专利名称：血管化增强的移植构造物的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于基质组分的血管化增强的组织移植物以及它们修复患病或受损组织的用途。更具体而言，本发明涉及血管化增强的组织移植物，它包括已经用内皮细胞和至少一种附加的预选的外源性细胞群接种的来源于胃粘膜下层或膀胱的基质组分，从而提高组织移植构造物的修复能力。
背景技术：
和概述本发明涉及一种用于修复受损或患病组织的组织移植构造物，它包括用内皮细胞和至少一种附加的预选的外源性细胞群接种的基质组分。本发明所用的基质组分选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物。所述基质组分优选包括高度保守的胶原、糖蛋白、蛋白聚糖、和糖胺聚糖。本发明所用的基质组分来源于温血脊椎动物的膀胱或胃组织。
本发明组织移植构造物的粘膜下层成分基本上是无细胞的基质，提供类似体内基质环境的良好细胞生长基质。基质组分的天然组成和构型提供了一种独特的细胞生长基质，它可促进体外细胞附着和增殖，并在体内植入移植构造物时诱导组织重塑。
作为组织移植材料，膀胱粘膜下层和胃粘膜下层可诱导内源性组织在植入到宿主中后生长(即，移植材料诱导重塑)。当用于这类应用中时，组织移植构造物似乎不仅作为被移植构造物替换的组织的生长或再生长的基质起作用，而且可促进或诱导内源性组织的这种生长或再生长。这些移植材料以可植入片的形式或可注射的流体或凝胶形式使用，从而诱导内源性组织的再生长。
本发明涉及组织移植构造物，它包括选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，此外还包括加入的内皮细胞和至少一种附加的预选的外源性细胞群。本发明还涉及增强组织移植构造物体内血管化的方法。血管化提高的组织移植构造物是在将组织移植构造物植入或注射到宿主中前，通过用内皮细胞或内皮细胞前体(例如，祖细胞或干细胞)和至少一种附加的预选或预定的细胞类型体外接种基质组分而制备的。
其中一个实施方案提供一种用于修复患病或受损组织的组织移植构造物。所述组织移植构造物包括选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，加入的内皮细胞，和至少一种附加的预选的外源性细胞群。
在另一实施方案中，提供血管化的组织移植构造物用于修复患病或受损组织。所述组织移植构造物包括选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，加入的内皮细胞，和至少一种附加的预选的外源性细胞群，其中所述内皮细胞已经在基质组分上培养过一段时间，这段时间足够体外形成血管或血管样结构。
在另一实施方案中，提供一种用于增强组织移植构造物体内血管化的方法。该方法包括用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群外接种选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，从而形成移植构造物，然后将移植构造物植入到脊椎动物中需要修复的部位的步骤。
在另一实施方案中，提供一种用于增强组织移植构造物体内血管化的方法。该方法包括用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群外接种选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，体外培养内皮细胞一段时间，这段时间足够诱导血管或血管样结构或成分的形成，然后将移植构造物植入到脊椎动物中需要修复的部位的步骤。
在这些方法实施方案的任何一个中，可用内皮细胞接种基质组分后，再用附加的预选的细胞群接种基质组分，也可在用内皮细胞接种基质组分前，用附加的预选的细胞群接种基质组分，或用内皮细胞和附加的预选的细胞群同时或近乎同时接种基质组分。
可将内皮细胞在基质组分上体外培养一段时间，这段时间足够诱导血管或血管样结构的形成，或将内皮细胞在基质培养物上培养一段时间，这段时间足够在没有体外形成血管或血管样结构的情况下，使内皮细胞扩增(即，使内皮细胞分裂至少一次)。可选择性地，可在内皮细胞没有扩增的情况下植入移植构造物。在这些实施方案的任何一个中，在植入移植构造物前，附加的预选的细胞群可以扩增或没有扩增(即，允许发展经过至少一个细胞分裂周期)。
在另一实施方案中，提供一种制备用于修复患病或受损组织的组织移植构造物的方法。该方法包括用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群接种选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，从而形成移植构造物的步骤。该方法还可进一步包括在基质组分上体外培养内皮细胞一段时间的步骤，这段时间足够诱导血管或血管样结构的形成。
在这些实施方案的任何一个中，至少一种附加的细胞群包括未角化或角化的上皮细胞群或选自成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、多-潜能祖细胞(例如，干细胞)、周细胞和成骨细胞的中胚层来源的细胞群。在各种实施方案中，可用内皮细胞和一种或多种这些附加的细胞类型接种基质组分(即，可用内皮细胞和这些附加的细胞类型的一种、两种、三种等接种基质组分)。
附图简述
图1提供描述本发明移植构造物的可选的制备方法的流程图。
图2是表示用内皮细胞接种的组织移植物的组织学切片的显微照片。
图3是表示用内皮细胞和3T3细胞接种的组织移植物的组织学切片的显微照片。
发明详述本发明涉及一种组织移植构造物，它包括选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，而且还包括加入的内皮细胞和至少一种附加的预选的外源性细胞群。所述基质组分是用内皮细胞和预选的外源性细胞群接种的，并用于修复患病或受损组织。按照本发明，“受损组织”是指受到损害的、撕裂的、切断的组织，或已经手术除去或以其它方式从需要修复的部位失去的组织(例如，先天缺乏或畸形)。基质组分优选是从来源于选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的组织的胞外基质组分制备的。用于本发明的内皮细胞可来源于任何类型的内皮细胞群，包括大血管、微血管、动脉、和静脉内皮细胞。不论是成熟的内皮细胞(例如，从器官或血管采集的)还是内皮细胞前体(例如，祖细胞或干细胞)都可用于本发明。此外，内皮细胞可从幼年或老年动物中采集，但优选从幼年动物采集的内皮细胞。
在其中一个实施方案中，附加的预选的外源性细胞群可包括未-角化或角化的上皮细胞群或选自成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、多-潜能祖细胞、周细胞、成骨细胞、和任何其它适宜细胞类型的中胚层来源的细胞群。
与基质组分和内皮细胞组合的附加的预选的外源性细胞群可以所要修复组织的细胞类型为基础选择。例如，如果要修复皮肤，预选的外源性细胞群可以是未角化的上皮细胞或如果要修复心脏组织，则预选的外源性细胞群可以是心肌细胞。在另一实施方案中，使用从待治疗患者中分离的自体细胞接种基质组分。
在其中一个实施方案中，与基质组分和内皮细胞组合的至少一种附加的预选的细胞群包括能够分化成平滑肌细胞的平滑肌细胞和/或祖细胞。有利地，平滑肌细胞和/或平滑肌祖细胞可促进(连同内皮细胞)血管或血管样结构在移植构造物中的形成。在另一实施方案中，附加的细胞类型可连同内皮细胞、平滑肌细胞、和/或平滑肌祖细胞一起加入。
在另一实施方案中，至少一种附加的预选的外源性细胞群包括多-潜能祖细胞群。基质组分可诱导这些多-潜能祖细胞分化成帮助受损组织修复的细胞。有利地，可将用内皮细胞群和多-潜能祖细胞群接种的基质组分植入到体内多个不同的部位，且祖细胞将分化成对特殊环境较为适宜的细胞类型。例如，包括内皮细胞和多-潜能祖细胞的组分在腱或韧带部位的植入可导致移植构造物重塑成腱或韧带。
和使用与单独的内皮细胞组合的单独的基质组分，或与除内皮细胞外的细胞类型组合的单独的基质组分作为治疗剂相比，基质组分、内皮细胞、和附加的预选的外源性细胞群的组合所提供的组织移植构造物在体外和/或体内显示出令人吃惊的提高的血管化，从而产生提高的伤口愈合能力和更好的组织功能恢复。
在各实施方案中，可在用内皮细胞接种基质组分后，再用附加的预选的细胞群接种基质组分，也可在用内皮细胞接种基质组分前，用附加的预选的细胞群接种基质组分，或可用内皮细胞和附加的预选的细胞群同时或近乎同时接种基质组分(见图1的各种举例性实施方案)。
在其中一个这样的实施方案中，可用内皮细胞接种基质组分，并在将所述构造物植入到受影响的区域之前，在基质组分上培养内皮细胞一段时间，这段时间足够诱导血管或血管样结构的形成。可在用内皮细胞接种基质组分后以及在将移植构造物体内植入前的任何时间，用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分。因此，根据植入移植构造物前在基质组分上培养预选细胞群的时间的不同，在将移植构造物植入到受影响的区域前，附加的预选的细胞群可以扩增或没有扩增(即，允许发展经过至少一个细胞分裂周期)。
可选择性地，可在用内皮细胞接种基质组分后，用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分，且可在植入移植物前，在基质组分上培养内皮细胞，使内皮细胞扩增，而不会诱导血管或血管样结构或成分的形成。在该实施方案中，根据植入移植构造物前在基质组分上培养预选细胞群时间的不同，在将移植构造物植入到受影响的区域前，附加的预选的细胞群可以扩增或没有扩增。
在另一实施方案中，可在用内皮细胞接种基质组分后，用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分，且在内皮细胞或附加的预选的外源性细胞群没有扩增的情况下，稍后即植入基质组分。
在选择性实施方案中，可用附加的预选的外源性细胞群接种基质组分，并在植入移植构造物前，在基质组分上培养预选的细胞群，从而使预选的细胞群扩增(即，使细胞分裂至少一次)。在该实施方案中，可在用预选细胞群接种基质组分后以及体内植入移植物前的任何时间，用内皮细胞接种基质组分。因此，根据植入移植物前在基质组分上培养内皮细胞时间的不同，在将移植构造物植入到受影响的区域前，内皮细胞可扩增或没有扩增。如果内皮细胞扩增，内皮细胞的扩增可包括或不包括血管或血管样结构的形成。
在另一实施方案中，可在用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分前，用内皮细胞接种基质组分，且在内皮细胞或附加的预选的外源性细胞群没有扩增的情况下，稍后即植入移植物。
在另一实施方案中，可用内皮细胞和附加的预选的外源性细胞群同时或近乎同时接种基质组分。在该实施方案中，可在基质组分上培养内皮细胞和附加的预选的外源性细胞群，从而使两个细胞群扩增，或在两个细胞群没有扩增的情况下植入移植物。如果内皮细胞扩增，则内皮细胞的扩增可包括或不包括血管或血管样结构的形成。
选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分可有利地提供一种生理环境，支持在基质组分上体外培养的细胞的增殖和分化。因此，可将细胞接种在基质组分上，并按照下面所述使用本领域那些普通技术人员已知的标准细胞培养技术培养，从而生产用于植入到需要它的宿主中的组织移植物。
选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分提供支持细胞生长的基质的能力可在植入到宿主中前，提供使内皮细胞群和/或附加的预选的外源性细胞群扩增的机会。如果内皮细胞扩增，则这种扩增可在植入前导致血管或血管-样结构的形成(即，移植构造物的体外潜在的血管化)，从而在植入移植构造物后，立即提高移植物的伤口愈合能力。植入移植构造物前的血管或血管样结构的形成或，可选择性地，植入移植构造物前的内皮细胞扩增可提高植入后的移植物的伤口愈合能力，如通过促进在膀胱或胃粘膜下层组织片近腔(abluminal)侧上生长的细胞的分化和迁移，并通过促进这些细胞在自身粘膜下层组织内的增殖而实现。
植入前，在基质组分上培养加入的内皮细胞和附加的预选的外源性细胞群的实施方案中，细胞是在有利于细胞生长的条件下，在基质组分上培养的。所培养的细胞可与基质组分直接或间接接触(例如，流体连通)。有利于细胞生长的条件是环境条件，如无菌技术、温度(例如，约37℃)和营养供给，这些对于在目前组织和细胞培养所接受的过程下进行的细胞生长而言，被认为是最佳的。虽然最佳培养条件取决于特定的细胞类型，但细胞生长条件通常是本领域熟知的。
本发明的基质组分可以各种形式被用作移植材料，并在植入移植构造物前，用于体外培养内皮细胞和其它细胞类型。这些形式包括片样构型、凝胶形式、流化组分(例如，通过粉碎或消化组织)、和提取物，用于加入本领域-认可的细胞/组织培养基。基质组分或其成分可提供用于细胞粘附的表面和/或可诱导分化和/或增殖。在组织/细胞培养应用中使用之前，优选将基质组分灭菌，然而，如果细胞培养基中包含抗生素的话，也可使用未灭菌的组分。
按照本发明的其中一个实施方案，膀胱或胃粘膜下层的组织移植构造物(其中粘膜下层组织是从肌层和至少粘膜下层组织的粘膜层的腔部分剥离的)被用作移植材料，并在植入移植构造物前，用于体外培养内皮细胞和其它细胞类型。以这种方式剥离的膀胱或胃粘膜下层组织可按照本发明以片的形式、凝胶的形式或作为流化组分，如消化物或提取物的形式使用。
在其中一个实施方案中，植入移植构造物前，在有利于细胞增殖以用于细胞培养的条件下，在膀胱或胃粘膜下层组织片上直接接种细胞。这些组织的多孔性使细胞营养物在基质中扩散。因此，细胞可被接种在膀胱或胃粘膜下层组织片的腔和/或近腔面上并培养。膀胱或胃粘膜下层组织的腔面是面向器官腔的表面，且在体内通常与内粘膜层相邻，而近腔面是远离器官腔的表面，且通常与器官来源中的平滑肌组织接触。
在粘膜下层组织的固体片上培养的细胞显示出不同的生长模式，并根据细胞在粘膜下层片的哪一侧生长，与粘膜下层生长基质的相互作用也不同。在粘膜下层组织片上培养的内皮细胞的组织学检查揭示了接种在近腔面上的内皮细胞不仅沿着粘膜下层组织的表面生长/增殖，而且它们还更容易迁移到粘膜下层组织自身内并增殖。粘膜下层组织的腔面包括较之近腔侧更致密的基质，并因此，细胞不太可能穿透腔面。接种在粘膜下层组织腔面上的细胞与基质粘附，但通常不会穿透基质表面。
在植入移植构造物前接种在基质组分上的内皮细胞和/或附加的预选的外源性细胞群可在有营养物，包括矿物质、氨基酸、糖、肽、蛋白、或糖蛋白、如层连蛋白和纤连蛋白、和/或生长因子如表皮生长因子、血管内皮细胞-衍生的生长因子、血小板-衍生的生长因子、血小板-衍生的生长因子样分子、转化生长因子β、成纤维细胞生长因子、或其它血清生长因子存在的条件下生长。在其中一个实施方案中，流化或粉末形式的基质组分可用于补充标准细胞培养基，从而提高支持并诱导细胞体外增殖的能力，并诱导体内重塑。在有可商业得到的细胞培养液体培养基(含血清或不含血清)存在的条件下，使细胞在基质组分上生长。
在其中一个实施方案中，与基质组分和内皮细胞组合的至少一种附加的预选的细胞群可以是平滑肌细胞和/或能够分化成平滑肌细胞的祖细胞，从而促进(连同内皮细胞)血管或血管样结构在移植构造物中形成。已知用肝素酶处理平滑肌细胞可诱导增殖细胞的表型改变性质。因此，在用内皮细胞和至少一种预选的外源性细胞群，包括平滑肌细胞群和/或平滑肌细胞祖细胞群接种基质组分的实施方案中，肝素酶可包括在细胞培养基中。例如，来源于肝素鞘氨醇杆菌的4个单位/ml的肝素酶可短时间(例如，6小时)包含在培养基中或可持续存在于培养基中。
还已知作为细胞的亚汇合单层被接种在基质上的平滑肌细胞经历与分裂能力相关的表型改变。如果将平滑肌细胞与内皮细胞的汇合单层共同培养，则表型改变被抑制。因此，在用内皮细胞和至少一种预选的外源性细胞群，包括平滑肌细胞群和/或平滑肌细胞祖细胞群接种基质组分的实施方案中，可将加入的内皮细胞接种在基质组分上，从而使细胞与基质组分粘附作为细胞的亚汇合单层。在另一实施方案中，可将内皮细胞、平滑肌细胞、和/或平滑肌祖细胞接种在基质组分上，这样细胞就可与基质组分粘附作为细胞的亚汇合单层。
已经很好地证明了粘膜下层能够在植入后，立即在很多体内微环境(例如，腱、韧带、骨、关节软骨、动脉、和静脉)中诱导宿主组织增殖、重塑和适宜组织结构的再生。用于诱导内源性组织形成的、片形式和流化形式的膀胱和胃粘膜下层组织的使用在美国专利U.S.Nos.5,554,389，6,099,567，和6,264,992中描述并要求保护，其内容引入此处作为参考。因此，本发明的膀胱或胃粘膜下层组织移植物被体内植入，从而诱导需要修复的受损组织重塑。
在其中一个实施方案中，所要求保护的包括基质组分、加入的内皮细胞、和附加的预选的外源性细胞群的组合物可被包封在生物适合性基质中，用于植入到宿主中。包封的基质可被构造成使营养物扩散至包封的细胞，同时使包封细胞的产物从包封的细胞扩散至宿主细胞。用于包封活细胞的适宜的生物相容性聚合物是本领域那些技术人员已知的。例如，聚赖氨酸/藻酸盐包封过程先前已经由F.Lim和A.Sun(Science，Vol.210，pp.908-910)描述。事实上，按照本发明，膀胱或胃粘膜下层本身可被有利地用于包封基质上的细胞，作为人工器官植入。
在其中一个实施方案中，提供一种用于增强组织移植构造物体内血管化的方法。该方法包括下列步骤用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群外接种选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，从而形成移植构造物，并将移植构造物植入到脊椎动物中需要修复的部位。在该方法的其中一个实施方案中，可用内皮细胞接种基质组分，并在将所述构造物植入到受影响区域中前，在基质组分上培养内皮细胞一段时间，这段时间足够诱导血管或血管样结构的形成。在用内皮细胞接种移植物后且在体内植入移植物前的任何时间，可用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分。因此，根据植入移植构造物前在基质组分上培养预选细胞群的时间的不同，在将移植构造物植入到受影响区域中前，附加的预选的细胞群可以扩增或没有扩增。
可选择性地，可在用内皮细胞接种基质组分后，用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分，并在植入移植物前，在基质组分上培养内皮细胞，从而使内皮细胞扩增而不会诱导血管或血管样结构的形成。在该实施方案中，根据植入移植构造物前在基质组分上培养内皮细胞的时间的不同，在将移植构造物植入到受影响区域中前，附加的预选的细胞群可扩增或没有扩增。
在另一实施方案中，可在用内皮细胞接种基质组分后，用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分，且随后即植入移植物，而内皮细胞或附加的预选的外源性细胞群没有扩增。
在本方法的选择性实施方案中，可用附加的预选的外源性细胞群接种基质组分，并在植入移植构造物前，在基质组分上培养预选的细胞群，从而使预选的细胞群扩增。在该实施方案中，可在用预选细胞群接种基质组分后且体内植入移植物前的任何时间，用内皮细胞接种基质组分。因此，根据植入移植物前通过在基质组分上培养细胞而使内皮细胞扩增的时间的不同，在将移植构造物植入到受影响区域之前，内皮细胞可能扩增或没有扩增。如果内皮细胞扩增，则内皮细胞的扩增可能包括或不包括血管或血管样结构的形成。
在另一实施方案中，可在用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分后，用内皮细胞接种基质组分，且可随后即植入移植物，而内皮细胞或附加的预选的外源性细胞群没有扩增。
在另一实施方案中，可用内皮细胞和附加的预选的外源性细胞群同时或近乎同时接种基质组分。在该实施方案中，可在基质组分上培养内皮细胞和附加的预选的外源性细胞群，从而使两种细胞群扩增，或可在两种细胞群没有扩增的情况下植入移植物。如果内皮细胞扩增，则内皮细胞的扩增可包括或不包括血管或血管样结构的形成。
本发明还提供一种用于修复患病或受损组织的血管化组织移植构造物。血管化移植构造物包括选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层、及其提取物和水解产物的基质组分，而且还包括加入的内皮细胞，和至少一种附加的预选的外源性细胞群，其中已经在基质组分上培养内皮细胞一段时间，这段时间足够体外形成血管或血管样结构。
在另一实施方案中，提供一种增强组织移植构造物体内血管化的方法。该方法包括下列步骤用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群接种选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，在基质组分上体外培养内皮细胞和附加的细胞群一段时间，这段时间足够诱导血管或血管样结构的形成，并将移植构造物植入到需要修复部位的脊椎中。
本发明的基质组分可用最初较小的细胞群接种，它们可在植入前体外扩增。有利地，用内皮细胞接种可在基质组分上体外培养内皮细胞后，立即诱导移植物的血管化。此外，还可用平滑肌细胞或平滑肌细胞祖细胞或其它细胞类型，如成纤维细胞接种基质组分，从而促进血管化。
在该实施方案中，用内皮细胞接种基质组分，并在将所述构造物植入到患病区域中前，在基质组分上培养内皮细胞一段时间，这段时间足够诱导血管或血管样结构的形成。在用内皮细胞接种基质组分后且体内植入移植物前的任何时间，用至少一种附加的预选的外源性细胞群接种基质组分。因此，根据植入移植物前，在基质组分上培养预选细胞群时间的不同，在将移植构造物植入到受影响区域中前，附加的预选的细胞群可以扩增或没有扩增。
在选择性实施方案中，可用附加的预选的外源性细胞群接种基质组分，并在植入移植构造物前，在基质组分上培养预选细胞群，从而使预选细胞群扩增。在该实施方案中，用预选细胞群接种基质组分后，再用内皮细胞接种基质组分。在该实施方案中，在将移植构造物植入到受影响区域中前，在基质组分上培养内皮细胞一段时间，这段时间足够使内皮细胞扩增形成血管或血管样结构。
在另一实施方案中，可用内皮细胞和附加的预选的外源性细胞群同时或近乎同时接种基质组分。在该实施方案中，在植入移植物前，在基质组分上培养附加的预选的外源性细胞群和内皮细胞，从而使两种细胞群扩增。
还提供了一种制备用于修复患病或受损组织的组织移植构造物的方法。该方法包括下列步骤用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群接种选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，从而形成移植构造物。该方法还可包括在将移植构造物植入到受影响区域中前，在基质组分上培养内皮细胞一段时间的步骤，这段时间足够诱导血管或血管样结构形成。
例如，用于本发明的膀胱和胃粘膜下层的制备方法在美国专利US.Nos.5,554,389(膀胱粘膜下层)和6,099,567(胃粘膜下层)中描述。总之，粘膜下层组织是从脊椎动物的膀胱或胃制备的，优选从猪、羊或牛采集，但不排除其它物种。在这点上，粘膜下层组织通常是异种的(即，来源于不同物种)，但也可以是同种异体的(即，来源于同一物种的不同的成员)或自体的(即，来源于同一动物或个体)。
在制备用于本发明中的膀胱和胃粘膜下层组织的其中一个方法中，使用纵向擦拭动作摩擦组织，从而除去外层，包括平滑肌组织，和最内层，即至少粘膜的腔部分。因此，粘膜下层组织是从肌层和至少粘膜的腔部分剥离的。在另一实施方案中，膀胱或胃组织可按照在WO01/45765中描述的Spievack的方法制备，其引入此处作为参考。按照该方法，将膀胱或胃组织浸泡在脱上皮溶液，如1N生理盐水中，除去上皮细胞层并留下所有下面邻接的层，包括上皮基底膜。可选择性地，可将膀胱或胃组织浸泡在1N生理盐水中，并经过酶和机械剥离步骤，除去与粘膜下层下面邻接的其它层，或其一部分。这些过程中的任何一个都可产生包括膀胱或胃粘膜下层以及上皮基底膜的制品。
然后用生理盐水冲洗粘膜下层并任选灭菌；它可以水化或脱水状态贮藏。可将冻干或风干的粘膜下层再水化，并用于本发明中而不会损失生物学活性。作为起始材料的天然粘膜下层是相对无细胞的胶原基质，且按照上面所述制备的优选胶原基质是无完整细胞的胶原基质(即，粘膜下层胶原基质组分是无细胞的)。
为形成粘膜下层的多层片，多层粘膜下层可相互重叠。可使用本领域那些技术人员已知的标准技术将各层彼此固定，包括使用缝线和生物相容性粘合剂如胶原粘合糊剂。可选择性地，可在脱水条件下，通过压紧重叠区而将各层融合在一起，任选加热，如美国专利US No.5,711,969所述，其内容引入此处作为参考。
脊椎动物膀胱或胃粘膜下层可使用常规灭菌技术灭菌，包括戊二醛鞣制、酸性pH下的甲醛鞣制、环氧乙烷处理、环氧丙烷处理、等离子气体灭菌、γ射线照射、电子束和过乙酸灭菌。优选的灭菌技术包括使粘膜下层组织暴露于过乙酸、1-4 Mrads γ射线照射(更优选1-2.5 Mrads γ射线照射)或等离子气体灭菌；过乙酸灭菌是最优选的灭菌方法。通常，粘膜下层组织经过两个或更多灭菌过程。将粘膜下层组织灭菌后，例如通过化学处理，可使用电子束或γ射线照射灭菌技术将所述组织再次灭菌。通常，在将移植物灭菌后，将细胞加入到移植组织中。还可使用在美国专利US No.6,206,931中描述的灭菌技术，其引入此处作为参考。按照本发明，在植入移植构造物前，灭菌的膀胱或胃粘膜下层可用于体外培养内皮细胞和预选细胞群。
还已知脊椎动物膀胱或胃粘膜下层可通过粉碎和/或酶消化而被流化，且不会损失它的生物学活性。见美国专利US No.6,264,992 B1，其内容引入此处作为参考。更具体而言，可用酶处理天然或流化的粘膜下层组分一段时间，这段时间足够溶解粘膜下层成分的全部或大部分。优选，用可水解粘膜下层结构成分的酶消化粘膜下层，从而产生粘膜下层成分的混悬液或均匀溶液。粘膜下层可用蛋白酶(例如，胶原酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶)、糖胺聚糖酶或蛋白酶与糖胺聚糖酶的组合进行酶处理。任选地，可单独使用其它适宜的酶，或与蛋白酶和糖胺聚糖酶联合使用。可任选过滤组织消化物，从而提供部分溶解的粘膜下层的均匀溶液。
流化粘膜下层的粘度可通过控制粘膜下层成分的浓度及水化程度而操纵。可将粘度调节至25℃下的约2-约300,000cps。更高粘度的制品，例如，凝胶，可通过透析消化的物质，然后调节这种溶液的pH至约5.0-约9.0而由粘膜下层消化液制备。
膀胱或胃粘膜下层还可以是提取物的形式。例如，粘膜下层组织提取物的制备在PCT申请No.PCT/US97/22721中描述，其在1998年6月18日作为WO98/25964公开，其内容引入此处作为参考。简单的说，4℃下，将膀胱或胃粘膜下层搅拌混悬在提取缓冲液(见实施例1)中约24小时。4℃下，以12,000xg离心提取混合物约30分钟并收集上清液。然后用提取缓冲液洗涤不溶性物质，并重复离心步骤，将洗涤液与最初的上清液混合。用去离子水充分透析上清液(MWCO约3500)，以12,000xg离心透析液。上清液可立即使用或冷冻干燥贮藏。膀胱或胃粘膜下层的流化和凝胶形式以及这些粘膜下层组织的提取物可保留生物活性剂，如生长因子，包括转化生长因子(TGF)β、TGFβ-相关蛋白以及成纤维细胞生长因子。流化形式或凝胶形式的膀胱或胃粘膜下层组织，提取物，或粉末可用于在植入本发明的移植构造物前，体外培养内皮细胞和预选细胞群。
本发明还考虑了粉末形式粘膜下层的使用。在其中一个实施方案中，粉末形式的粘膜下层是通过在液氮下粉碎粘膜下层，从而产生0.1-1mm2大小的颗粒而制备的。然后将颗粒状组分冷冻干燥过夜并灭菌，形成固体、基本无水的颗粒状复合物。可选择性地，可通过将粉碎粘膜下层的混悬液或溶液干燥而从流化的粘膜下层而形成粉末形式的粘膜下层。
实施例1膀胱和胃粘膜下层组分的制备膀胱粘膜下层的制备膀胱粘膜下层是从当地肉食加工厂的猪的膀胱制备的。冲洗切除下来的膀胱至没有内含物，翻过来并通过机械剥离除去粘膜表层。将组织恢复至其原始方向，并除去外肌肉层。将所制备的膀胱切开，在水中充分冲洗，从而溶解与粘膜下层基质有关的任何细胞，并除去细胞降解产物。
可选择性地，可按照Spievack在WO01/45765中描述的方法制备保留有粘膜下层和上皮基底膜的膀胱组织，其引入此处作为参考。按照本方法，保留上皮基底膜的膀胱粘膜下层组织可通过将组织浸泡在脱上皮溶液，如1N生理盐水中而制备。在另一实施方案中，可将膀胱组织浸泡在1N生理盐水中，并经过酶和机械剥离步骤除去与粘膜下层下面邻接的其它层，或其一部分。这些过程中的任何一个都可产生包括膀胱或胃粘膜下层以及上皮基底膜的制品。
如下所述，这种制品用于本发明的移植构造物中。在制备流化或凝胶形式的膀胱粘膜下层或膀胱粘膜下层的提取物时，通常冲洗后立即首先将膀胱粘膜下层冷冻在液氮中，并在-80℃贮藏。将冷冻组织切成1cm3，用工业搅拌器在液氮下粉碎成小于2mm2的颗粒，使用前在-80℃下贮藏。流化或凝胶形式的膀胱粘膜下层和膀胱粘膜下层的提取物的制备在下面描述。
胃粘膜下层组织的制备首先通过在胃上它们各自的入口和出口点横切食管和小肠而取出猪的胃。除去胃近腔面上任何多余的肠系膜组织或脂肪，并排空胃的内含物，通过用流动的自来水冲洗而除去胃内部的任何剩余残留物。然后将胃外翻，从而使胃的内(腔)表面暴露出来，并切断食管末端的括约肌和形成胃出口点的括约肌远端。通常是剩下完整的胃，然而还可在除去无用组织前切下胃并弄平。使用钝的器械或止血钳磨擦胃的腔面，从而取出胃内层，包括至少粘膜的腔部分。再次外翻胃组织，从而将胃的腔表面恢复到移植构造物的内部。然后在外部肌纤维层进行切开小的切口。之后从粘膜下层组织机械或酶剥离肌肉层。剩余组织的颜色是略带粉色的白色。可选择性地，保留了上皮基底膜的胃粘膜下层组织可按照上面讨论的Spievack等人描述的方法制备。
在制备胃组织的过程中，要注意通过定期用水浸泡组织而维持组织的水化。用流动的自来水冲洗胃粘膜下层组织大约2小时，从而除去所有血液或松散的组织碎片。冲洗后，组织应当显白色，但如果组织的颜色保持粉色，则在水下摩擦组织直达组织显白色。冲洗完全后，通过用手或机械钵圈攥住组织而除去多余的水份。这种制品用于本发明的移植构造物中。对于制备流化或凝胶形式的胃粘膜下层或胃粘膜下层提取物而言，通常首先在液氮中冷冻组织，并在-80℃下的液氮中贮藏。将冷冻组织切成1cm3，用工业搅拌器在液氮下粉碎至小于2mm2的颗粒，使用前在-80℃贮藏。胃粘膜下层的流化或凝胶形式和胃粘膜下层提取物的制备在下面描述。
流化的膀胱或胃粘膜下层的制备粉碎材料的部分消化是通过将5g粉末状组织加入到100ml含有溶于0.5M醋酸中的0.1％胃蛋白酶的溶液中，并在4℃下消化72小时而进行的。部分消化后，4℃下12,000rpm离心混悬液20分钟，弃去不溶性颗粒。4℃下，多次更换0.01M醋酸而透析上清液(MWCO3500)。通过向透析水解产物中加入氯仿(5ml氯仿加入900ml 0.01M醋酸)而将溶液灭菌。额外更换两次无菌的0.01M醋酸而继续透析水解产物，从而除去氯仿。然后将透析包的内含物无菌转移到无菌容器中。4℃下贮藏所得的流化组分。
膀胱和胃粘膜下层凝胶组分的制备为了制备凝胶形式的膀胱或胃粘膜下层，将8ml流化粘膜下层与1.2ml 10xPBS缓冲液(含5mg/L酚红的10x磷酸盐缓冲生理盐水)混合；加入0.04N HCl(约1.6ml)调节pH至6.6-7.4，然后加入0.05NNaOH(约1.2ml)，改变pH至＞8。用水将终体积调节至12ml。
膀胱或胃粘膜下层提取物的制备用于这些研究的提取缓冲液包括4M胍、2M尿素、2M MgCl2和2MNaCl，每个都是在50mM Tris-HCl，pH7.4中制备的。4℃下，将膀胱或胃粘膜下层的粉末混悬在提取缓冲液(25％w/v)中，所述提取缓冲液包含均为1mM的苯甲基磺基氟化物、N-乙基马来酰亚胺、和苄脒(蛋白酶抑制剂)，用力搅拌24小时。然后在4℃下，12,000xg离心提取混合物30分钟，并收集上清液。在提取缓冲液中简单洗涤不溶性物质，离心，并将洗涤液与原始上清液混合。在Spectrapor管(MWCO3500，Spectrum Medical Industries，Los Angeles，CA)中，用30个体积的去离子水充分透析上清液(72小时更换9次)。12,000xg离心透析液除去所有不溶性物质，立即使用上清液或冻干贮藏。
实施例2内皮细胞的生长膀胱或胃粘膜下层是按照上面所述从新安乐死的猪采集并制备的。经由各种技术(γ射线照射、过乙酸等)灭菌后，将组织夹在聚丙烯框架内，产生平坦的表面区域(50mm2)用于细胞生长。将框架浸没在组织培养基中，使培养基营养物进入膀胱或胃粘膜下层组织的表面。将内皮细胞和平滑肌细胞(3×104个细胞/组织切片)接种在粘膜下层组织上，然后放在37℃的5％CO2、95％空气的培养箱中。各个时间周期后，将接种的膀胱或胃粘膜下层组织固定在10％中性缓冲福尔马林中，包埋在石蜡中，并切片(6μm)。进行各种组织学和免疫组织化学染色过程，从而确定细胞生长特性。利用这些过程观察血管或血管样结构。
实施例3内皮细胞的生长膀胱粘膜下层是按照上面所述从新安乐死的猪采集并制备的。经由各种技术(γ射线照射、过乙酸等)灭菌后，将组织夹在聚丙烯框架内，产生平坦的表面区域(50mm2)用于细胞生长。将框架浸没在组织培养基中，使培养基营养物进入膀胱或胃粘膜下层组织的表面。将人微血管内皮细胞接种在膀胱粘膜下层的其中一个表面上，将3T3细胞接种在另一表面上(两种细胞类型均以1×106个细胞/组织切片接种)，然后将组织切片放在37℃的5％CO2、95％空气的培养箱中。生长7天后，将接种的膀胱粘膜下层组织固定在10％中性缓冲福尔马林中，包埋在石蜡中，并切片(6μm)。进行各种组织学和免疫组织化学染色过程，从而确定细胞生长特性。如图2所示，在没有任何其它细胞类型存在的条件下，单独接种在膀胱粘膜下层上的内皮细胞在不侵入基质的情况下在膀胱粘膜下层上生长。如图3所示，当在相反的表面上接种3T3细胞时，细胞侵入基质并形成血管或血管样结构。这些结果表明，当内皮细胞在有其它细胞类型存在的条件下，在移植材料上生长时，内皮细胞形成血管或血管样结构的能力增强了。
权利要求
1.一种用于修复患病或受损组织的组织移植构造物，所述组织移植构造物包括选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，加入的内皮细胞，以及至少一种附加的预选的外源性细胞群。
2.根据权利要求1所述的移植构造物，其中所述至少一种附加的细胞群包括选自角化上皮细胞、未角化上皮细胞、和中胚层来源细胞的细胞群。
3.根据权利要求1所述的移植构造物，其中所述至少一种附加的细胞群包括平滑肌细胞群。
4.根据权利要求1所述的移植构造物，其中所述至少一种附加的细胞群包括平滑肌细胞祖细胞群。
5.根据权利要求1所述的移植构造物，其中所述膀胱或胃粘膜下层组织是从肌层和至少所述粘膜下层组织的粘膜层的腔部分剥离的。
6.根据权利要求1所述的移植构造物，它还包括肝素酶。
7.根据权利要求1所述的移植构造物，它还包括选自血管内皮细胞-衍生的生长因子、血小板-衍生的生长因子、血小板-衍生的生长因子样分子、转化生长因子β、和血清生长因子的生长因子。
8.根据权利要求1所述的移植构造物，其中用内皮细胞接种基质组分后，再用附加的预选的细胞群接种基质组分。
9.根据权利要求1所述的移植构造物，其中用附加的预选的细胞群接种基质组分后，再用内皮细胞接种基质组分。
10.根据权利要求1所述的移植构造物，其中用内皮细胞和附加的预选的细胞群同时或近乎同时接种基质组分。
11.一种用于提高组织移植构造物的体内血管化的方法，所述方法包括下列步骤用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群外接种选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，以形成移植构造物；并将所述移植构造物植入到脊椎动物中需要修复的部位。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种附加的细胞群包括选自角化上皮细胞、未角化上皮细胞、和中胚层-来源细胞的细胞群。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种附加的细胞群包括平滑肌细胞群。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种附加的细胞群包含平滑肌细胞祖细胞群。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述膀胱或胃粘膜下层组织是从肌层和至少所述粘膜下层组织的粘膜层的腔部分剥离的。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述移植构造物还包括肝素酶。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述移植构造物还包括选自血管内皮细胞-衍生的生长因子、血小板-衍生的生长因子、血小板-衍生的生长因子样分子、转化生长因子β、和血清生长因子的生长因子。
18.根据权利要求11所述的方法，进一步包括在所述基质组分上培养所述内皮细胞一段时间的步骤，这段时间足够在将所述移植构造物植入到脊椎动物中之前形成血管或血管样结构。
19.根据权利要求11所述的方法，其中用内皮细胞接种基质组分后，再用附加的预选的细胞群接种基质组分。
20.根据权利要求11所述的方法，其中用附加的预选的细胞群接种基质组分后，再用内皮细胞接种基质组分。
21.根据权利要求11所述的方法，其中用内皮细胞和附加的预选的细胞群同时或近乎同时接种基质组分。
22.根据权利要求18所述的方法，其中用内皮细胞接种基质组分后，再用附加的预选的细胞群接种基质组分。
23.根据权利要求18所述的方法，其中用附加的预选的细胞群接种基质组分后，再用内皮细胞接种基质组分。
24.根据权利要求18所述的方法，其中用内皮细胞和附加的预选的细胞群同时接种基质组分。
25.根据权利要求19、20或21任何一项所述的方法，其中在植入移植构造物前，内皮细胞或附加的预选的细胞群均没有扩增。
26.根据权利要求19、20或21任何一项所述的方法，进一步包括以下步骤在基质组分上培养内皮细胞一段时间，这段时间足够使内皮细胞在没有体外形成血管或血管样结构的情况下扩增，并在基质组分上培养附加的预选的细胞群一段时间，这段时间足够在将移植构造物植入到脊椎动物中之前，使附加的预选的细胞群扩增。
27.根据权利要求19、20或21任何一项所述的方法，进一步包括在基质组分上培养内皮细胞一段时间的步骤，这段时间足够使内皮细胞在没有体外形成血管或血管样结构的情况下扩增。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述附加的预选的细胞群在植入移植构造物前没有扩增。
29.根据权利要求19、20或21任何一项所述的方法，进一步包括在基质组分上培养附加的预选的细胞群一段时间的步骤，这段时间足够在植入移植构造物前，使预选的细胞群扩增。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述内皮细胞在植入移植构造物前没有扩增。
31.根据权利要求22、23或24任何一项所述的方法，其中所述附加的预选的细胞群在植入移植构造物前扩增。
32.根据权利要求22、23或24任何一项所述的方法，其中所述附加的预选的细胞群在植入移植构造物前没有扩增。
33.一种制备用于修复患病或受损组织的组织移植构造物的方法，所述方法包括用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群外接种选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分的步骤。
34.根据权利要求33所述的方法，进一步包括在将所述移植构造物植入到脊椎动物中之前，在所述基质组分上培养所述内皮细胞一段时间的步骤，这段时间足够体外形成血管或血管样结构。
35.一种用于增强移植构造物的体内血管化的方法，所述方法包括下列步骤用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源性细胞群外接种选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分；在所述基质组分上体外培养所述内皮细胞一段时间，这段时间足够诱导血管或血管样结构的形成；并将所述移植构造物植入到脊椎动物中需要修复的部位。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述至少一种附加的细胞群包括选自角化上皮细胞、未角化上皮细胞、和中胚层-衍生细胞的细胞群。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述至少一种附加的细胞群包括平滑肌细胞群。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述至少一种附加的细胞群包括平滑肌细胞祖细胞群。
39.根据权利要求35所述的方法，其中用内皮细胞接种基质组分后，再用附加的预选的细胞群接种基质组分。
40.根据权利要求35所述的方法，其中用附加的预选的细胞群接种基质组分后，再用内皮细胞接种基质组分。
41.根据权利要求35所述的方法，其中用内皮细胞和附加的预选的细胞群同时接种基质组分。
42.一种用于修复患病或受损组织的血管化组织移植构造物，所述组织移植构造物包括选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，加入的内皮细胞，以及至少一种附加的预选的外源性细胞群，其中所述内皮细胞已经在所述基质组分上培养过一段时间，这段时间足够体外形成血管或血管样结构。
43.一种用于修复患病或受损组织的具有血管样结构的组织移植构造物，所述组织移植构造物包括选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，加入的内皮细胞，以及至少一种附加的预选的外源性细胞群，其中所述附加的细胞群可增强所述血管样结构在所述移植构造物中形成的开始。
44.一种制备用于修复患病或受损组织的具有血管样结构的组织移植构造物的方法，所述方法包括用内皮细胞群和至少一种附加的预选的外源细胞群外接种选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的步骤，其中所述附加的细胞群可增强所述血管样结构在所述移植构造物中形成的开始。
45.一种治疗患者中患病或受损组织的方法，包括使用权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、42或43任何一项所述的组织移植构造物修复患病或受损组织。
全文摘要
提供一种用于修复患病或受损组织的组织移植构造物。所述组织移植构造物包括选自膀胱粘膜下层和胃粘膜下层，及其提取物和水解产物的基质组分，加入的内皮细胞，以及可增强血管－样结构在移植构造物中形成开始的至少一种附加的预选的外源性细胞群。预选的细胞群可以是未－角化或角化的上皮细胞群或选自成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、多－潜能祖细胞、周细胞、成骨细胞、和任何其它适宜细胞类型的中胚层来源的细胞群，优选以所修复组织为基础选择的细胞群。还提供了用于增强这些组织移植构造物的体内血管化和用于制备这些移植构造物的方法。
文档编号A61L27/00GK1684589SQ03815472
公开日2005年10月19日 申请日期2003年5月1日 优先权日2002年5月2日
发明者S·F·巴戴拉克 申请人:普渡研究基金会