专利名称：一种新的葡萄糖及胰岛素应答元件的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多核苷酸——GIRE，此多核苷酸序列具有启动子的功能，同时受葡萄糖以及胰岛素浓度的调控，使其后接基因(或cDNA)的表达在转录水平上受到葡萄糖以及胰岛素的浓度调控。本发明还涉及此多核苷酸制备方法和及其在糖尿病基因治疗中的应用。
背景技术：
糖尿病是因胰岛素绝对或相对分泌不足或周围组织靶细胞对胰岛素敏感性降低引起糖、脂肪、蛋白质三大物质代谢以及水和电解质代谢紊乱的一种代谢性疾病。表现为糖耐量降低、高血糖以及尿糖。主要分为两型胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，又称为I型糖尿病；非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，又称为II型糖尿病。
对于糖尿病的彻底治疗，基因治疗将会是一种理想的方法。基因治疗即是通过一定的载体系统，将外源基因导入患者体内，以实现治疗基因的安全、稳定、持续、高效的表达，以治疗此种基因产物缺乏而引起的病症。从本质上讲，基因治疗是将基因作为药物，从基因水平上对缺损基因进行修补、置换或调节，使其功能得以恢复，将是最根本、最彻底的治疗方法。
糖尿病基因治疗理论上原理比较简单，即将胰岛素或其衍生物基因通过一定的载体转移到糖尿病患者体内，使之能够长期、稳定、安全地表达，使患者自身根据血糖浓度的变化表达并分泌胰岛素，降低血糖，从而达到治疗糖尿病的目的。其技术关键在于胰岛素基因在患者体内的高效表达、持续表达以及调控表达(表达根据血糖浓度而定)。
因此，找到合适的葡萄糖/胰岛素应答元件对于实现胰岛素基因再体内的调控表达具有重要的意义。
GRP78基因编码70KD热休克蛋白5，属于HSP70蛋白家族。对于蛋白质在内质网中的折叠与组装起着重要的作用。本发明首次阐明了GRP78基因表达受葡萄糖调控的现象，同时，构建了其葡萄糖应答元件，以指导基因表达受葡萄糖浓度调控。并且，在此基础上，引入了负调控的胰岛素应答元件，以更好的用于糖尿病基因治疗。
发明介绍本发明的一个目的是提供一种受葡萄糖以及胰岛素浓度调控的、用于指导基因或者cDNA表达的多核苷酸序列——GIRE。
本发明的另一个目的是提供含有此多核苷酸的重组载体，此载体可用于糖尿病基因治疗或者糖尿病及其相关疾病的临床检测。
本发明的另一个目的是提供含有此多核苷酸的基因工程化宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供与此多核苷酸结合的生物活性物质、小分子、无机物、有机物、化合物。
本发明涉及一种分离的多核苷酸，该多核苷酸是人源的，它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体(a)具有序列表1与2中多核苷酸序列；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；(c)与(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少70％相同性的多核苷酸。
本发明另外涉及一种含有本发明多核苷酸的载体，特别是表达载体；一种用该载体遗传工程化的宿主细胞，包括转化、转导或转染的宿主细胞。
本发明还涉及一种利用此多核苷酸序列体外检测与葡萄糖应答异常相关的疾病或疾病易感性的方法，包括检测生物样品中多核苷酸序列中的突变。
本发明也涉及一种药物组合物，它含有本发明序列或其模拟物、激活剂、拮抗剂或抑制剂以及药学上可接受的载体。
本发明还涉及本发明的多核苷酸在制备用于治疗糖尿病及其相关疾病。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。
“缺失”是指在核苷酸序列中一个或多个核苷酸的缺失。
“插入”或“添加”是指在核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个或核苷酸的增加。“替换”是指由不同的核苷酸替换一个或多个核苷酸。
“激动剂”是指当与GIRE结合时，一种可改变该启动子受葡萄糖和胰岛素调节活性的分子。激动剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合的分子。
“拮抗剂”或“抑制物”是指当与GIRE结合时，一种可封闭或调节其生物学活性的分子。拮抗剂和抑制物可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合GIRE的分子。
“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合。例如，序列“C-T-G-A”可与互补的序列“G-A-C-T”结合。两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。
“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本上同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全同源的序列与靶序列在的严格性程度降低的条件下的结合。这并不意味严格性程度降低的条件允许非特异性结合，因为严格性程度降低的条件要求两条序列相互的结合为特异性或选择性相互作用。
“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。“反义链”是指与“有义链”互补的核酸链。
“衍生物”是指GIRE的核酸的化学修饰物。这种化学修饰物可以是用烷基、酰基或氨基替换氢原子。
首先，通过基因芯片技术，筛选STZ诱导糖尿病模型小鼠肝脏组织中表达受葡萄糖调控的基因。选定GRP78基因后，将其与人GRP78基因进行同源比较，获得高度同源的结果。克隆人GRP78基因中5’调控区。然后加入已知负调控的胰岛素应答元件，形成GIRE。最终构建GIRE指导的GFP表达载体，进行细胞转染，验证GIRE的葡萄糖以及胰岛素应答活性。
本发明获得了一种葡萄糖以及胰岛素应答元件，可用于指导特定基因的表达，使之受葡萄糖以及胰岛素浓度的调控。可用于糖尿病基因治疗载体，以及相关疾病检测试剂的构建。
图1为Northern结果1、2两道为高血糖时表达情况，3、4则为低血糖时表达情况；图2为胰岛素诱导表达结果左边为含有IRS的报告基因载体分别在不加胰岛素(C)、加胰岛素(I)情况下的表达；右边为不含有IRS的报告基因载体分别在不加胰岛素(C)、加胰岛素(I)情况下的表达；图3为pGIRE-GFP示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 Selecting Glucose Regulated Gene by DNA Microarray基因芯片或基因微矩阵(DNA Microarray)是目前许多国家实验室和大制药公司都在着手研制和开发的新技术，它是指将大量的靶基因片段有序地、高密度地排列在玻璃、硅等载体上，然后用荧光检测和计算机软件进行数据的比较和分析，以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。(一)STZ诱导糖尿病模型小鼠的制备4-6周龄、25克雄性昆明鼠，按150mg/kg体重注射streptozotocin(STZ)，测定随机血糖浓度，大于25mM、且稳定一周，即认为建模成功。将糖尿病模型小鼠禁食20小时，使其血糖降至正常范围，将其分为两组，每组5只第一组立即引颈处死，分离肝脏组织，液氮冻存；第二组，给以正常饲料，进食后，当血糖浓度回复到大于25mM，计时，90分钟后，引颈处死，分离肝脏组织，液氮冻存；(二)点样本实验所选用芯片为联合基因科技公司产品，具体方法如下各种不同的全长小鼠cDNA共计14000条多核苷酸序列作为靶DNA，将它们分别通过PCR进行扩增，纯化所得扩增产物后将其浓度调到500ng/ul左右，用Cartesian 7500点样仪(购自美国Cartesian公司)点于玻璃介质上，点与点之间的距离为280μm。将点样后的玻片进行水合、干燥、置于紫外交联仪中交联，洗脱后干燥使DNA固定在玻璃片上制备成芯片。其具体方法步骤在文献中已有多种报道，本实施例的点样后处理步骤是1.潮湿环境中水合4小时；2.0.2％SDS洗涤1分钟；3.ddH2O洗涤两次，每次1分钟；4.NaBH4封闭5分钟；5.95℃水中2分钟；6.0.2％SDS洗涤1分钟；7.ddH2O冲洗两次；8.凉干，25℃储存于暗处备用。(三)探针标记用一步法分别从正常(一)中肝脏组织抽提总mRNA，并用Oligotex mRNA Midi Kit(购自QiaGen公司)纯化mRNA，通过反转录分别将荧光试剂Cy3dUTP(5-Amino-propargyl-2’-deoxyuridine 5’-triphate coupled to Cy3 fluorescentdye，购自Amersham Phamacia Biotech公司)标记高血糖肝组织的mRNA，用荧光试剂Cy5dUTP(5-Amino-propargyl-2’-deoxyuridine 5-triphate coupled to Cy5 fluorescentdye，购自Amersham Phamacia Biotech公司)标记低血糖组织mRNA，经纯化后制备出探针。(三)杂交分别将来自以上两种组织的探针与芯片一起在UniHybTMHybridization Solution(购自TeleChem公司)杂交液中进行杂交16小时，室温用洗涤液(1×SSC，0.2％SDS)洗涤后用ScanArray 3000扫描仪(购自美国General Scanning公司)进行扫描，扫描的图象用Imagene软件(美国Biodiscovery公司)进行数据分析处理，算出每个点的Cy3/Cy5比值，该比值小于0.5大于2的点被认为是表达有差异的基因。
实验结果表明，GRP78Cy3signal＝1005.719(取四次实验的平均值)，Cy5signal＝348.865(取四次实验的平均值)，Cy3/Cy5＝2.7，有明显差异，说明GRP78的表达在转录水平受葡萄糖调控。实施例2 Northern印迹法分析GRP78基因的表达用一步法提取总RNA。该法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M异硫氰酸胍-25mM柠檬酸钠，0.2M乙酸钠(pH4.0)对组织进行匀浆，加入1倍体积的苯酚和1/5体积的氯仿-异戊醇(49∶1)，混合后离心。吸出水相层，加入异丙醇(0.8体积)并将混合物离心得到RNA沉淀。将得到的RNA沉淀用70％乙醇洗涤，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸钠-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳。然后转移至硝酸纤维素膜上。用α-32P dATP通过随机引物法制备32P-标记的DNA探针。所用的DNA探针为序列表1所示的序列(682bp至945bp)。将32P-标记的探针(约2×106cpm/ml)与转移了RNA的硝酸纤维素膜在一溶液中于42℃杂交过夜，该溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鲑精DNA。杂交之后，将滤膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用放射自显影法进行分析和定量。见附图1。实施例3小鼠与人GRP78基因的同源检索对于小鼠与人GRP78基因，用Blast程序在Genbank、Swissport等数据库进行同源检索。其核苷酸序列的相似性为76％，氨基酸序列相似性为90％，两者高度同源。实施例4用PCR方法克隆人GRP78基因5’调控区用Qiagene的GenomicDNA纯化试剂盒提取人血白细胞中基因组DNA，用下列引物进行PCR扩增Primer15’-tgattgaaatgaaagaagctgta-3’Primer25’-caccgtcgcctactcggcttata-3’Primer1为位于序列表1的5’端的第1bp开始的正向序列；Primer2为的序列表1中的3’端反向互补序列。
扩增后序列见序列表1扩增反应的条件在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应30个周期94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min。连接到pT-easy载体上(Promega公司产品)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与所示的完全相同。实施例5胰岛素应答元件(IRS)的合成及功能检测化学法合成CGGGATCCCGATCAGGCTGTTTTTGTGTGCCTGTTTTGCTATTTTACGGATCCCG及其互补链(Bioasia公司)。IRS的功能检测分别将含有IRS以及不含有IRS的表达载体pCAT转染细胞，分别测定加胰岛素以及不加胰岛素时CAT活性。见附图2实施例6 GIRE的构建将实施例5双链DNA两端加上SspI酶切位点，插入实施例4已经连接到pT-easy载体上的GRP78基因5’调控区序列中297位碱基。实施例7含有GIRE序列的GFP报告基因载体的构建pGFP1(Clontech公司产品)载体先用EcoRI酶切，将实施例6中GIRE序列利用pT-easy载体上的EcoRI酶切位点进行酶切，插入pGFP1载体，获得GIRE指导的GFP报告基因载体，用以转染细胞，检测GIRE葡萄糖以及胰岛素应答活性。
序列表<110> 上海复旦深慧基因科技有限公司<120> 一种新的葡萄糖及胰岛素应答元件<130> 00011<160> 2<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 2252<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 1tgattgaaat gaaagaagct gtaatgtggt caaatgatga tttctatctt aatgctggac60tgatgcaagc caaagaaggg tcaatgttgc cgcaggatta caagccctgc tgaaagagat120gcatgatgca acctctgtag tgaacagagt caactcttga gtcaccagtc taacctttga180gaagcactaa ggaaaaagaa aattcttgag tactgagtca caggctcaac atcttaataa240agtgtgttta ggatgtttta gtggtatctg gacacagtat acccatgaat ctcaaatatt300tcatatcaga gctttgccct ttccatagta ggtcctccaa aaacattcct caaacaaatg360aatttttttt ttttttttga gatggagtct agctctgctg cccaggctgg agtgtagtga420cgtgatctcg gctcactgca acctccacct cccgggttca agcgattctc ctgcctcagc480ctcccgagta gctgggacta caggcatgca ccaccacgcc cagctaattt ttggattttt540atagagatgg ggtttcatcg tgttaccccg gatggtcttg atctcctgac cccgtgatcc600gcccacctcg gcctcccaaa gtgttgggat tacaggcgtg agccaccacg cccggccaca660gatgaatttt ttgttttaaa gttaagagat caggcacagt gtctcacacc tgtaatccca720gcactttggg aggccgaggt gggcagatcg cttgaggttg ggagttcgaa accagcctgg780ctaaaatggt gaaacctcat ctccacaaaa aaaaaaaaaa aaaaattagc caggcatggt840ggtgcgtgcc tgtaatccca gctactcagg aggctgaggc aggagaatcg cttgaacccc900ggaagcggag gttgcagtga gctgagattg cactactgaa ctccagcctg ggcgtgacag960agtgatactc cgtcttgaaa aaaaaaaaag tattggcaat agagtgaact ccacctggtt1020atcaatccta actccatcac tcaccagctc tgtgacttgt ttagttattt aatctttttc1080agtttcaatg tcctcatctg gaaaacggga aatgcctacc gagtattgaa ctgtcaagac1140taaatgacac atgaaaagca cactgaacaa tgcttaatcc acggtaggct ttcagcaaat1200agtggtctct attatttttt gcaacaggat gttatataag aataaggcat tatcaagacg1260attttcgcct atcaaatgtg ttgtctgcgt gtacatcaga ccttttcctg gaatgaaggt1320agaaaagtat caacaataaa ggatggagaa agccccgtaa atgataacct ttgccccaga1380gggaaaggat gggcagcgga ggggaaagta aagggtggca agctagaaaa attagacatc1440cagtgtggga gggctggcac tggagtgggt tgccacagta gggaggggac tcagagctgg1500aggcaattcc tttggccggg cttgtcctgc gacttaccgt ggggcagcgc aatgtggaga1560ggcctggtaa aatggctggg caagggtgcg gaggggacat aactggcagg aaggagtcat1620gattcgtggt cgaacagagt ccagaccagc tcgacctgtg agcaacgaac ggccctgaga1680ctcgcatacc ccaataccgg tagtggccgt gaagggcaaa gaaatgtgtt ctgaggcgat1740cccagcatct aagctgcgac tggtctactc agagactgga tggaagctgg gaagagaaag1800ctgcttcccg cttcggggtg agggatggag gaagggagaa caagcagtag agaagaaaaa1860gtttcagatc ccacagcccc ggggggtcac tcctgctgga cctactccga ccccctaggg1920ccgggagtga aggcgggact tgtgcggtta ccagcggaaa tgcctcgggg tcagaagtcg1980caggagagat agacagctgc tgaaccaatg ggaccagcgg atggggcgga tgttatctac2040cattggtgaa cgttagaaac gaatagcagc caatgaatca gctggggggg gcggagcagt2100gacgtttatt gcggaggggg ccgcttcgaa tcggcggcgg ccagcttggt ggcctgggcc2160aatgaacggc ctccaacgag cagggccttc accaatcggc ggcctccacg acggggctgg2220gggagggtat ataagccgag taggcgacgg tg 2252<210> 2<211> 55<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 2cgggatcccg atcaggctgt ttttgtgtgc ctgttttgct attttacgga tcccg 5权利要求
1.一种分离的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含选自下组中的一种(a)是编码GRP78蛋白的基因的5’调控区的多核苷酸，其中插入负调控的胰岛素应答元件；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；(c)与(a)或(b)有至少70％相同性的多核苷酸；(d)在高严谨条件下，可与(a)或(b)全部或部分核酸序列杂交的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含有SEQ ID No 1中1～2252位的序列。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含有SEQ ID No 2中1～55位的序列。
4.如权利要求1所述的高严谨条件，其特征在于0.2xSSC～2xSSC，0.1％SDS，65℃。
5.权利要求1～4中的任意多核苷酸序列，其特征在于它们可以是mRNA、cDNA、互补DNA、anti-senseDNA、单链DNA、双链DNA。
6.一种含有外源多核苷酸的重组载体，其特征在于它是由权利要求1～5中的任一权利要求所述的多核苷酸与质粒、病毒或表达载体构建而成的重组载体。
7.一种含有外源多核苷酸的遗传工程化宿主细胞，其特征在于它是选自于下列一种宿主细胞(a)用权利要求6所述的重组载体转化或转导的宿主细胞；(b)用权利要求1～5中的任一权利要求所述多核苷酸转化或转导的宿主细胞；(c)宿主细胞的种类包括植物、植物细胞、细菌、酵母、真菌、原生动物、藻类、动物和动物细胞。
8.一类可调节权利要求1所述的多核苷酸的物质，其特征在于它们是模拟、促进、拮抗或抑制权利要求1所述的多核苷酸的血糖应答活性。
9.如权利要求8所述的物质，其特征在于它们是可以与权利要求1所述的多核苷酸结合的生物活性物质，如多肽、蛋白质、权利要求1所述的多核苷酸序列或其片断的反义序列、小分子、无机物、有机物、化合物。
10.可与权利要求1～5权利中的任一权利要求所述的多核苷酸结合的生物活性物质、小分子、无机物、有机物、化合物。
11.一种药剂，其特征在于包含由权利要求1～5中的任一权利要求所述的多核苷酸，或权利要求6中所述的重组载体，或权利要求7中所述的遗传工程化宿主细胞，或权利要求8～9中所述的物质，以及药剂运载体、辅助试剂或辅药。
12.权利要求11中的药剂用于临床诊断、检测，以及糖尿病基因治疗。
13.权利要求12中的基因治疗，临床诊断、检测，所针对的病症包括胰岛素依赖型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病，以及其他由于权利要求1～5中所述多核苷酸的血糖应答活性不正常(包括降低、缺失、升高、过分升高)所造成的机体生理紊乱。
14.如权利要求1～5中的任一权利要求所述的核酸分子的应用，其特征在于它作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，或者用于研究或检测多核苷酸中可以引起多核苷酸片段血糖应答活性改变的核酸变异，或者用权利要求1～5中的任一权利要求所述的核酸分子，来筛选可与它们结合的物质，或调解它们活性的模拟物、激动剂、拮抗剂或抑制剂。
全文摘要
本发明公开了一种多核苷酸序列—GIRE(glucose and insulin responsiveelement)。此多核苷酸序列具有启动子的功能，同时受葡萄糖以及胰岛素浓度的调控，使其后接基因(或cDNA)的表达在转录水平上受到葡萄糖以及胰岛素的浓度调控。本发明还公开了此多核苷酸序列用于糖尿病基因治疗的方法。
文档编号A61P3/00GK1454900SQ0211156
公开日2003年11月12日 申请日期2002年4月29日 优先权日2002年4月29日
发明者卢大儒 申请人:上海复旦深慧基因科技有限公司