对9种人参皂甙抗大鼠心律失常活性研究表明当甙元不同、连接糖数目相同时，其活性强度顺序为原人参三醇型＞齐墩果酸型＞原人参二醇型；当甙元相同时，人参三糖苷＞人参二糖型＞人参单糖苷。人参皂甙B的抗心律失常活性很强。这与祖国医学记载的人参能通血脉，治疗脉大无伦的经验相符。
为了探索人参茎叶皂甙(GSL)的抗衰老作用，选择了过氧化脂质、脂褐素、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶作为指标。实验结果表明GSL可明显抑制脑和肝中过氧化脂质形成，减少大脑皮质和肝中脂褐素的含量，同时也能增加超氧化物歧化酶和过氧化氢酶在血液中的含量。这个结果表明GSL具有抗氧化作用。这个结果也证实了GSL类似人参根，具有抗氧化作用。
此外，还报道了人参二醇组皂甙和人参三醇组皂甙均具有拮抗0-·2自由基引起的心肌细胞损伤作用。对超氧化阴离子清除作用PDS皂甙略高于PTS皂甙。因此PDS和PTS都具有保护心肌细胞免于氧化损伤作用。
在过去的几年中，人们发现在抗衰老方面人参皂甙-Rg1和-Rb1在人参中是主要的活性化合物。人参皂甙-Rb1和-Rg1抗衰老机制的研究近年来又有新突破。人参皂甙-Rg1(不是-Rb1)可增强老年鼠的T-淋巴细胞增殖能力和IL-2的基因表达及IL-2的蛋白质水平。而对于幼鼠则无明显影响，表明人参皂甙-Rg1可选择性增强老年大鼠的免疫功能。
在益智方面，传统中医的益智和现代医学“促智”几乎是同义语，人参皂甙-Rg1和Rb1是人参中益智作用主要成分。药理作用机制研究表明，人参皂甙-Rb1和Rg1均可促进幼鼠身体发育，并易化小鼠成年后跳台法和避暗法记忆获得过程，用突出定量技术发现-Rb1和Rg1可明显增加小鼠海马CA3区细胞突触数目。这是人参皂甙促进学习和记忆的组织形态学基础。人参皂甙的益智作用和它的提高神经系统功能有关。
按照不同实验结果，人参皂甙的抗衰老作用与下列作用有关(1)抗氧化作用；(2)增强免疫系统功能；(3)提高衰老神经系统功能。从目前取得的成果可以总结以下结论(1)人参皂甙和一些酚酸化合物是人参抗衰老主要活性成分；(2)不同人参皂甙抗衰老作用强弱不同；(3)人参皂甙-Rb1和Rg1在抗衰老方面是最有希望的先导化合物。
人参具有多种化学成分，每种成分在药理方面又有其各自的特点。人参皂甙按甙元的结构可分为3类；齐墩果酸型如人参皂甙Ro，主要有抗炎、抗血小板释放作用。原人参二醇型如人参皂甙-Rb1和-Rb2表现为中枢神经抑制、降低细胞内钙、抗氧化、清除自由基和改善心肌缺血再灌注损伤等作用，原人参二醇组皂甙无溶血活性。原人参三醇组皂甙有溶血活性。原人参三醇型皂甙如-Rg1则表现为中枢神经兴奋，促智，促进蛋白质、DNA和RNA的合成等作用；-Re是抗心律失常有效成分，可抑制吗啡诱发小鼠产生的耐药性等作用。-Rg2可抑制兔血小板释放反应等作用。非皂甙类成分中，炔醇类化合物有抗癌、止痛、消炎作用；酚类化合物如香草酸、麦芽酚等具有抗氧化作用；多糖类成分的生物活性主要在4方面(1)能增强机体免疫能力；(2)可用于防治肿瘤的辅助药剂；(3)可明显抑制四氯化碳所致肝损伤；(4)降血糖作用。低聚肽类有抗脂肪分解的活性。此外，人参中含有糖蛋白具有抗病毒作用，人参蛋白具有促进轴突生成增加脑细胞数量作用。
总之，人参含有多种化学成分，且其作用各不相同，甚至在有些方面截然相反。有些成分的作用是专一的，其它成分虽增至很大量也不产生该作用。
单体的生物活性至关重要，因可排除其它成分的存在，易于阐明它的确切药理作用和分析机制。如人参皂甙-Rb1具有中枢抑制作用，而-Rg1具有中枢兴奋作用。另一方面，通过多种单体皂甙成分的构效关系研究也易于发现活性较强化合物，例如通过对人参皂甙抗肿瘤活性构效关系进行研究，发现人参皂甙-Rh2和Rg3具有较强活性。目前单体化合物多集中于Rg1、Rb1、Re、Rb2等含量较高成分。
前述人参皂甙抑制醋酸泼尼松所致的血清总酯、甘油三酯、胆固醇升高与人参皂甙抗高脂血症有关。人参皂甙抑制小鼠的体重下降、血清皮质醇降低表明人参皂甙有助阳活性。
综上所述，在本领域中尚未有关于人参皂甙用于抵抗脑衰老和神经细胞损伤，增强记忆力的报道。
发明简述本发明的目的就是提供人参皂甙在抵抗脑衰老和神经细胞损伤，以及增强记忆力方面的新应用。
一方面，本发明提供了人参皂甙用于制备药物的用途，该药物用于1)抵抗和减轻神经细胞因外环境压力带来的损伤，保护神经细胞活力，和/或2)抵抗脑衰老，增强记忆力。
在本发明的一个优选例中，该人参皂甙单体选自Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Ro或其混合物。更优选的，该人参皂甙单体选自Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rf或其混合物。
在本发明的另一个优选例中，所述药物还含有药物学上可接受的载体。
在本发明的另一个优选例中，所述药物用于哺乳动物，优选用于人类。
附图简述
图1a是培养5日后人脑皮质神经细胞HCN-1A对低小牛血清条件下的活细胞计数，图1b是无EGF生长因子情况下的活细胞计数。
图2是实验检测的大鼠海马区组织图。
图3是大鼠胰腺组织的免疫组织化学染色ABC法的阳性对照图。
图4是大鼠海马区的免疫组织化学染色ABC法的阴性对照图。
图5是大鼠海马区的免疫组织化学染色ABC法的阴性对照图，其中用PBS代替抗SS抗体。
图6是脑衰老组大鼠海马回组织染色图。
图7是用人参皂甙治疗的脑衰老大鼠海马回组织染色图。
图8是三组大鼠大脑海马各区SS阳性神经元计数的结果图。其中灰色条代表正常海马区的阳性对照，黑色是脑衰老区的SS阳性神经元水平，白色是用人参皂甙治疗后的脑衰老海马区SS阳性神经元水平。
发明详述在本发明的药物组合物中的活性成分是人参皂甙单体，尤其是人参皂甙单体Rb1、Rb2、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Ro及其组合。这些人参皂甙单体的命名是根据各单体在色谱层析中的位置确定的，是本领域普通技术人员熟知的(Benishin，C.Neurochemistry International 21∶1-5(1992)；Chung，E.，Lee，K.Y.，Lee，Y.，Lee，Y.H.，和Lee，S.K.Steroids 63∶421-424(1998))。
本发明所述的人参皂甙的用途中，药物组合物可以通过任何与活性成分的药物动力学特征一致的途径来制造，并用于给药。
可口服的组合物可采用片剂，胶囊，粉末，颗粒，锭剂，液体或凝胶制备剂，例如口服，外用，或无菌胃肠外溶液或悬浮液的形式。口服的片剂和胶囊可以是单位剂量的存在形式，还可以包含常规的诸如粘合剂的赋形剂，例如糖浆，阿拉伯树胶，明胶，山梨醇，黄芪胶，或聚乙烯基吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖，蔗糖，玉米淀粉，磷酸钙，山梨醇或甘氨酸；片剂润滑剂，例如硬脂酸镁，滑石粉，聚乙二醇或二氧化硅；分解剂例如土豆淀粉，或可接受的湿润剂例如月桂醇硫酸钠。片剂可以根据在现有的药物生产中广为人知的方法来进行包覆。口服液体制备剂可以采用以下形式，例如水性的或油性的悬浮液，溶液，乳液，糖浆或酏剂，或可以在使用前用水或其它合适的载体重组的干制品形式存在。这样的液体制品可包含有常规的添加剂，像悬浮剂，例如，山梨醇，糖浆，甲基纤维素，葡萄糖浆，明胶，氢化的食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂，缩水山梨醇一油酸酯，或阿拉伯树胶；非水载体(可能包含食用脂肪)，例如杏仁油，分馏椰子油，油酯，例如甘油，丙二醇或乙醇；防腐剂，例如甲基或丙基对羟基安息香酸酯或山梨酸，和如需要的常规调味剂或色素。
活性成分亦可通过在无菌媒介中不经胃肠投药。根据所用的载体和浓度，药物可以悬浮或溶解在载体中。静脉输液是根据本发明使用的药物的另一途径。
对不同种类的病人和对不同疾病状态的安全和有效的剂量根据该领域所要求的，在临床实验中决定。可以理解的是，对任一特别的病人，特异的剂量水平是由多种因子决定的，包括该特定化合物的活性，年龄，体重，一般健康状况，性别，饮食，投药的时间，投药途径，排泄率，药物配伍和治疗中的疾病的严重程度。
为了更好的理解本发明的实质，下面将用从人参提取的人参皂甙混合物的细胞、基因和动物实验及其结果来说明其在制药领域中的新用途。同样的，单独使用各种人参皂甙或其各种组合也可达到同样的药理效果，区别仅在于使用的量上的不同。
人参皂甙对人脑皮质神经细胞株细胞的生存和生长的影响为探索人参皂甙在体外对人脑皮质神经细胞生存的影响，及其抗神经细胞衰老作用，用细胞生物学的方法，将人脑皮质神经细胞在低血清浓度环境，或缺乏生长因子的环境，诱导细胞凋亡。同时加入人参皂甙，观察其生物学效应。
实验培养人脑皮质神经细胞，将人参皂甙配成储液，在低小牛血清条件下加或不加人参皂甙，于规定时间计算总细胞数和台盼蓝染色计数，将细胞生长活力表示成活细胞数/总细胞数比例(％)。
用基因芯片研究人参皂甙对人脑皮质神经细胞株细胞基因表达方式的影响为探索人参皂甙在体外对人脑皮质神经细胞生存的影响，及其保护神经细胞作用，本文用细胞生物学的方法，将人参皂甙加入人脑皮质神经细胞培养体系中，观察其生物学效应。
细胞在人参皂甙的作用下，引起基因的表达方式的改变，这些改变的基因是人参皂甙作用的靶基因，可全面反映人参皂甙的作用机制。但是以往的研究多限於一个或几个基因，难以从基因的整体表达谱，全面地观察人脑皮质神经细胞对人参皂甙刺激的反应模式，近年来发展起来的基因芯片技术打破了这种限制。
基因芯片是将大量的靶基因片段有序地、高密度地固定在玻璃、硅等载体上的一项技术。基因表达谱芯片是目前应用得最广泛的生物芯片，是指将几千个基因特异的cDNA固定在一块基因芯片上，对不同来源的mRNA进行检测，例如不同个体(正常人与患者)、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激(包括不同诱导、不同治疗手段)的细胞等，从而大规模对这些基因表达特异性进行综合的分析。
本发明所用的基因芯片含18000个点，代表12000个人类基因，包括与细胞周期、细胞激动素、细胞能量、受体、信号传递、转录因子和管家基因等相关的基因。检测人参皂甙对人脑皮质神经细胞的作用。用常规方法制备基因芯片，抽取培养体系中培养细胞的总RNA，与探针杂交，通过荧光扫描检测和分析杂交的结果，并确定其表达强度。
人参皂甙抗衰老的动物实验研究以动物模型，细胞模型和生物芯片技术研究人参皂甙的抵抗脑衰老，增强记忆力的作用及其机理。
D-半乳糖亚急性中毒可诱导大鼠衰老模型。其病变与人体快速衰老类似，主要表现为神经系统损伤，体内抗氧化酶活力下降和免疫能力低下。
脑的衰老变化机理研究中，脑内生长抑素(Somatostatin，SS，或SRIF)的变化是人们颇为关注的神经肽之一。SS为环状14肽，与学习记忆密切相关，目前研究已确认，在大脑皮质和边缘系统海马结构内的SS神经元与垂体前叶生长激素的分泌和释放活动没有直接关系，而与学习、记忆密切相关，具有抗遗忘作用，是记忆的物质基础。
采用D-半乳糖亚急性中毒衰老模型大鼠，应用免疫组化技术，检测大鼠大脑海马结构SS阳性神经元的数量和分布，观察人参皂甙对衰老大鼠海马生长抑素变化的影响，探讨抗脑衰老，增强记忆力的作用。
发明效果本发明对已知的人参皂甙开发了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，可将人参皂甙用于制备抵抗神经细胞衰老、记忆力下降、神经细胞损伤的作用。
实施例下面的实施例仅作为说明，而不是为了限制权利要求的范围。
实施例1 用细胞生物学检测人参皂甙对人脑皮质神经细胞株细胞的生存和生长的影响
1.材料与方法实验细胞体外细胞培养人脑皮质神经细胞HCN-1A。
人参皂甙(选自Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Ro或其混合物)配成1g/m1的浓度贮存液备用。
神经细胞培养培养体系DMEM(Gibco)内含EGF 2u/ml，小牛血清10％，细胞4×105/ml，37℃，5％ CO2培养箱内培养。
2.人参皂甙对低小牛血清条件下神经细胞生长的影响收集细胞，接种50皿，设加人参皂甙(10μg/ml)和不加人参皂甙两组。继续培养，小牛血清减少为2％、培养体系DMEM(Gibco)内含EGF 2u/ml。于培养第1、2、3、4、5天分别计数5皿总细胞数和台盼兰拒染法计算活细胞数，细胞生长活力以活细胞数/总细胞数的比例(％)表示。
3.人参皂甙对无EGF生长因子下神经细胞生长的影响收集细胞，接种50皿，设加人参皂甙(10μg/ml)和不加人参皂甙两组。继续培养于不含EGF的培养体系，DMEM(Gibco)，小牛血清10％。于培养第1、2、3、4、5天分别计数5皿总细胞数和台盼兰拒染法计算活细胞数，细胞生长活力以活细胞数/总细胞数的比例(％)表示。
4.人参皂甙对神经细胞抵抗细胞凋亡的测定取收集细胞，调整细胞浓度，分别接种于上述培养体系中2×105/ml。以加人参皂甙(10μg/ml)为实验组，无人参皂甙为对照组，继续培养。于培养第2、3、4、5天分别计数总细胞数和台盼兰拒染法计算活细胞数，细胞生长活力以活细胞数/总细胞数的比例(％)表示。
5.结果与讨论经人参皂甙刺激后神经细胞数增加，尤在血清浓度为10％时细胞数显著高于无人参皂甙组(表1)。提示人参皂甙具有促进神经细胞株细胞增殖的作用。
表1 PDS在不同血清浓度时对造血细胞增殖的作用(细胞数×105)人参皂甙血清(％)对照组 实验组26.9 7.447.4 8.310 30.243.3
与人参皂甙共同孵育，血细胞随着培养时间的延长，细胞数逐渐减少，但生存的细胞数在存在人参皂甙时明显高于无人参皂甙的对照组。图1a表示在细胞培养至第5天时于2％血清时人参皂甙组仍有1×105细胞，而对照组(图1b)细胞数则为0。这提示人参皂甙对神经细胞株细胞具有支持细胞生存的生物效应。
与人参皂甙共同孵育，如图1a和b所示，在不同血清浓度，细胞培养至第5天时人参皂甙组细胞活力与血清浓度无相关性差异，但与无人参皂甙组相比，细胞活力呈显著性差异。结果提示人参皂甙对神经细胞生存活力具有明显的保护作用。
上述结果表明，人参皂甙能抵抗和减少神经细胞株细胞因外环境带来的损伤，支持细胞生存，保护神经细胞活力的作用，提示在体内可具有抗神经细胞失活及衰老活性。
实施例2 用基因芯片研究人参皂甙对人脑皮质神经细胞株细胞基因表达方式的影响1.材料与方法芯片制备芯片所用的12,000条全长已知基因cDNA，用通用引物进行PCR扩增，PCR产物长度为1000±50bp(少数例外)。PCR反应及产物纯化用标准方法进行，通过琼脂糖电泳监控PCR质量。靶基因溶解于3×SSC溶液中，用TeleChem公司的SpotBotTM Personsl Microarrayer点样仪及硅烷化玻片进行点样。点样后玻片经水合(2hr)、室温干燥10min、UV交联(能量值设定60mj/cm)，再分别用100％酒精处理30秒钟，晾干备用。
细胞的处理实验取体外培养的人脑皮质神经细胞HCN-1A。培养体系DMEM(Gibco)内含EGF 2u/ml，小牛血清10％，细胞4×105/ml，37℃，5％ CO2培养箱内培养。加入“人参皂甙”(本实施例所用的人参皂甙选自Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Ro或其混合物)，使终浓度为(10μg/ml)，不加“人参皂甙”为对照组，培养48小时，收获细胞，抽提总RNA。
探针制备用GIBCO公司的TRIZOL试剂一步法加以改进抽提总RNA，具体方法是细胞用冰PBS(pH7.2)洗涤2次，加TRIZOL裂解细胞；氯仿抽提一次；异丙醇沉淀RNA；75％乙醇洗2次，空气干燥(30min)或真空干燥(2-3min)，Nets Buffer溶解，紫外和电泳分析。
用Oligotex mRNA Midi Kit(Quagen公司)纯化mRNA。参照Roche公司的反转录试剂合标记探针并纯化。用Cy3-dUTP标记对照细胞的mRNA，用Cy5-dUTP标记”人参皂甙”刺激细胞的mRNA。乙醇沉淀后溶解在20uL 5×SSC+0.2％SDS杂交液中。
检测与分析用General Scanning公司的ScanArray 3000扫描芯片，用ScanAlyze软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。用40个管家基因进行Cy3和Cy5的均衡。用以下2个条件为判定基因差异表达的标准①Cy3和Cy5信号的比值的自然对数的绝对值＞0.916(基因的表达变化在2.5倍以上)。②Cy3或Cy5Cy3和Cy5信号值其中之一必须600以上。
结果与讨论(1) 芯片结果分析芯片杂交所用的双探针分别以“人参皂甙”刺激的人脑皮质神经细胞、和未处理的对照脑皮质神经细胞的mRNA为模板合成的，前者标以Cy5荧光素、后者标以Cy3荧光素。结果显示约168个基因(4.6％)具有2.5倍表达水平的差异，其中67条上调。
(2)“人参皂甙”诱导的上调基因“人参皂甙”刺激引起血人脑神经细胞上调表达2.5倍以上的基因，即Cy5/Cy3比值超过2.5的基因共67条，表1中列出了这些基因及其上调比例。
表1数据点 基因名称 平均比X68277 人酪氨酸蛋白磷酸酯酶的CL 100 mRNA2.864M26683 人gamma干扰素处理诱导的mRNA 2.622AF043938人Ras相关蛋白M-Ras/R-Ras3 mRNA 3.037AK000587人cDNA FLJ20580，REC00516克隆1.667X06290 人阿朴酯蛋白a的mRNA 3.343AI832029人wj99c05.x1cDNA，3′端 4.032Z78385 人HSZ78385 cDNA 2.504L11672 人Kruppel相关锌指蛋白质(HTF10)mRNA，完整编码区 3.217L13463 人螺旋-环-螺旋结构的磷蛋白(G0S8)mRNA，完整编码区 2.641D28915 人C型肝炎相关的微管聚集蛋白p44基因 3.384S42303 N-钙粘素人脐静脉内皮细胞mRNA，4132nt 2.633AL135135人DKFZp762J1812_r1 cDNA，5′端 2.827AW026208人wv09g05.x1 cDNA，3′端 2.661AB000462人SH3结合蛋白mRNA，完整编码区，克隆RES4-23A 2.519AL050164人mRNA；cDNA DKFZp586C1622(源自克隆DKFZp586C1622)；2.548部分编码区AB020685人KIAA0878蛋白mRNA，完整编码区 2.591Y17829 人Homer相关蛋白Syn47的mRNA 2.596X54156 人转化相关蛋白p53(也称转化关联蛋白p53，细胞瘤抗原p53， 3.569和非滤过性毒菌瘤抗原p53)的p53基因D79992 人KIAA0170基因的mRNA为，完整编码区 4.069L41680 人alpha-2，8多唾液转移酶(PST)基因，完整编码区 4.723AF004849人PKY蛋白激酶mRNA，完整编码区 1.667Y11312 人磷酸肌醇3激酶mRNA1.667D78130 人角鲨烯环氧酶mRNA，完整编码区 2.504AF026166人含伴随TCP-1beta亚单位同等体mRNA，完整编码区 2.513AF251441人sterile-alpha基序和亮氨酸拉链包含激酶AZK mRNA，完整编2.633码区AW274839人xm61e02.x1cDNA，3′端2.732AW953755人EST365825 cDNA 2.786AB011132人KIAA0560蛋白mRNA，部分编码区 2.835AK000507人FLJ20500 fis cDNA，KAT09159克隆 3nm_03826人N-乙荃马来酰亚胺-敏感因子粘附蛋白gamma(NAPG)的mRNA 3AL137347人DKFZp761M1511cDNA(源自克隆DKFZp761M1511)的mRNA； 3部分编码区nm_006842 人结合相关蛋白145，SF3b亚基(SAP145)的mRNA 3X57928 人前列腺分泌蛋白PSP-94外显子1基因 3nm_007341 人SH3-结合域富谷氨酸蛋白(SH3BGR)，mRNA 3J03037 人碳脱水酶II mRNA，完整编码区 3NM_007230.dat 人内质网alpha-甘露糖甘酶1(MANA-ER)，mRNA3M95787人22k道平滑肌蛋白(SM22)mRNA，完整编码区 3AL079292 人全长插入cDNA的mRNA，源自克隆EUROIMAGE 48814 3J03464人胶原蛋白alpha-2，I型mRNA，完整编码区，克隆pHCOL2A13X07730人前列腺特效抗原mRNA3M11717人热激活蛋白(hsp70)基因，完整编码区 3nm_005346 人70kD热激活蛋白1(HSPA1B)的mRNA 3AJ005821 人类X蛋白1的mRNA3X14420人前alpha-1，3X型胶原蛋白的mRNA 3U72649人BTG2(BTG2)mRNA，完整编码区3X13839人血管平滑肌alpha肌动蛋白的mRNA 3U42031人54kDa黄体酮受体联合免疫亲和蛋白FKBP54 mRNA，部分编码 3区M96995人表皮生长因子受体结合蛋白GRB2(EGFRBP-GRB2)mRNA序列 3U76713人apobec-1结合蛋白1 mRNA，完整编码区3U09368人锌指蛋白ZNF1403AK001419 人FLJ10557 fis的cDNA，克隆NT2RP2002537 3U10324人核因子NF90 mRNA，完整编码区 3U23942人羊毛甾醇14-脱甲基酶细胞色素P450(CYP51)mRNA，完整编码区3J03077人共beta葡萄糖甘酶(促催化剂)mRNA，完整编码区3X56832人肌肉特烯醇酶ENO3基因 3X68277人酪氨酸蛋白磷酸酯酶CL 100 mRNA 3X92106人博来霉素水解酶mRNA3nm 006784 人WD重复域3(WDR3)mRNA 3.051AF070554 人克隆24582mRNA序列 3.13AL050361 人cDNA DKFZp564H0223(源自克隆DKFZp564H0223)的mRNA 3.217Z49835人二硫异构酶蛋白mRNA3.234AI499351 人to10f09.x1 cDNA，3′端3.241AB020704 人KIAA0897蛋白的mRNA，部分编码区3.329D84488人微GTP-结合蛋白的mRNA，完整编码区 3.343AK000491 人FLJ20484fis的cDNA，克隆KAT07770 3.384AW167513 人xn55a12.x1 cDNA，3′端4.032
基因芯片分析结果(1) 引起与抑癌相关基因的上调如p53基因等。p53基因是抑制癌症的明星基因，它的作用是监视体内细胞的DNA损伤，一旦发生这种情况即阻止该细胞的分裂。这样的话就可预防癌症的发生，对于保持机体健康十分重要。
(2) 引起特定转录因子基因的上调如锌指蛋白家族、细胞核转录因子亚基及在进化中保守的KRAB蛋白等等。特别是KRAB蛋白，各种实验表明它和脑海马区的记忆功能密切相关，它的表达水平直接影响短期记忆的效果。
(3) 与细胞骨架相关基因的上调如微管聚合蛋白、钙粘素、胶原蛋白及肌动蛋白和唾液酸转移酶等等。它们表达的增加能够加强细胞与细胞之间的联系和相互作用，并且能促进细胞功能区域的形成。而唾液酸转移酶能在胎脑中形成神经细胞粘连分子，对于脑的发育十分重要。
(4) 各种受体蛋白表达的上调如生长因子受体结合蛋白等等，它们具有和EGF和PDGF结合的功能区域，能调节生物的新陈代谢。
(5) 应激蛋白表达的上调如HSP70等，它的功能是使得那些在空间折叠发生错误的蛋白回复到正确的构象，从而能恢复它们本来具有的功能。
(6) 合成分解酶类的上调固醇合成酶、酶糖苷酶及二硫化物异构酶等等。这些酶类能够合成体内必需成分以及降解有害物质。
(7) 信号传导蛋白的上调如Ras超家族的GTP结合蛋白、磷酸酶和磷酸激酶。Ras家族是一类十分重要的信号传导蛋白家族，和多种重要功能有关。细胞信号主要是通过某些蛋白的磷酸化和脱磷酸来传递，这就需要磷酸酶和磷酸激酶的作用。
实施例3 人参皂甙抗衰老的动物实验研究报告实验动物分组四月龄雄性Wistar大鼠18只，体重265±36g。随机分为对照组、脑衰老组和脑衰老给药组三组，每组6只。
脑衰老模型的建立及给药皮下注射2ml的D-半乳糖(48mg/kg.d)诱导脑衰老。
脑衰老组 皮下注射D-半乳糖(48mg/kg.d)6周皮下注射D-半乳糖(48mg/kg.d)， 6周脑衰老给药组 同时，给予“人参皂甙”灌胃 6周(30mg/kg.d)对照组 皮下注射生理盐水(2ml/kg.d) 6周*本实施例所用的人参皂甙选自Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Ro或其混合物。
取材、固定、切片2％戊二醛灌注固定，取大鼠端脑中间1/3部位(海马所在地)；2％戊二醛后固定6-8小时；梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋；Leitz 1512切片机对大鼠脑冠状位连续切片，片厚5μm，隔三取一连续观测。
免疫组化ABC法检测SS阳性细胞一抗为鼠抗SS血清(Senta Cruse，USA)1∶1500稀释，湿盒中4℃过夜；生物素标记的抗兔IgG 1∶50稀释，37℃湿盒中30分钟；ABC1∶100稀释，37℃湿盒中温育30分钟；DAB染色，H.E.复染封片；做免疫组化时，分别以人胰腺石蜡切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。
结果观察——光镜下观察及显微摄影Olympus BH2显微镜下观察比较3组大鼠海马SS阳性神经元分布情况。重点观察海马各区SS阳性神经元分布特点。每组选取代表性视野用Olympus显微摄影系统进行显微摄影。
图像采样在Olympus BH2显微镜10x10下，用JVC Digital Camera分别对各组切片的CA1、CA3、CA4&DG区进行随机采样(采样过程中保持光源亮度恒定，以保证各组切片光密度的可比性)。
图像分析采样结果输入计算机，应用HPIAS-1000(高清晰度病理图文分析系统，Highresolution Pathological Image Analysis System)进行图像分析，测定SS阳性神经元内SS物质的的积分光密度。
数据处理及统计分析数据以平均数±标准差表示，用SPSS 8.0统计软件进行单因素方差分析ANOVA。
实验结果图2显示了实验检测的大鼠海马区组织图。(DAB染色 H.E.复染，x40)图3是阳性对照图，用大鼠胰腺组织的免疫组织化学染色ABC法，DAB显色。细胞浆内含棕黄色颗粒的为SS阳性细胞。(DAB染色 H.E.复染，×400)。可见图中存在许多棕黄色颗粒(黑白图上为浅色颗粒)。
图4是正常大鼠海马CA1区组织用免疫组织化学染色ABC法，DAB显色的阴性对照图。细胞浆内含棕黄色颗粒的为SS阳性细胞。(DAB染色，H.E.复染，×400)。
图5是以PBS代替抗SS抗体(一抗)，则不含棕黄色颗粒。(DAB染色，H.E.复染，×400)。
图6是脑衰老组大鼠海马回组织图，与阳性对照相比，可见SS阳性细胞明显减少，从图中可见，仅3-4个棕黄色颗粒。(DAB染色，H.E.复染，×400)图7是“人参皂甙”治疗的脑衰老大鼠海马回组织图，可见SS阳性细胞未见明显减少(DAB染色，H.E.复染，×400)。
表2描述了SS阳性神经元计数的结果表2三组大鼠海马SS阳性神经元计数结果(个/mm2)
图8是柱状图，显示三组大鼠海马各区SS神经元计数结果。可见脑衰老治疗组的SS阳性神经元水平基本接近正常的阳性对照组水平，而脑衰老组明显低于正常水平。
注**表示与对照组比较，P＜0.01；*表示与脑衰老组比较，P＜0.01。
结果表明1.注射D-半乳糖可导致大鼠大脑海马各区SS阳性神经元明显减少而表现为脑衰老的形态。
2.“人参皂甙”可有效地阻止大鼠大脑海马各区SS阳性神经元的减少，有效率达到90％以上。
实施例4 人参皂甙单体复合物用本领域已知的常规方法配制了人参皂甙单体复合物，其主要活性成分及其比例如下人参皂甙HPLC含量测定结果
用上述实施例1-3的方法检测，发现它对于抵抗和减轻神经细胞因外环境压力带来的损伤，保护神经细胞活力，和抵抗脑衰老，增强记忆力具有良好的作用。
权利要求
1.人参皂甙单体的用途，其特征在于，用于制备药物，该药物用于1)抵抗和减轻神经细胞因外环境压力带来的损伤，保护神经细胞活力，和/或2)抵抗脑衰老，增强记忆力。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述人参皂甙单体选自Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Ro或其混合物。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述人参皂甙单体选自Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rf或其混合物。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还含有药物学上可接受的载体。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物用于哺乳动物。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述药物用于人类。
全文摘要
本发明提供了人参皂甙单体用于制备药物的新颖用途，该药物用于1)抵抗和减轻神经细胞因外环境压力带来的损伤，保护神经细胞活力，和/或2)抵抗脑衰老，增强记忆力。
文档编号A61K31/7028GK1457793SQ0211164
公开日2003年11月26日 申请日期2002年5月13日 优先权日2002年5月13日
发明者吴超群, 郭红卫, 钟翠平, 高瑞兰 申请人:上海复旦金科生物技术有限公司