专利名称：治疗肺癌的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及与顺铂联合使用以治疗肺癌的药物，其中包含作为活性组分的氨柔比星或其可药用盐。
背景技术：
氨柔比星((+)-(7S，9S)-9-乙酰基-9-氨基-7-[(2-脱氧-β-D-赤-吡喃戊糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，11-二羟基-5，12-并四苯二酮)是下述化学结构式代表的蒽环类抗生素化合物(JP-Hei 3-5397B) 氨柔比星在体内易于被还原形成是13-羟基化产物的代谢物氨柔比星醇(amrubicinol)。氨柔比星醇抑制肿瘤细胞生长的活性显著强于氨柔比星。阿霉素和柔红霉素—另外的蒽环类抗生素化合物也形成还原的代谢物，但是相反，它们的代谢物却具有降低的活性(CancerChemothr.Pharmacol.，30，51-57(1992))。对于心脏毒性，在兔子长期实验模型中，氨柔比星也远比阿霉素弱(Invest.New Drug，15，219-225(1997))。
已知，虽然蒽环类抗生素化合物具有类似的结构，但如下面所述，它们在其适应症、作用机制等方面却有所不同。柔红霉素和去甲氧柔红霉素被批准用于治疗白血病，但是没有被批准用于治疗实体癌。另一方面，阿霉素、表柔比星、吡柔比星、氨柔比星被批准用于治疗实体癌(Drugs in Japan，23 rd.Ed.，2000，Jiho，Inc.)。柔红霉素和阿霉素以类似程度抑制DNA和RNA的合成，但是氨柔比星和marcellomycin对RNA合成的抑制作用比对DNA合成的抑制作用强，因此，它们发挥抗肿瘤活性的机制就大不相同(JJSHP，27，1087-1110(1991))。已经知道，如此以来，即使药物属于相同的蒽环类抗生素种类，但是它们由于癌症的种类不同而具有不同的作用，并且相同的抗癌剂因癌症的种类不同也具有不同的作用。因此，有必要通过实验来特别确定具体的抗癌剂对于特定肿瘤(癌症)是否有效。
据描述，通过在体外与另一抗癌剂联合使用，氨柔比星表现出出叠加效果(Investigational New Drugs，14，357-363(1996))。例如，据描述盐酸氨柔比星与顺铂等联合使用，在人T-细胞白血病MOLT-3细胞株和人骨肉瘤MG-63细胞株上显示出叠加效果。另外，已经有人描述了在鼠白血病p388细胞株的实验中氨柔比星与顺铂等联合使用的效果(Yoshikazu YANAGI等人，Abstracts of publicationsin Japanese Cancer Association，No.2168(1989))。然而，迄今为止没有关于氨柔比星与顺铂联合使用治疗肺癌的报道。
虽然顺铂是优良的抗癌剂，但已知它也具有带来麻烦的副作用如肾毒性等等。
发明公开作为充分研究的结果，本发明者们发现了这样的事实当氨柔比星与顺铂联合使用时，在没有增加单独使用治疗剂时所观察到的副作用的情况下，肺癌可被显著治愈，并且在氨柔比星与顺铂联合使用的过程，由于在保持疗效的同时各自的剂量减小了，副作用可显著降低。由此完成了本发明。
本发明的要点如下面所述(1)与顺铂联合使用以治疗肺癌的药物，其中包含做为活性组分的氨柔比星或其可药用盐。
(2)如在(1)中所述的治疗肺癌的药物，其中所述肺癌是小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞肺癌或大细胞肺癌。
(3)如(1)中所述的治疗肺癌的药物，其中所述肺癌是小细胞肺癌。
(4)如在(1)-(3)任一项中所述的治疗肺癌的药物，其中所述活性组分是盐酸氨柔比星。
(5)如(1)-(4)任一项中所述的治疗肺癌的药物，其中所述药物与顺铂同时、分隔或顺序给药。
(6)如(1)-(5)任一项中所述的治疗肺癌的药物，其中所述药物包含作为活性组分的氨柔比星或其可药用盐，并且是用于治疗已经施用了顺铂或计划施用顺铂的肺癌患者。
(7)如(1)-(6)任一项中所述的用于与顺铂联合使用以治疗肺癌的药物，其中所述药物被这样包装，使得约60-约135mg/m2的氨柔比星或其可药用盐在一个单一剂量或2-5个分剂量中给药。
(8)如(7)中所述的治疗肺癌的药物，其中所述药物被这样包装，使得约110-约130mg/m2的氨柔比星或其可药用盐在一个单一的剂量中给药。
(9)如(7)中所述的治疗肺癌的药物，其中所述药物被这样包装，使得约25-约50mg/m2的氨柔比星或其可药用盐一天给药一次、给药三天。
(10)如(7)中所述的治疗肺癌的药物，其中所述药物被这样包装，使得约35-约45mg/m2的氨柔比星或其可药用盐一天给药一次、给药三天。
(11)如(9)或(10)中所述的治疗肺癌的药物，其中氨柔比星或其可药用盐是连续三天给药。
(12)如(7)-(11)任一项中所述的治疗肺癌的药物，其中将约35-约90mg/m2联合使用的顺铂在一个单一的剂量中给药。
(13)如(7)-(11)任一项中所述的治疗肺癌的药物，其中将约50-约70mg/m2联合使用的顺铂在一个单一的剂量中给药。
(14)如(7)-(13)任一项中所述的治疗肺癌的药物，所述药物包含作为活性组分的氨柔比星或其可药用盐，并且是用于肺癌患者，其中所述患者由于副作用而不能继续接受顺铂治疗，以及其中所述患者正在以会引起降低的副作用的量接受顺铂给药。
(15)氨柔比星或其可药用盐在制备用于与顺铂联合使用以治疗肺癌的药物中的应用。
(16)治疗肺癌的方法，包括施用氨柔比星或其可药用盐和顺铂。
附图简述附
图1显示当将0.5倍最大耐受剂量(MTD)的盐酸氨柔比星和0.5倍最大耐受剂量(MTD)的顺铂联合使用时，对小细胞肺癌细胞生长的抑制效果。○表示盐酸氨柔比星单独给药组，△表示顺铂(CDDP)单独给药组，◆表示联合给药组。
附图2显示当将0.5倍最大耐受剂量的盐酸氨柔比星和0.5倍最大耐受剂量的顺铂联合使用时，作为副作用的体重降低效果。○表示盐酸氨柔比星单独给药组，△表示顺铂单独给药组，◆表示联合给药组。
附图3显示当将0.8倍最大耐受剂量的盐酸氨柔比星和0.8倍最大耐受剂量的顺铂联合使用时，对小细胞肺癌细胞生长的抑制效果。○表示盐酸氨柔比星单独给药组，△表示顺铂单独给药组，●表示联合给药组。
附图4显示当将0.8倍最大耐受剂量的盐酸氨柔比星和0.8倍最大耐受剂量的顺铂联合使用时，作为副作用的体重降低效果。○表示盐酸氨柔比星单独给药组，△表示顺铂单独给药组，●表示联合给药组。
附图5显示当将1.0倍最大耐受剂量的盐酸氨柔比星和1.0倍最大耐受剂量的顺铂联合使用时，对小细胞肺癌细胞生长的抑制效果。○表示盐酸氨柔比星单独给药组，△表示顺铂单独给药组，■表示联合给药组。
附图6显示当将1.0倍最大耐受剂量的盐酸氨柔比星和1.0倍最大耐受剂量的顺铂联合使用时，作为副作用的体重降低效果。○表示盐酸氨柔比星单独给药组，△表示顺铂单独给药组，■表示联合给药组。
实施本发明的最佳方式本发明治疗肺癌的药物是包含作为活性组分的氨柔比星或其可药用盐的治疗肺癌的药物，并与顺铂联合使用。
氨柔比星或其可药用盐可以例如按照J.Org.Chem.，52，4477-4485(1987)来制备。氨柔比星的可药用盐包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括例如无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、磷酸盐等等；有机酸盐例如柠檬酸盐、草酸盐、乙酸盐、甲酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、三氟乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、樟脑磺酸盐等等。碱加成盐包括例如无机碱加成盐如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐等等；有机碱加成盐例如三乙基铵盐、三乙醇铵盐、吡啶盐、二异丙基铵盐等等。优选的可药用盐包括盐酸盐等等。
顺铂(顺式-二氨二氯铂)可以例如按照Ann.，51，1(1845)制得。
氨柔比星或其可药用盐的最大耐受剂量是，以盐酸氨柔比星计，在一天一次的单一剂量中，对于小鼠是25mg/kg(75mg/m2)，对于人是130mg/m2，在连续3天的给药中每天为50mg/m2。顺铂的最大耐受剂量是，对于小鼠是10mg/kg(30mg/m2)，对于人是90mg/m2。
肺癌包括例如小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、类癌瘤、腺样囊癌、粘液表皮样癌、恶性混合肿瘤等等。在它们当中，其中本发明治疗肺癌药物表现出优选作用的实例包括小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌等，特别优选的是小细胞肺癌。
从用小鼠进行的实施例1中，发现了以下事实(1)在0.5倍最大耐受剂量(12.5mg/kg)的盐酸氨柔比星与0.5倍最大耐受剂量(5mg/kg)的顺铂的联合使用中，所观察到的抗癌效果与在将最大耐受剂量的各治疗剂独立给药的组中所观察到的抗癌效果相比，其水平是类似的。另一方面，顺铂的副作用被显著降低了。
(2)在0.8或1.0倍最大耐受剂量(20或25mg/kg)的盐酸氨柔比星与0.8或1.0倍最大耐受剂量(8或10mg/kg)的顺铂的联合使用中，所观察到的抗癌效果强于在将最大耐受剂量的各治疗剂独立给药的组中所观察到的抗癌效果。另一方面，顺铂的副作用没有降低但是在类似水平上。
如上所述，通过将约0.5-约1倍最大耐受剂量的盐酸氨柔比星与约0.5-约1倍最大耐受剂量的顺铂联合使用，可以安全且充分地获得抗癌作用而不增加顺铂和氨柔比星或其可药用盐的副作用，或者有时还降低它们的副作用。例如，当顺铂或氨柔比星的副作用成为问题时，可以使用在氨柔比星或其可药用盐的约0.5-约1倍最大耐受剂量与顺铂的约0.5-约1倍最大耐受剂量范围内的较低剂量；另一方面，当顺铂或氨柔比星的副作用不成为问题时，可以使用在氨柔比星或其可药用盐的约0.5-约1倍最大耐受剂量与顺铂的约0.5-约1倍最大耐受剂量范围内的较高剂量以安全地获得最高的抗癌作用。
在氨柔比星或其可药用盐与顺铂的联合使用中，顺铂的剂量可以在约0.5-约1倍最大耐受剂量的范围以内，具体来说，其可以是约0.5倍、约0.8倍、约1倍等等。例如，当将约0.5倍最大耐受剂量的顺铂给药时，氨柔比星或其可药用盐的剂量可以在其约0.5-约1.0倍最大耐受剂量的范围内，更优选地，可以是约0.8倍或约1倍。当将约0.8倍最大耐受剂量的顺铂给药时，氨柔比星或其可药用盐的剂量可以在其约0.5-约1.0倍最大耐受剂量的范围内，更优选地，可以是约0.8倍或约1倍。此外，可将顺铂以约1倍最大耐受剂量的量给药。
在人肺癌的治疗中，剂量可以根据患者的健康状况、年龄、体重等而适当变化，例如，可将约60-约135mg/m2的氨柔比星或其可药用盐与约35-约90mg/m2的顺铂联合使用。氨柔比星或其可药用盐可以例如以约60-约135mg/m2的量在单一剂量或2-5个分剂量中给药。优选的氨柔比星或其可药用盐的给药方案包括例如单一给药，每天给药一次，给药三天等等，并且包括最优选地每天给药一次、连续给药三天以上。单一给药的剂量包括例如约110-约130mg/m2的范围，并且包括最优选地约120mg/m2等。对于连续给药三天以上，每天的给药剂量包括例如约25-约50mg/m2的范围，优选约35-45mg/m2的范围等，并且最优选包括约40mg/m2、约45mg/m2等等。
联合给药的顺铂的给药剂量包括，例如，对于单一给药其范围为约35-约90mg/m2，对于单一给药优选为约50mg/m2-约80mg/m2。具体来说，其包括约60mg/m2、约80mg/m2等等，并且包括作为最优选实例的约60mg/m2等。另外，可将顺铂以数个分剂量每天或在数天给药。
在用顺铂进行治疗的肺癌患者中，当其已被判断为由于副作用而不能继续治疗时，可通过以具有降低的副作用的剂量施用顺铂和附加施用氨柔比星或其可药用盐来继续被降低了副作用的顺铂治疗。降低了副作用的顺铂剂量包括例如约35-约70mg/m2的范围，优选包括约35-约60mg/m2范围。
氨柔比星或其可药用盐与顺铂的联合给药量的实例包括下述那些
在本发明治疗肺癌的药物中，氨柔比星或其可药用盐与顺铂是同时、分隔或顺序给药。当其被分隔或顺序给药时，氨柔比星或其可药用盐可以在顺铂之前或之后给药。两个给药的间隔时间可以适当地设定，并且可以是例如1-数小时、10-数十小时、1-数天、1星期等等。例如，考虑到患者的方便如就诊等，优选将氨柔比星或其可药用盐与顺铂在同一天给药。
尽管本发明治疗肺癌的药物的给药根据患者的健康状况、年龄和体重、给药形式、联合给药的顺铂的给药量、给药频率等而适当变化，但是优选地，在施用上述氨柔比星或其可药用盐和顺铂以约7天-约60天的间隔进行给药，之后重复两种给药。最优选地，以约2星期-约4星期的间隔，进一步优选以约3周的间隔进行重复给药。
氨柔比星或其可药用盐通常可非胃肠道给药(例如静脉内、动脉内、皮下或肌肉内注射；膀胱内、腹膜内、胸膜内、局部、直肠、经皮、经鼻等等)。优选的途径包括静脉内注射。另外，口服给药也是可能的，并且口服给药形式包括片剂、胶囊、丸剂、粒剂、粉剂、溶液、糖浆剂、悬浮液等。
顺铂通常可非胃肠道给药(例如静脉内、动脉内、皮下或肌肉内注射；膀胱内、腹膜内、胸膜内、局部、直肠、经皮、经鼻等等)。优选的途径包括静脉内注射。另外，口服给药也是可能的，并且口服给药形式包括片剂、胶囊、丸剂、粒剂、粉剂、溶液、糖浆剂、悬浮液等。
在本发明治疗肺癌的药物中，可进一步组合其他抗癌药剂、放射治疗、手术措施等。此外，对于组合的治疗肺癌的药物，其可以是药盒的形式，其中包括(a)包含作为活性组分的氨柔比星或其可药用盐的第一个组合物和(b)包含作为活性组分的顺铂的第二个组合物。
实施例下面通过实施例来更详细地描述本发明，但本发明并不受该实施例的限制。
实施例1氨柔比星或其可药用盐与顺铂的组合的抗肿瘤活性将人小细胞肺癌LX-1细胞株皮下移植给5周大的小裸鼠(80只动物)。肿瘤移植15天后，将肿瘤体积为约200-500mm3的36只动物分为6个组，每组6只动物。在同一天，动物分别接受静脉内给药对于“对照组”施用生理盐水，对于“盐酸氨柔比星单独给药组”给药最大耐受剂量的盐酸氨柔比星(25mg/kg)，对于“顺铂单独给药组”给药最大耐受剂量的顺铂(10mg/kg)，对于“联合给药组(0.5×MTD)”施用0.5倍最大耐受剂量的盐酸氨柔比星和0.5倍最大耐受剂量的顺铂，对于“联合给药组(0.8×MTD)”施用0.8倍最大耐受剂量的盐酸氨柔比星和0.8倍最大耐受剂量的顺铂，对于“联合给药组(1×MTD)”施用最大耐受剂量的盐酸氨柔比星和最大耐受剂量的顺铂。此后，测定老鼠肿瘤的体积和老鼠体重，测定23天。
将盐酸氨柔比星溶解于半胱氨酸缓冲液(含有0.4mg/ml L-半胱氨酸盐酸盐一水合物和6.25mg/ml乳糖)中，以获得2.5mg/ml的溶液，将其用生理盐水稀释来获得2.0和1.25mg/ml的溶液。将分别是10ml/kg的等分试样的该溶液作为最大耐受剂量、0.8倍剂量或0.5倍剂量的盐酸氨柔比星给药。
通过给予购自Nippon Kayaku Co.，Ltd.的20、16或10ml/kg等分试样的Randa Injection(含有0.5mg/ml)将顺铂作为最大耐受剂量、0.8倍剂量或0.5倍剂量的顺铂给药。
附图1和2显示了联合给药组(0.5×MTD)的肿瘤体积和体重改变，以及盐酸氨柔比星单独给药组和顺铂单独给药组的数据。
附图3和4显示了联合给药组(0.8×MTD)的肿瘤体积和体重改变，以及盐酸氨柔比星单独给药组和顺铂单独给药组的数据。
附图5和6显示了联合给药组(1×MTD)的肿瘤体积和体重改变，以及盐酸氨柔比星单独给药组和顺铂单独给药组的数据。
表1显示了各组中的肿瘤生长速度的最小T/C％。该最小T/C％是如下计算的最小T/C％在测量期间各给药组的肿瘤生长速度*)与载体给药组的肿瘤生长速度*)的最小比值(％)。
*)肿瘤生长速度一组6只动物在各个测定时间点的肿瘤体积平均值与一组6只动物在各个给药时间点的肿瘤体积平均值的比值。
1.联合给药(0.5×MTD)组的结果如附图1所示，联合给药组的抗肿瘤效果与各个单一活性剂的最大耐受剂量给药组相比是类似的。因此，最小T/C％在盐酸氨柔比星单独给药组中是55％，在顺铂单独给药组中是68％，在联合给药(0.5×MTD)组是54％。
因为副作用是以动物体重的减少来评价的，如附图2所示，所以与各个单一治疗剂的单独给药组相比，观察到可能是由于顺铂剂量减半所引起的副作用显著降低。
2.组合联合给药(0.8×MTD)组的结果如附图3所示，肿瘤减小，并且与各个单一治疗剂的单独给药组相比，联合给药组的抗肿瘤效果更强。因此，最小T/C％在盐酸氨柔比星单独给药组是55％，在顺铂单独给药组中是68％，在联合给药(0.8×MTD)组中是40％。
如附图4所示，通过动物体重的减少来评价副作用，其程度与顺铂单独给药组类似。
3.组合联合给药(1×MTD)组的结果如附图5所示，与0.8倍给药中的情况一样，肿瘤减小了，并且与各个单一治疗剂的单独给药组比较，联合给药组的抗肿瘤效果更强。因此，最小T/C％在盐酸氨柔比星单独给药组中是55％，在顺铂单独给药组中是68％，在联合给药(0.8×MTD)组中是30％。
因为通过动物体重的减少来评价副作用，如附图6所示，体重暂时降低约3克但又恢复，并且其副作用与以顺铂作为单一治疗剂的最大耐药量给药组程度类似。
如上所述，在盐酸氨柔比星与顺铂联合给药组中，副作用减少并且观察到显著的治疗效果。另外，从附图1-6可知，在开始给药后的两周里，联合给药的效果特别显著，而在三周后几乎消失。因此，优选在约2周-约4周后重复给药，特别是，在3周后再次给药并在其后继续进行。
实施例2正常和肿瘤组织中羰基还原酶基因表达的变动分析用全RNA进行DNA碎片分析，其中全RNA是用取自人肺正常组织的69个样本、取自肺腺癌的44个样本、取自鳞状细胞肺癌的32个样本、取自大细胞肺癌的5个样本和取自白血病细胞的18个样本制备的。用得自Affymetrix的Gene Chip Human Genome U95 A、B、C、D和E进行DNA碎片分析。具体来说，该分析用这样的操作进行，包括(1)从全RNA制备cDNA，(2)从所述的cDNA制备标记的cRNA，(3)将标记的cRNA裂解，(4)用探针阵列将裂解的cRNA杂交，(5)将探针阵列染色，(6)扫描探针阵列和(7)分析基因表达。
(1)从全RNA制备cDNA将每一11μl混合溶液—其含有10μg每一用取自人肺正常组织的69个样本、取自肺腺癌的44个样本、取自鳞状细胞肺癌的32个样本、取自大细胞肺癌的5个样本和取自白血病细胞的18个样本制得的全RNA和100pmol T7-(dT)24引物(由Amer sham生产)-在70℃加热10分钟，然后在冰上冷却。冷却以后，加入4μl包含在用于cDNA合成的SuperScript Choice System(由Gibco-BRL生产)中的5×FirstStrand cDNA Buffer、2μl包含在所述试剂盒中的0.1M DTT(二硫苏糖醇)和1μl的10mM dNTP Mix，并将该混合物在42℃加热2分钟。然后，再加入2μl(400U)包含在所述试剂盒中的SuperScriptII RT。将该混合物在42℃加热1小时，然后在冰上冷却。冷却后，加入91μl DEPC处理水(由Nacalai Tesque，Inc.生产)、30μl包含在所述试剂盒中的5×Second Strand Reaction Buffer、3μl10mM dNTP Mix、1μl(10U)包含在所述试剂盒中的大肠杆菌DNA连接酶、4μl(40U)包含在所述试剂盒中的大肠杆菌DNA聚合酶I和1μl(2U)包含在所述试剂盒中的大肠杆菌RNAaseH，并在16℃反应2小时。在加入2μl(10U)包含在所述试剂盒中的T4 DNA聚合酶并在16℃反应5分钟后，加入10μl 0.5M EDTA。然后，加入162μl苯酚/氯仿/异戊醇溶液(由Nippongene生产)并混合。将该混合溶液转移到预先在室温下以14,000rpm的转速离心30秒钟的PhaseLock Gel Light(由Eppendorf生产)中，在室温下以14,000rpm的转速离心2分钟，然后将145μl水层转移到Eppendorf管中。向所获得的溶液中加入72.5μl 75M乙酸铵溶液和362.5μl乙醇，混合后，将该混合物在4C以14,000rpm的转速离心20分钟。离心后，弃去上清液，得到含有制备的cDNA的DNA离心团。然后，将0.5ml 80％乙醇加到所述离心团中，并将该混合物在4℃以14,000rpm的转速离心5分钟。弃去上清液。再次重复相同的处理后，将离心团干燥并溶解在12μl DEPC处理水中。
通过以上操作，就从由取自人肺的正常组织的69个样本、取自肺腺癌的44个样本、取自鳞状细胞肺癌的32个样本、取自大细胞肺癌的5个样本和取自白血病细胞的18个样本得到的全RNA中获得了cDNA。
(2)从所述cDNA中制备标记的cRNA将17μl DEPC处理水，4μl包含在BioArray High Yield RNATranscript Labeled Kit(由ENZO生产)中的10×HY ReactionBuffer、4μl包含在所述试剂盒中的10×Biotin LabelingRibonucleotides、4μl包含在所述试剂盒中的10×DTT、4μl包含在所述试剂盒中的10×Rnase Inhibitor Mix和2μl包含在所述试剂盒中的20×T7 RNA聚合酶混合到5μl在上面(1)中制备的每一cDNA溶液中，并在37℃反应5个小时。反应后，将60μl DEPC处理水加到该反应液中，并按照所附的说明书用Rneasy Mini Kit纯化所制得的标记的cRNA。
(3)裂解标记的cRNA将8μl 5×裂解缓冲液(200mM Tris-乙酸盐，pH8.1(由Sigma生产)，500mM乙酸钾(由Sigma生产)和150mM乙酸镁(由Sigma生产))加到含有20μg在上面(3)中纯化的每一标记的cRNA的溶液中。在将40μl所获得的反应溶液在94℃加热35分钟后，将该溶液置于冰中。这样便可以裂解标记的cRNA。
(4)用探针阵列杂交裂解的cRNA将4μl 5nM Control Oligo B2(由Amersham生产)、4μl 100×Control cRNA Cocktail，40μg的鲱精子DNA(由Promenga生产)、200μg的乙酰化BSA(由Gibco-BRL生产)、200μl 2×MES杂交缓冲液(200mM MES，2M[Na+]，40mM EDTA，0.02％吐温20(由Pierce生产)，pH6.5-6.7)和144μl DEPC处理水混合到40μl在上面(3)中获得的每一裂解的cRNAs中，以获得400μl杂交混合物。将每一所获得的杂交混合物在99℃加热5分钟，在45℃加热5分钟。加热后，将该混合物在室温以14,000rpm的转速离心5分钟以得到杂交混合物的上清液。
另一方面，将填充了1×MES杂交缓冲液的人类基因组U95探针阵列(由Affymetrix生产)在杂交烘箱中于45℃以60rpm的转速旋转10分钟，除去1×MES杂交缓冲液以获得探针阵列。将200μl的上面获得的杂交混合物的上清液加到探针阵列中，使该混合物在杂交烘箱中于45℃以60rpm的转速旋转16小时，就获得了与裂解的cRNA杂交的探针阵列。
(5)染色探针阵列从每一在上面(4)中获得的已经杂交的探针阵列中收集并除去杂交混合物后，用Non-Stringent Wash Buffer(6×SSPE(通过稀释20×SSPE来制得的(由Nacalai Tesque生产))，0.01％的吐温20和0.005％Antuform 0-30(由Sigma生产))填充该产物。然后，将裂解的cRNA和杂交的探针阵列置于具有Non-Stringent Wash Buffer和Stringent Wash Buffer(100mM MES，0.1M NaCl和0.01％吐温20)的GeneChip Fluidics Station 400(由Affymetrix生产)的各个位置上。然后，按照染色操作方案EuKGE-WS2，用第一种染色溶液(10μg/ml链霉抗生素蛋白藻红蛋白(SAPE)(由Molecular Probe生产)、2μg/ml乙酰化BSA、1M NaCl(由Ambion生产)、0.05％吐温20和0.005％Antifoam 0-30)和第二种染色溶液(100μg/mlGoat IgG(由Sigma生产)、3μg/ml生物素化链霉抗生素蛋白抗体(由Vector Laboratories生产)、2mg/ml乙酰化BSA、100mM MES、1MNaCl、0.05％吐温20和0.005％Antifoam 0-30)进行染色。
(6)扫描探针阵列和(7)分析基因表达将每一在上面(5)中染色的探针阵列用HP GeneArray Scanner(由Affymetrix生产)扫描以读取染色模式。
基于该染色模式，用GeneChip工作站系统(由Affymetrix生产)对探针阵列上的羰基还原酶1基因表达进行分析。然后，按照分析操作方案对基因表达进行标准化和比较分析。
结果发现，羰基还原酶1的表达频率为11％(18例中的2例)，而人的白血病细胞中的表达量中值是-39，这表明该基因很难表达。另一方面，发现在人组织中羰基还原酶1的表达频率为55％(44例中的24例)，而在腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌和正常组织中分别为63％(32例中的20例)、40％(5例中的2例)和32％(69例中的22例)，并且表达量分别为51、96、34和22，这表明与肺正常组织比较，在肺癌组织中羰基还原酶1的表达提高了，特别是，肺腺癌和鳞状细胞癌中的表达量是肺正常组织中的2倍和4倍。
工业实用性依据本发明，提供了可用于治疗肺癌患者的、将盐酸氨柔比星与顺铂联合使用来治疗肺癌的药物。通过与顺铂联合使用，盐酸氨柔比星的抗肿瘤治疗效果可得到提高，并且使降低顺铂副作用的癌症治疗成为可能。
权利要求
1.与顺铂联合使用以治疗肺癌的药物，其中包含做为活性组分的氨柔比星或其可药用盐。
2.如权利要求1所述的治疗肺癌的药物，其中所述肺癌是小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞肺癌或大细胞肺癌。
3.如权利要求1所述的治疗肺癌的药物，其中所述肺癌是小细胞肺癌。
4.如权利要求1-3任一项所述的治疗肺癌的药物，其中所述活性组分是盐酸氨柔比星。
5.如权利要求1-4任一项所述的治疗肺癌的药物，其中所述药物与顺铂同时、分隔或顺序给药。
6.如权利要求1-5任一项所述的治疗肺癌的药物，其中所述药物包含作为活性组分的氨柔比星或其可药用盐，并且是用于治疗已经施用了顺铂或计划施用顺铂的肺癌患者。
7.如权利要求1-6任一项所述的用于与顺铂联合使用以治疗肺癌的药物，其中所述药物被这样包装，使得约60-约135mg/m2的氨柔比星或其可药用盐在一个单一剂量或2-5个分剂量中给药。
8.如权利要求7所述的治疗肺癌的药物，其中所述药物被这样包装，使得约110-约130mg/m2的氨柔比星或其可药用盐在一个单一的剂量中给药。
9.如权利要求7所述的治疗肺癌的药物，其中所述药物被这样包装，使得约25-约50mg/m2的氨柔比星或其可药用盐一天给药一次、给药三天。
10.如权利要求7所述的治疗肺癌的药物，其中所述药物被这样包装，使得约35-约45mg/m2的氨柔比星或其可药用盐一天给药一次、给药三天。
11.如权利要求9或10中所述的治疗肺癌的药物，其中氨柔比星或其可药用盐是连续三天给药。
12.如权利要求7-11任一项所述的治疗肺癌的药物，其中将约35-约90mg/m2联合使用的顺铂在一个单一的剂量中给药。
13.如权利要求7-11任一项所述的治疗肺癌的药物，其中将约50-约70mg/m2联合使用的顺铂在一个单一的剂量中给药。
14.如权利要求1-13任一项所述的治疗肺癌的药物，所述药物包含作为活性组分的氨柔比星或其可药用盐，并且是用于肺癌患者，其中所述患者由于副作用而不能继续接受顺铂治疗，以及其中所述患者正在以会引起降低的副作用的量接受顺铂给药。
15.氨柔比星或其可药用盐在制备用于与顺铂联合使用以治疗肺癌的药物中的应用。
16.治疗肺癌的方法，包括施用氨柔比星或其可药用盐和顺铂。
全文摘要
本发明涉及通过联合使用氨柔比星或其可药用盐与顺铂来有效地治疗肺癌。
文档编号A61K45/06GK1489469SQ02804347
公开日2004年4月14日 申请日期2002年1月29日 优先权日2001年1月30日
发明者野口俊弘, 马场朱美, 美 申请人:住友制药株式会社