鞋式导管在体局部导入基因的方法

专利名称：鞋式导管在体局部导入基因的方法
技术领域：
本发明属于医学分子生物学技术，涉及一种基因导入的方法，特别涉及一种鞋式导管在体局部导入基因的方法。
背景技术：
如何将目的基因药物定位导入活体动物心血管等靶点部位，从而达到抑制某些基因的表达，这是使用基因药物防治心血管疾病的关键步骤。虽然目前逆转录病毒、腺病毒、病毒脂质体等基因转移方法，在动物实验中取得可喜的效果[1，2，3]，但由于存在许多不可预料的毒副作用[1]，用于在体导入基因受到很大限制，很难用于临床，直接外膜在体导入基因药物，虽然动物实验可行[4]，但很难用于临床。用球囊导管向血管局部直接导入目的基因是一种定向、直接、简易、毒副作用小，且更为实用的方法，但目前这方面的研究鲜见报导，有待进一步研究[1]。鞋式导管是最近研究生产的一种局部给药导管，已开始用于临床局部给药，该导管的特点是有两个不同的压力通道，可分别进行血管成形和给药，经外鞘可送入任何型号的标准血管成形导管，球囊扩张和给药可一次完成。该导管是否可成为局部导入基因药物的工具目前仍未见报导。如何用此导管导入基因？方法如何？能否达到抑制体内基因的表达等，尚不清楚。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是鞋式导管在体局部导入基因的方法，至少包括以下步骤第一步采用鞋式导管，先经鞘管内腔送入标准血管成形导管，在靶点血管处，球囊成形后，松球囊，然后将外鞘尖端给药区和PTCA球囊导管一起送至球囊血管成形处，再打起PTCA球囊导管(1.5atm)后，经三通联接管用压力泵经外鞘局部给药于损伤处血管壁；经血管局部导入同位素锝99测定血管局部浓度，评价局部给药的可行性；第二步经鞋式导管在体导入c-myc反义寡核苷酸1)寡核苷酸的合成核苷酸序列选自人的c-myc基因第二外显子中(从4521到4536)的15个核苷酸；c-myc正义核苷酸5’ATGCCCCTCAACGTTc-myc反义核苷酸3’TACGGGGAGTTGCAA用硫代磷酸盐修饰核苷酸，PAGE纯度(摩尔比)99％；2)用苯巴比妥耳缘静脉麻醉(30mg/kg)，常规消毒后，先分离、暴露活体物的右股动脉，作一小切口后，经股动脉放入带有标准血管成形导管(球囊直径3.0mm)的鞋式导管，将导管送至腹主动脉中、下端时，通过压力泵使标准血管成形导管的球囊充盈(6atm)后，强行将其缓慢回撤至切口处，如此反复进行3次；每次30-60秒，造成血管壁内膜损伤，然后松球囊，使之退入鞋式导管鞘内，连同鞋式导管的尖端一并送至髂动脉处，打起球囊(1.5ml)，经鞘管尖端导入c-myc反义寡核苷酸426umol/L(0.5ml)后，经三通开关给生理盐水1.5ml，给药时间＜30秒，所用压力为5atm，给药后局部做标记，从切口处结扎股动脉，外科缝合，关闭切口；3)经鞋式导管局部导入基因药物c-myc反义寡核苷酸观察在体表达效应评价是否能导入基因药物，导入基因药物是否在体表达。
本发明的鞋式导管定向在体局部导入基因药物的方法，其定位准确、直接导向心血管靶点、简易、无毒副作用，且可用于临床，该鞋式导管局部导入靶点的药物浓度，在一定范围内呈压力依赖性，且药物可在局部高浓度持续存在至少24小时，在体局部导入的基因药物可抑制体内某些基因的表达，达到防治心血管疾病的作用。采用鞋式导管向损伤的髂动脉壁内定和导入的c-myc反义寡核苷酸可抑制动脉血管壁损伤后c-myc原癌基因的超常表达，抑制血管平滑肌细胞增生和血管狭窄。该鞋式导管定向在体局部导入基因药物的方法，将基因治疗疾病从动物实验走向临床应用的重要手段。


图10是为HE染色显微镜下的图片；其中A.正常兔髂动脉内膜由内皮细胞和内弹力板构成，内无增生；B.球囊损伤后内膜增生的髂动脉，内皮剥脱、VSMC和细胞外基质增生，共同构成新生内膜(NI)；C.球囊损伤后导入c-myc反义寡核苷酸的髂动脉，可见内膜增厚程度明显低于未给药段血管(图B)；图11是兔髂动脉球囊损伤后40天，Vethoeff弹力纤维染色显微镜下的图片；其中A为损伤未给药的对照段血管，B为导入c-myc反义寡核苷酸的动脉血管段；二者比较管腔面积(见图A1、B1)内膜增生厚度(见图A2与B2)均有显著差异，图的放大倍数为4倍(图A1、B1)和8倍(图A2、B2)。
图12是球囊损伤兔髂动脉后1周，c-myc蛋白免疫组化染色强阳性图片；阳性颗粒定位于VSMC细胞核内。
图13是术后2周，球囊损伤兔髂动脉段血管c-myc蛋白免疫组化染色阳性图片；其中(a)阳性图片，而给药段血管呈阴性(b)，放大倍数为40倍。
图14是球囊损伤兔髂动脉后40天的显微镜下的图片；其中图A为c-myc蛋白免疫组化染色阳性，图B为而经鞋式导管导入c-myc反义寡核苷酸的动脉血管段呈阴性，放大倍数为40倍。
图15是兔正常髂动脉和球囊损伤兔髂动脉3天电镜观察结果图；其中A.是兔正常髂动脉显示，VSMC内充满大量成束肌丝，只在核周围有少量粗面内质网，游离核体及线粒体致密体和致密斑清晰可见，此为典型的收缩型VSMC；图B、C、D为球囊损伤兔髂动脉3天观察结果，图C所示中层VSMC穿越内弹力膜小窗，向内膜迁移；图B显示收缩型VSMC向分泌型，VSMC过渡，胞浆中仍可见少量肌丝和密体，但已可见大量游离核糖体和粗面内质网；图D显示的未见致密斑及密体，但高尔基体十分发达，粗面内质网、游离核糖体及线粒体非常丰富，呈典型状的分泌型VSMC。
图16是6atm组TMII在不同组织中的分布及随时间的变化图(占1ml TMII给药量的百分比值)；图17是两组靶点/血液放射性计数比值的比较图；图18是两组靶点/远端血管放射性计数比值的比较图；图19是两组靶点血管/1ml TMII放射性计数比值的比较图；图20是球囊损伤2周后增生内膜面积比较图；图21是球囊损伤2周内膜平均厚度比较图；图22是球囊损伤2周后内膜/中膜面积比较图；图23是球囊损伤2周最大内膜厚度比较图；图24是球囊损伤40天内膜面积比较图；图25是球囊损伤40天内膜/中膜面积比较图；
图26是球囊损伤40天最大内膜厚度比较图；图27是球囊损伤40天平均内膜厚度比较图；图28是球囊损伤后内膜平均厚度的变化图；图29是球囊损伤后内膜/中膜面积的变化图；图30是6atm组TMII在不同组织中的分布图。
取材和测量术后30min处死9只动物、6h处死两只、24h处死两只。分别取靶点血管(腹主动脉下端)、心、肝、肺、骨髂肌、小肠、血液、非靶点血管(腹主动脉下端)、心、肝、肺、骨骼肌、小肠、血液、非靶点血管(肺动脉)组织，分别将其用生理盐水冲洗并称其重量，并用γ计数仪计数，同时对体外1ml TMII用γ计数仪计数。
经鞋式导管在体导入c-myc反义寡核苷酸。
1)寡核苷酸的合成核苷酸序列选自人的c-myc基因第二外显子中(从4521到4536)的15个核苷酸。由上海生工生物工程有限公司——加拿大SANGON上海分公司合成。
c-myc正义核苷酸5’ATGCCCCTCAACGTTc-myc反义核苷酸3’TACGGGGAGTTGCAA用硫代磷酸盐修饰核苷酸，PAGE纯度(摩尔比)99％。
2)动物模型的建立和经鞋式导管在体导入c-myc反义寡核苷酸取21只家兔，体重2.5kg-3.5kg，雌雄各半，对照组6只，反义寡核苷酸组15只。再按观察时间不同分为3天、7天、14天和40天5个观察组，其中40天给药组和对照组各为6只兔子，其它三组均为3只。再狭窄模型的建立参考Schwartz和Takanobu的方法，即用苯巴比妥耳缘静脉麻醉(30mg/kg)，常规消毒后，先分离、暴露兔子的右股动脉，作一小切口后，经股动脉放入带有标准血管成形导管(球囊直径3.0mm)的鞋式导管，将导管送至腹主动脉中、下端时，通过压力泵使标准血管成形导管的球囊充盈(6atm)后，强行将其缓慢回撤至切口处，如此反复进行3次。每次30-60秒，造成血管壁内膜损伤[34、35]，然后松球囊，使之退入鞋式导管鞘内，连同鞋式导管的尖端一并送至髂动脉处，打起球囊(1.5ml)，经鞘管尖端导入c-myc反义寡核苷酸426umol/L(0.5ml)后，经三通开关给生理盐水1.5ml，给药时间＜30秒，所用压力为5atm，对照组给生理盐水。给药后局部做标记，从切口处结扎股动脉，外科缝合，关闭切口。术中静脉滴注生理盐水250ml，术中青霉素80万单位静脉注射，术后青霉素80万单位静脉注射，一天一次，共三天。在指定的时间处死动物。5.2.评价鞋式导管导入c-myc反义寡核苷酸的方法
1)髂动脉血管造影用美国通用电气公司生产的advantx数字减影机(DSA)和日本岛津公司生产的HD150B700mA血管造影机行血管造影，在指定处死动物的时间对术后14天组和术后40天组动物行髂动脉血造影。切开腹腔，经腹主动脉上端插入5F鞘管，X线下注射76％的泛影普胺，同时录相，并拍照。
2)电镜分析对3天组动物行电镜分析。固定兔子，切开腹腔后立即分离髂动脉，0.1IMPBS冲洗后，迅速用剃须刀片将损伤段血管壁切开，切成1mm3大小。25％戊二醛固定液(2ml)4℃固定，0.1M磷酸缓冲液浸洗30秒，1％四氧化锇固定，0.1M磷酸缓冲液浸洗，然后用30％、50％、70％、90％、100％乙醇系列脱水，环氧丙烷置换，Epon812包埋(环氧树脂)。瑞典的LKBV型超薄切片机切片，切片厚度50nm～70nm。铅、铀染色，日本产H-600透射电子显微镜观察，拍照。
3)光镜分析切开腹腔，分离出腹主动脉，先将5F鞘管插入兔子腹主动脉上端，经此鞘管注入4％多聚甲醛液行活体灌注60分钟，拍照后取材双侧髂动脉的给药段和非给药段血管，及相对应的正常段血管。组织块浸泡于4％多聚甲醛中，浸泡固定24小时以上，逐级酒精脱水，二甲苯透明，56℃浸蜡两次，石蜡包埋，5um厚连续切片，脱蜡，水化后，分别行苏木素伊红(HE)常规染色及Verhoeff氏弹力纤维特殊染色。
HE染色步聚将固定切片浸入苏木精液10分钟→梯度酒精脱水→二甲苯透明→中性树胶封片。
Verhoeff法切片脱蜡，从酒精至水。Verhoeff染液(苏木素1g，无水酒精20mg，10％氧化铁水溶液8ml)内分化10min-20min，然后在2％氧化铁溶液内液化，经水洗、95％酒精内冲洗、再水洗，后在0.5％伊红5min后，进行脱水、透明、封固。
在光镜下观察并拍照。用CMIAS真彩色医学图像分析仪，以内弹力膜为界测量内膜面积、最大内膜增生厚度，平均内膜增生厚度(从多个方位取15-16个点进行测量)，以内、外弹力膜为界测量血管中层面积。
4)c-myc蛋白免疫组织化学染色①载玻片选择APES(丙酮稀释)，防止脱片。捞片后置烤箱58℃-60℃，30min，以使切片紧密粘附。
②切片脱蜡水化。
③蒸馏水新鲜配置3％H2O2，室温10min，以灭活内源性酶。蒸馏水洗2min×3次。
④微波修复抗原将切片浸入0.01M，PH6.0柠檬酸盐缓冲液中，微波炉加热至96℃-100℃，持续20min-30min。冷却后进行下一步。
⑤滴加1∶50正常血清封闭液，室温20min。甩去多余液体。
⑥滴加鼠源性c-myc单克隆抗体(1∶50C)，4℃过夜。0.1M PBS洗2min×3次。
⑦滴加1∶100 PBS稀释生物素化山羊抗小鼠IgG，温度20℃-37℃，30min。0.014M PBS洗2min×3次。
⑧临用前配置SABC工作液取1mlPBS分别加入试剂A和试剂B各式各10ul。滴加试剂SABC，20℃-37℃，30min。0.01M PBS洗5min×4次。
⑨DAB显色使用DAB显色试剂盒(ED1022)。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间。蒸馏水洗涤。
⑩脱水，透明，封片。显微镜观察，并拍照。5.3.统计学分析数据表达用X±SD，配对t检验，P≤0.05为显著性水平。
结果1)鞋式导管局部导入同位素锝99标记的甲氧异腈注射液的结果(见表1和表2)表1 6atm组同位素锝99标记的甲氧异腈注射液在不同组织中的分布及随时间的变化(占1ml同位素锝99标记的甲氧异腈注射液给药量的百分比值％/g)组织器官 30min 6h24h靶点血管 49.25±19 0.343±0.05 0.255±0.16非靶点血管0.75±0.4 0.02±0.009 0.02±0.02心脏 8.03±7 0.1±0.01 0.055±0.06肝脏 17.61±7.90.024±0.0010.039±0.04小肠0.027±0.0010.009骨胳肌 0.008±00.012血液 2.123 0.008±0.0010.008±0.008表1显示鞋式导管局部给药后，靶点血管放射强度最大，靶点血管在给药后30min局部放射强度占所给同位素锝[99MTC]甲氧异腈注射液放射强度的49％/g，6h后为0.343％/g，24h后为0.255％/g。药物在局部持续存在至少24h。
表2 二种给药压力的比较(给同位素锝99标记的甲氧异腈注射液后30min放射性计数比值)分组靶点血管/1ml 同 靶点血管/血 靶点血管/非靶点血位素锝[99MTC]甲 液管氧异腈注射液6atm组 0.49±0.1945±2370±232atm组 0.22±0.038±5 12±5P值 ＜0.05＜0.05＜0.05此结果显示给药压力提高，局部放射强度增加。6atm组和2atm组比较有显著差异(P＜0.05)。同时显示靶点血管的放射性强度是血液的8～45(2atm组和6atm组)倍，是非靶点血管的12～70(2atm组和6atm组)倍。
2)经鞋式导管向兔髂动脉局部导入c-myc反义寡核苷酸ASODN的观察结果(1)大体形态观察结果损伤3天和一周的动脉血管可见管腔内有血栓形成，二组比较无差异。
术后二周和40天的髂动脉损伤段血管壁变粗，血管外经增粗(图2～4)，与正常对照血管比较，髂动脉内腔面粗糙不平，整个血管腔面可见弥漫性隆起于内膜表面的斑块。
损伤给药段血管40天组血管外径无明显增粗(与正常对照血管比较)(图2)，管径无缩小，但部分动脉内腔面粗糙不平。相比之下，术后40天对照组髂动脉增粗(图3)，动脉管腔更为粗糙不平。
(2)血管造影结果术后二周动脉造影显示损伤段髂动脉有10％～30％的局限管腔狭窄，而给药段髂动脉无管腔狭窄(图5示)。
术后40天动脉造影显示损伤组动脉管壁不光滑，有50％-80％局限狭窄(图6、8b、9b)，而给药组仅有10％-30％局限狭窄(图7、8a、9a)。
(3)光镜观察结果术后3天可见损伤动脉壁内有红色血栓，术后一周动脉内膜中有炎细胞浸润，内弹力板不完整，中层VSMCs核排列紊乱，管腔面内皮细胞缺失或减少。术后2周起内膜呈弥漫性增厚，VSMCs穿过内弹力板和细胞外基质形成新的新生内膜。增厚的新生内膜以细胞成分为主，同时可见大量细胞外基质(图10)。病灶深支的VSMCs大多数地梭形，浅层者多为短梭形，或圆形。术后40天新生内膜仍有增厚趋势(图11)，但细胞减少，细胞外基质显著增多，有不连续的内皮细胞(图11)。
三天组和一周组给药段髂动脉血管与损伤未给药段髂动脉光镜观察相似，但术后二周和40天时，二组比较内膜增生面积、最大内膜增生厚度、平均内膜增生厚度、内膜/中层面积比值均有显著差异(P≤0.05)，如表3、表4、图20～29所示。
表3 血管成形术后二周血管内膜厚度、面积的比较分组内膜增生面 最大内膜厚 平均内膜厚 内/中层面积 度(μm) 度(μm) 积比值(1×105μm2)损伤给药段 1.09±0.99 105±22 57±80.17±0.1血管(n＝3)损伤对照段 3.72±1.3194±42 118±22.50.61±0.02血管(n＝3)P值0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05表4 管成形术后40天血管内膜厚度，面积的比较分组内膜增生面 最大内膜厚平均内膜厚内/中层面积(×105μ 度(μm) 度(μm) 积比值m2)损伤给药段 4.04±1.02 211±43 122±14.9 0.53±0.18血管(n＝6)损伤对照段 7.66±3.7 344±96 221.5 ±1.4±0.7血管(n＝6)68.95P值 ＜0.05 ＜0.05＜0.05＜0.05(4)电镜观察结果(见图15A、B、C、D)正常对照血管如图15A所示，中层VSMCs易识别，分布于内弹力板下，细胞呈长梭形，VSMCs细胞内充满大量成束肌丝，其走向大致与细胞的长轴一致，只在核周有少量粗面内质网、游离核糖体及线粒体。致密体和致密斑清晰可见。上述特点符合典型的收缩型VSMCs。
损伤和给药后三天的血管如图15B、C、D所不。中层VSMCs清晰，细胞呈椭圆形、扁、宽，肌丝、致密斑及致密体不的检出，但高尔基体下分发达，粗面内质网、游离核糖体及线粒体非常丰富，充满胞质，此特点符合典型合成型VSMCs。另外尚可见介于收缩型VSMCs和合成型VSMCs之间的过渡型。此外还可见中层的VSMCs，穿越内弹力膜小窗，向内膜迁移。
(5)免疫组化结果兔髂动脉损伤后一周、二周和40天时，c-myc蛋白免疫组织化学染色阳性，染色阳性颗粒定位于VSMCs细胞核内，而损伤给药段血管c-myc蛋白免疫组织化学染以显示阴性或弱阳性。
图12、13a示术后一周和两周髂动脉损伤段VSMCs c-myc蛋白免疫组织化学染色阳性。图13b示损伤给药段血管c-myc蛋白免疫组织化学染色阴性。
图14A示术后40天髂动脉损伤段血管内膜增生明显，且c-myc蛋白免疫组化染色阳性。
图14B示术后40天，导入c-myc ASODN段血管虽内膜也有增生，但不如图14A明显，且c-myc蛋白免疫组化染色为阴性。5.4讨论本发明的实验结果证实(1)通过昆鞋式导管向兔髂动脉局部入同位素锝标记物TMII，证实鞋式导管可向局部靶点管释放足量药物，而很少外流，并且药物可在局部高浓度滞留至少24小时。提示该导管作为在体局部靶向给药工具的可行性；(2)经鞋式导管向兔损伤的髂动脉局部入c-myc ASODN，抑制VSMCs增生和c-myc蛋白表达，证实鞋式导管可作为局部靶向基因药物给药的工具。
1)、鞋式导管局部给药的可行性PTCA术后再狭窄的发生机制目前认为主要是新生内膜增生和在此基础上发生的血管重塑。新生内膜生主要是CAMCs的转型(由收缩型向分泌型转化)、增生、迁移及细胞外基质的聚积。血管处重塑是在新生内膜增生的基础上，壁腔比例和几何形状的改变。它包括血管的缩窄和代偿性血管增粗病变。在冠状动脉损伤处植入支架虽可减少血管重塑的发生，但仍有内膜增生反应，可发生20％的再狭窄[38-42]。因此近几年来人们把VSMCs增生作为靶点进行广泛深入研究，药物治疗包括传统抑制剂和最近的基因治疗已显示全身给药后在动物模型上可有效地预防再狭窄发生，但是这些药物进入临床试验时均告失败。这其中的一个最重要原因就是临床用药剂量偏上，在动物模型的成功治疗中，大多数药物剂量只有在远远超出病人的安全范围时才有效[26]。在这个观察基础上，人们提出了局部给药的概念[26]，即通过限制治疗药物于损伤靶点，局部高浓度，减少全身毒性。一些动物研究已证实[26]了这种假设，但是将其用于临床仍有许多障碍，这包括(1)给药载体能使药物在局部滞留一段时间，以确保疗效；(2)给药载体能释放足量的药物于血管壁靶点而不损伤管壁和很少外流；(3)能将基因药物转染于血管壁细胞内。
本发明采用鞋式导管在体导入同位素锝标记物TMII的结果显示经该导管导入局部靶点血管的TMII放射性强度在给药后30分钟是非靶点血管的12～70倍(2atm组和6atm组)，是血液的8～45倍(2atm组和6atm组)。给药后30minTMII局部放射性强度占1ml给药总量的49％/g，6h后为0.343％/g，24h后为0.255％/g。这证明(1)鞋式导管作为给药载体能向局部靶点血管释放足量药物，而很少外流；(2)鞋式导管可使药物在靶点血管局部高浓度滞留至少24h，这提示鞋式导管可以作为局部给药装置。
2)、鞋式导管作为基因药物运载体系的可行性有人预言，21世纪的基因治疗将像20世纪的疫苗和抗生素一样广泛应用。基因药物防治再狭窄目前正受到世界各国的广泛重视。目前基因治疗面临的困难一是治疗性目的基因的选择，二是基因转移的途径。将外源性目的基因准确、高效地转导至病变部位是目前国内外研究的热点之一。选择适宜的基因运载体系是基因治疗成功的关键。目前虽然逆转录病毒、腺病毒、脂质体等基因转移方法在动物实验中获成功，且转染率高，但缺乏组织特异性和靶向性，且由于导入病毒，可能会有许多不可预料的毒副作用，故很难用于临床。理想的基因运载系统必须是高效、安全、稳定、特异、可控、价廉且简单易行。这样既保证靶点部位的高效转导，又避免了全身应用的毒副作用。但是迄今为止，尚未见理想的局部血管特异性基因转导系统。本发明采用鞋式导管在体导入基因药物c-myc反义寡核苷酸于损伤的兔髂动脉血管壁，一次给药使2-4周后的VSMCs增生受到抑制，本实验的体外研究已证实VSMCs可通过胞饮方式主动将c-myc ASODN摄入胞浆，最后进入细胞核起作用(见1998年申请人的研究生戴强论文)；本实验中的免疫组化结果表明给药段血管c-myc蛋白表达受抑制，这些均证明该导管的局部靶向性和c-myc反义寡核苷酸通过干扰c-myc基因的表达而抑制VSMCs增殖。提示鞋式导管可以作为基因药物的运载工具，用以局部靶向给。本发明的结果与Shi等用其它类型局部给药导管在体导入c-myc反义寡核苷酸于猪的损伤冠状动脉结果类似，进一步从分子生物学角度论证了基因药物的局部入。
目前局部给药的球囊导管有多种类型，它们虽然各有其特点，但均存在许多明显的不足之处，如用双球囊导管给药时，需膨胀球囊15min-30min。这就导致了远端血管缺血及药物进入分支的丢失。带孔球囊虽然克服了上述缺点，但在球囊膨胀和去膨胀时易发生溶质的全身扩散和小孔阻塞后的非均质性溶质释放及血管损伤。水凝胶导管虽对动脉损伤不严重，但水凝胶只能吸收少量药物，基因转染能力有限，加之血流冲刷以及为避免血管闭塞性缺血，只能短时间给药，故使其应用受限制。理想的局部给药装置应该是操作简单，可使药物在血管壁内最大量的沉积而很少引起局部创伤和远端组织缺血及药物向全身扩散。从理论上讲，鞋式导管的突出特点是血管成形和局部给药可一次完成，操作简单、给药时间短暂(＜30s)，且可使药物在管壁最大量的沉积，故可能是一个有前途的局部导入基因药物的运载体系。值得注意的是目前许多局部给药装置还在不断发展、完善，究竟那种局部给药导管导入基因药物最大为理想，尚有待对大量的局部给药装置和载体间进行仔细地利弊比较。
3)、原癌基因c-myc在血管再狭窄发生中的作用原癌基因c-myc是一个细胞核内的增殖信号作用下，如球囊机械损伤刺激及损伤后各种细胞因子和生长因子的刺激，c-myc原癌基因表达明显增加，并且这种表达增加与VSMCs的增生相一致。Bennett等的研究推测鼠VSMCs短时表达人c-myc蛋白时，S期的VSMCs比正常时多，因此假定任何能引起c-myc蛋白增加的因子均可促进CSMCs增生。c-myc蛋白与已知的转录调节因子有很大程度的同源性，在功能上，c-myc蛋白的螺旋结构和亮氨酸链区域与蛋白-蛋白的相互作用有关。因此有人提出c-myc起一个直接转录激活剂的作用，刺激DNA复制及调节转录水平以后的基因表达。
因为反义寡核苷酸抑制特异基因的表达，这就提供了一个验证c-myc原癌基因对在体动脉VSMCs增生作用的一个机会。本发明的结果表明c-myc反义寡核苷酸在体内环境下可抑制c-myc原癌基困的蛋白表达，同时抑制动脉VSMCs增生，而对照组无此作用。此结果果与本实验室的体外实验结果(见申请人1998年的研究生戴强论文)和Shi等的体内研究结果相一致。证明了c-myc原癌基因表达增加和动脉VSMCs增生之间的因果关系。
众所周知，神经递质/激素-受体信号通过细胞内第二信使系统可以直接引起一些基因的转录，也可以迅速激活某些调节基因，并表达出调节蛋白质，再通过这些位于细胞核内的调节蛋白质选择性地结合有关DNA(次级靶基因)，引起后者的表达，从而较长时间地产生生物学效应。C-myc等原癌基因可能就属于这类调节基因，有人将其称为早-早期基因或快速反应基因。它们在球囊机械刺激或生长因子、激素等外界刺激传入的数分钟内即可作出反应，进行表达，因此在信息传递中起重要作用，也可称为核内第三信使。故推测c-myc的激活、过度表达可能是各种因子刺激增生的一个共同通路。而本实验结果间接支持这一假设。
4)、反义寡核苷酸的作用机制本发明的显示靶向c-myc基因第二外显子序列中的c-myc反义寡核苷酸可显著减少动脉VSMCs中的c-myc蛋白水平，这与其显著的生长抑制作用相平行。虽然本发明的实验未证实c-myc mRNA水平在给药后降低，但本发明的实验室的体外实验(见1998年申请人的研究生戴强论文)已从mRNA水平显示错配和正义c-myc寡核苷酸不抑制c-myc的表达，只有c-myc反义寡核苷酸可抑制c-myc原癌基因的转录，这证实了反义寡核苷酸的序列特异效应。这与Schmidt等的研究结果相一致。虽然现在对其序列特异效应的精确机制尚不完全清楚，但目前认为反义寡核苷酸在细胞内减少靶点mRNA和蛋水平的机制有两个第一，寡核苷酸干挠mRNA与核糖体的结合和翻译以及剪接。已发现针对mRNA5’帽的反义核苷酸在抑制兔β血红蛋白合成方面非常有效，而5’帽恰好是许多起始因子与核糖体结合，解链DNA，沿着mRNA核糖体移位的位点。第二，有人提出反义寡核苷酸的许多作用是通过诱导核糖核酸酶H分解mRNA所致。另外，反义寡核苷酸也能够进入细胞核，在核内它们能抑制剪接，防止mRNA前体或mRNA形成或阻滞mRNA向核外转移。因此反义寡核苷酸通过介导核糖核酸酶，导致特异的mRNA和蛋白质水平下降或通过分子空间阻碍、干挠特异蛋白合成。
5)、c-myc反义寡核苷酸可用于防治血管再狭窄反义技术战略靶向VSMCs增生防治再狭窄。细胞增生涉及有丝分裂原与受体的复杂相互作用、细胞内信号传递转换途径和特定基因表达的变化。有丝分裂原可作用于多个细胞内信号传递转换径路，这些径路又有分支，互相连接，互相依赖。这种过多的信号传递径路就使得想通过阻滞单一受体或信号传递经路来完成抑制细胞增生成为泡影。而相反许多受体、信号放大、与增生相关的基因表达，是必然的最后共同通路。通过这一共同通路所有的信号传递转换径路集中于一点。在细胞周期中许多基因产物被新合成，并被证实对促进细胞周期至关重要。这些基因产物包括涉及DNA和核苷酸的合成酶(如胸腺嘧啶核苷激酶和DNA多聚酶)、DNA结合的蛋白质和转录因子(如c-myc，c-fos，c-jun，c-myb)和细胞周期调节因子(如cdc-2，cdk-2和周期素cyclins)。从理论上讲，这些基因产物均可成为抑制VSMCs增生的最有效的靶点。第二当成为靶点的mRNA不多时，反义核苷酸是非常有效的，NDA复制所需的许多mRNA浓度很低，因此可成为很好的靶点。最后，复制可能是血管成形术后一个早期、短暂的事件。这个观点是以如下两点为基础而提出，即晚期取材的人动脉硬化标本中罕见复制以及对损伤动物模型使用反义核苷酸和传统药物阻滞早期DNA复制对抑制内膜增生可见显著的远期疗效，所有这些因素使增生比其它的再狭窄成因更易成为治疗靶点。
本发明的实验结果显示靶向原癌基因c-myc的反义寡核苷酸向动脉血管壁一次给药，可在2周和40天后显著抑制VSMCs的增生及管腔狭窄，这不仅提示抑制早期增生是由于反义寡核苷酸的效应所引起，也提示细胞或早期复制或完全不复制。这就为从分子水平上防治VSMCs增生和血管再狭窄提供了一种新的治疗手段。该治疗途径的优点如下(1)特定靶向能力。选择性抑制增生细胞，抑制靶点VSMCs的特定基因产物。核酸间碱基序列杂交是非常特异的；只有互补的碱基才能够结合。这种特异碱基配对就意味着碱基的反义核苷酸序列只靶向单一的mRNA，而不影响其它基因的mRNA。在Sa鞋式on等的研究中，导向Ha-ras基因点突变的寡核苷酸能选择性抑制突变基因的表达而不抑制正常基因。这种结合的特异性远远大地传统药物抑制剂，药物抑制剂常因蛋白不同而亲和力不同。(2)反义寡核苷酸比任何传统药物更容易设计和合成。寡核苷酸的结构相对简单，仅由4个碱基对的聚合物构成。因为已知靶(基因)序列，理论上针对靶点而设计的基因药物就十分明确了，而不需要象通常的药物制剂检测其上千种产物，同时反义核苷酸药物有持续改变靶组织的潜力。在靶组织中反义寡核酸RNA的结构表达可通过插入DNA于宿主染色体实现。这在实际应用中，用寡核苷酸通常是作不到的，而只有足够长度的反义寡核苷酸才可行。(3)如果能恰当给药，多聚寡核苷酸碱基药效可高度局限化，核苷酸可被摄入细胞，而成为细胞内的部分。任何仍在细胞外或进入异位细胞的多聚寡核苷酸均可被血清核酸酶迅速分解。这种机制有助于限制反义寡核苷酸于局部释放，导入靶点，而靶向定位给药防治再狭窄是非常重要的策略。
但是在体内生物学环境中，寡核苷酸的不稳定性和细胞的缓慢摄取对其在心血管系统中的应用性提出质疑，因为反义寡核苷酸必须在细胞内达到一定浓度才能发挥其治疗效应。本实验所用反义寡核苷酸为硫代磷酸盐修饰的核苷酸，其对血清或细胞内存在的脱氧核苷酸酶的降解有较强的抵抗力。相反，未修辞的c-myc反义寡核苷酸尽管浓度很高，但仍不能在体内抑制VSMCs生长，可能就是由于它们的不稳定性。已有资料提示寡核苷酸是通过受体介导的吞噬作用主动转运通过细胞膜的。因为细胞摄取在不同的细胞间差异很大，确定寡核苷酸转运入动脉VSMCs内是非常重要的。本发明的用鞋式导管导入动脉壁的同位素锝标记物TMII，可在动脉壁内持续存在24h以上，且局部靶点血管放射性强度是非靶点血管的70倍(6atm组)，24h后仍持续存在。TMII的分子量是6002，与15-30个碱基组成的反义寡核苷酸分子量6750(4500-9000)接近，这提示可能鞋式导管入的c-myc反义寡核苷酸在动脉壁内至少高浓度存在24h，有资料显示未降解的寡核苷酸暴露于人VSMCs后一小时，便可快速畜积于VSMCs内。
6)、再狭窄的动物模型尽管再狭窄的研究进展很多，但其机制依然有争论，原因之一是尚无满意的动物模型模拟人类再狭窄的病理过程。目前常用高胆固醇饲养的兔做再狭窄模型，此模型的血清胆固醇较正常水平升高十几倍，导致大量胆固醇沉积，且内膜含量有大量吞噬细胞(＞50％)，与人类血管成形术后再狭窄病理变化相差很多。本发明的实验选用的再狭窄模型，具有以下特点①血管成形术后内膜增生的病理形态与人在球囊血管成形术后再狭窄的病理过程相似，包括平滑肌细胞增殖、向内膜下迁移和细胞外基质(胶原、弹力纤维)增生；②血管成形术后见内膜撕裂、血小板聚积、夹层形成，类似临床冠状动脉成表术的病理变化。因此，本模型能在一定程度上较好地模拟人类动脉血管成形术后再狭窄的病理过程，但病变仍缺乏钙化、中央脂质池等人类动脉粥样硬化的典型特点。
7)本发明的实验局限性和将来的方向本发明的实验结果提示在非动脉粥样硬化的髂动脉中，新生内膜形成的降低可能是由于抑制细胞增生和细胞外基质合成的结果，因为这两者在体外均可通过c-myc反义寡核苷酸下调。尽管有上述发现，A-SODN抑制动脉粥样硬化病灶处新生内膜的能力仍有待评价。在球囊损伤之前就存在的转型VSMCs和巨噬细胞可能会改变血管壁对员伤的反应。因此，本发明提供的原则只能揭示c-myc ASODN在产生动脉粥样硬化的环境下对新生内膜的作用(该环境可反映病人再狭窄的病理机制)。另外，血管壁内容物的不同(如纤维成份和钙化)可影响靶点损伤处寡核苷酸的生物分布。在本研究中，用较低的压力注射释放低容量，这就最大限度的限制了与血管壁注射相关的血管损伤，但是不能完全排除。从局部给药的观点来看，确定理想的治疗还需要对不同的球下和支架给药系统，不同体积和性质的聚合物颗粒及其它增加释放效率的新载体间、及不同基因治疗载体间进行仔细地利弊比较。基于这样的实事，即全身给药预防再狭窄失败绝大多数情况是由于生物活性药物局部浓度低，我们相信血管局部给药系统将会发展为用于防治再狭窄的重要医疗设备。无疑这会增加初期介入治疗的费用，但是可获得PTCA远期的良好结果。5.5结论上述结果显示(1)鞋式导管可在体定向局部导入反义寡核苷酸基因药物于动脉损伤的血管壁内，局部导入的药物浓度呈压力依赖性，且可在局部高浓度呈压力依赖性，且可在局部高浓度持续存在24h。
(2)用此方法导入的基因药物c-myc反义寡核苷酸可抑制动脉血管壁损伤后c-myc原癌基因的超常表达，抑制血管平滑肌细胞增生和血管狭窄。
六、参考文献[1]Laurent J.Feldman，Gabriel Steg.Optimal techniques forarterial gene transfer.Cardiovascular Research 1997，35391-404. 陈光慧，赵明清，韩启德等冠状动脉再狭窄的基因治疗。中华心血管病杂志1995；23(3)227. Zhu NL，Wu L，Liu PX，Gordon EM，Anderson WF，Stames VA，HallFl.Downregulation of cyclin G1 expression by retrovirus-mediatedantisense gene transfer inhitits vascular smooth muscle cellproliferation and neointemal formation.Circulation.1997，9628-635. Simons M，Edelman ER，Dekeyser J-L et al.Antisense c-myboligodeoxynucleotides inhibit intimal arterial smooth muscle cellaccumulation in vivo.Nature 1992，35967-80.
权利要求
1.一种鞋式导管在体局部导入基因的方法，其特征在于，至少包括以下步骤第一步采用鞋式导管，先经鞘管内腔送入标准血管成形导管，在靶点血管处，球囊成形后，松球囊，然后将外鞘尖端给药区和PTCA球囊导管一起送至球囊血管成形处，再打起PTCA球囊导管(1.5atm)后，经三通联接管用压力泵经外鞘局部给药于损伤处血管壁；经血管局部导入同位素锝99测定血管局部浓度，评价局部给药的可行性；第二步经鞋式导管在体导入c-myc反义寡核苷酸1)寡核苷酸的合成核苷酸序列选自人的c-myc基因第二外显子中(从4521到4536)的15个核苷酸；c-myc正义核苷酸5’ATGCCCCTCAACGTTc-myc反义核苷酸3’TACGGGGAGTTGCAA用硫代磷酸盐修饰核苷酸，PAGE纯度(摩尔比)99％；2)用苯巴比妥耳缘静脉麻醉(30mg/kg)，常规消毒后，先分离、暴露活体物的右股动脉，作一小切口后，经股动脉放入带有标准血管成形导管(球囊直径3.0mm)的鞋式导管，将导管送至腹主动脉中、下端时，通过压力泵使标准血管成形导管的球囊充盈(6atm)后，强行将其缓慢回撤至切口处，如此反复进行3次；每次30s-60s，造成血管壁内膜损伤，然后松球囊，使之退入鞋式导管鞘内，连同鞋式导管的尖端一并送至髂动脉处，打起球囊(1.5ml)，经鞘管尖端导入c-myc反义寡核苷酸426umol/L 0.5ml后，经三通开关给生理盐水1.5ml，给药时间＜30秒，所用压力为5atm，给药后局部做标记，从切口处结扎股动脉，外科缝合，关闭切口；3)经鞋式导管局部导入基因药物c-myc反义寡核苷酸观察在体表达效应，评价是否能导入基因药物，导入基因药物是否在体表达。
全文摘要
本发明公开了一种用鞋式导管定向在体局部导入基因药物的方法，其特点为定位准确、直接导向心血管靶点、简易、无毒副作用，且可用于临床，该鞋式导管局部导入靶点的药物浓度，在一定范围内呈压力依赖性，且药物可在局部高浓度持续存在至少24小时，在体局部导入的基因药物可抑制体内某些基因的表达，达到防治心血管疾病的作用。如用鞋式导管向损伤的髂动脉壁内定和导入的c－myc反义寡核苷酸可抑制动脉血管壁损伤后c－myc原癌基因的超常表达，抑制血管平滑肌细胞增生和血管狭窄。该鞋式导管定向在体局部导入基因药物的方法，将基因治疗疾病从动物实验走向临床应用的重要手段。
文档编号A61M31/00GK1438047SQ03114560
公开日2003年8月27日 申请日期2003年3月21日 优先权日2003年3月21日
发明者兰燕平 申请人:西安交通大学